Methodenartikel

Verwendung von Autometallography zu lokalisieren und semi-Quantifizierung Silber im Wal Gewebe

DOI:

10.3791/58232

⸱

4. Oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Molecular and Comparative Pathobiology, National Taiwan University, 2School of Veterinary Medicine, National Taiwan University, 3Department of Oceanography and Asia-Pacific Ocean Research Center, National Sun Yat-sen University, 4Graduate Institute of Veterinary Pathobiology, National Chung Hsing University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Protokoll wird zum Ag in Wale Leber und Niere Geweben zu lokalisieren von Autometallography präsentiert. Darüber hinaus ist ein neue Assay, benannt die Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) entwickelt, um die Ag-Konzentrationen in den Geweben zu schätzen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silber-Nanopartikel (AgNPs) wurden ausgiebig in kommerziellen Produkten, einschließlich Textilien, Kosmetika und Gesundheitswesen Elemente aufgrund ihrer starken antimikrobiellen Wirkung eingesetzt. Sie auch in die Umwelt freigesetzt werden und reichern sich in den Ozean. Daher AgNPs sind die Hauptquelle der Ag Kontamination und Sensibilisierung der Umwelttoxizität von Ag steigt. Frühere Studien haben die Bioakkumulation (in Produzenten) und Vergrößerung (in Verbraucher/Raubtiere) der Ag gezeigt. Wale und Delfine, können als Spitzenprädatoren des Ozeans, negativ von der Ag/Ag-Verbindungen betroffen sind. Obwohl die Konzentrationen von Ag/Ag-Verbindungen in Wale Gewebe durch Massenspektroskopie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-MS) gemessen werden können, ist der Einsatz von ICP-MS durch die hohen Investitionskosten und die Forderung nach Gewebe Lagerung/Vorbereitung begrenzt. Daher, eine Autometallography (AMG) Methode mit einer quantitativen Bildanalyse mit Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe möglicherweise eine adjuvante Methode Ag Vertrieb Ebene Unterorgan zu lokalisieren und schätzen die Ag-Konzentration im Wal Gewebe. Die positiven Signale von AMG sind vor allem braun bis schwarz Granulate in verschiedenen Größen im Zytoplasma der proximalen renale tubuläre Epithel, Hepatozyten und Kupffer Zellen. Gelegentlich sind einige amorphen goldgelb bis braun AMG positive Signale in das Lumen und Basalmembran von einigen proximalen Nierentubuli zur Kenntnis genommen. Der Assay für die Schätzung der Konzentration Ag ist die Cetacean histologischen Ag Assay (CHAA), benannt, die ein Regressionsmodell festgelegten Daten aus quantitativen Bildanalyse der AMG-Methode und ICP-MS ist. Die Verwendung von AMG mit CHAA lokalisieren und semi-Quantifizierung Schwermetalle bietet eine bequeme Methode für räumlich-zeitliche und Cross-Arten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silber-Nanopartikel (AgNPs) wurden ausgiebig in kommerziellen Produkten, einschließlich Textilien, Kosmetika und Gesundheitswesen Elemente, aufgrund ihrer großen antimikrobiell1,2eingesetzt. Daher sind die Herstellung von AgNPs und die Anzahl der Psychopharmakologie-haltigen Arzneimitteln über Zeit3,4erhöht. Jedoch AgNPs in die Umwelt freigesetzt werden und reichern sich in den Ozean5,6. Sie sind die wichtigste Quelle der Verunreinigung Ag geworden, und das öffentliche Bewusstsein für die ökologische Toxizität der Ag steigt.

Der Status des AgNPs und der Ag in der Meeresumwelt ist kompliziert und verändert sich ständig. Früheren Studien ergaben, dass AgNPs bleiben kann, wie Partikel, Aggregat, auflösen, mit verschiedenen chemischen Spezies reagieren oder vom Ag+ -Ionen7,8regeneriert werden. Verschiedene Arten von Ag-Verbindungen, wie AgCl, wurden in marinen Sedimenten gefunden, wo sie können von benthischen Organismen aufgenommen werden und geben Sie die Nahrungskette9,10. Nach einer früheren Studie in der Chi-Ku-Lagune entlang der südwestlichen Küste von Taiwan Ag-Konzentrationen von marinen Sedimenten sind extrem niedrig und ähnlich wie die Erdkruste Fülle und denen der Fisch Leber Gewebe sind in der Regel unter den Nachweis begrenzen Sie (< 0,025 μg/g nass/nass)11. Frühere Studien, die in verschiedenen Ländern haben jedoch relativ hohe Ag-Konzentrationen in den Lebern von Walen12,13gezeigt. Die Ag-Konzentration in den Lebern von Walen ist altersabhängig, was darauf hindeutet, dass die Quelle AG in ihrem Körper am ehesten ihre Beute12. Diese Ergebnisse weiter deuten die Biomagnifikation Ag bei Tieren auf höheren trophischen Ebenen. Wale und Delfine, können als Spitzenprädatoren in den Ozean negative gesundheitliche Auswirkungen der Ag/Ag Verbindungen12,13,14erlitten haben. Am wichtigsten ist, wie Wale sind Menschen Säugetiere und die negativen gesundheitlichen Auswirkungen der Ag/Ag-Verbindungen in Walen auch beim Menschen auftreten können. Mit anderen Worten könnte Wale Sentinel Tiere für die Gesundheit der Meeresumwelt und der Menschen. Daher sind die Auswirkungen auf die Gesundheit, die Gewebeverteilung und Konzentration der Ag in Wale von großer Bedeutung.

Obwohl die Konzentrationen von Ag/Ag-Verbindungen in Wale Gewebe durch Massenspektroskopie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-MS) gemessen werden können, ist der Einsatz von ICP-MS durch seine hohe Kapitalkosten (Instrument und Wartung) und die Anforderungen für die Lagerung von Gewebe begrenzt. Definition-12,-15. Darüber hinaus ist es in der Regel schwierig, umfassende Gewebeproben bei allen Untersuchungen der gestrandete Wale Fälle aufgrund logistischer Schwierigkeiten, ein Mangel an Arbeitskräften und ein Mangel an verwandte Ressourcen12zu sammeln. Die gefrorene Gewebeproben für ICP-MS-Analyse liegen nicht einfach aus Platzgründen begrenzt Kältetechnik und gefrorene Gewebeproben können aufgrund der gebrochenen Kältetechnik Anlagen12verworfen werden. Diese vorgenannten Hindernisse erschweren Untersuchungen der Kontamination in Wale Geweben von ICP-MS-Analyse mit gefrorene Gewebeproben. Im Gegensatz dazu Formalin fixiert Gewebeproben sind relativ einfach, während der Autopsie der Toten-Stranded Wale zu sammeln. Daher ist es notwendig, eine benutzerfreundliche und kostengünstige Methode, um erkennen/Schwermetalle in Wale Geweben Messen mit Formalin fixiert Gewebeproben zu entwickeln.

Obwohl die Unterorgan Distributionen und Konzentrationen von Alkali- und Alkali-Erden-Metalle während der Formalin fixiert verändert werden können, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Prozess, nur weniger Auswirkungen auf die Übergangsmetalle wie Ag, wurden bekannte16. Daher galt als ideale Probe Ressource für Metall Lokalisierung und Messungen16,17FFPE Gewebe. Autometallography (AMG), eine histochemische Prozess können Schwermetalle als variabel Größe goldgelb bis schwarz AMG positive Signale auf FFPE Gewebe Abschnitte zu verstärken, und diese verstärkt Schwermetalle unter Lichtmikroskopie18, visualisiert werden 19 , 20 , 21. daher die AMG-Methode informiert über die Unterorgan Verteilungen von Schwermetallen. Es kann wichtige zusätzliche Informationen für das Studium der Stoffwechselwege von Schwermetallen in biologischen Systemen, weil ICP-MS nur, die Konzentration von Schwermetallen an der Orgel Level18 messen könnenbieten. Darüber hinaus hat die Quantitative Analyse der histologischen Gewebe Abschnitte22,23digitale Bildanalyse-Software, wie z. B. ImageJ, zugewiesen. Variabel-Größe goldgelb bis schwarz AMG positive Signale der FFPE Gewebe Abschnitte kann quantifiziert und verwendet, um die Konzentrationen von Schwermetallen zu schätzen. Obwohl die absolute Konzentration Ag direkt nach der AMG-Methode mit quantitativen Bildanalyse bestimmt werden kann, kann es geschätzt werden durch ein Regressionsmodell, basierend auf den Daten aus der quantitativen Bildanalyse und ICP-MS, die Cetacean benannt ist histologischen Ag-Assay (CHAA). Angesichts der Schwierigkeiten bei der Messung der Ag-Konzentrationen durch ICP-MS-Analyse in die meisten gestrandeten Walen, CHAA ist eine wertvolle adjuvante Methode zur Ag-Konzentrationen im Wal Gewebe zu schätzen, die von ICP-MS-Analyse aufgrund der fehlenden nicht ermittelbar eingefroren Gewebeproben. Dieses Papier beschreibt das Protokoll einer histochemische Technik (AMG-Methode) zur Lokalisierung Ag auf Unterorgan Ebene und ein Test namens CHAA, die Ag-Konzentrationen in der Leber und Niere Gewebe von Walen zu schätzen.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Flussdiagramm Darstellung der Einrichtung und Anwendung der Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) für die Schätzung der Konzentration Ag. CHAA = Wal histologischen Ag-Assay, Proteinkinase = Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten, ICP-MS = induktiv gekoppelten Plasma Massenspektroskopie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie wurde nach internationalen Richtlinien durchgeführt und die Verwendung von Cetacean Gewebeproben durfte durch den Rat der Landwirtschaft von Taiwan (Forschung erlauben 104-07.1-SB-62).

(1) Gewebe Probenvorbereitung für ICP-MS-Analyse

Hinweis: Die Leber und Niere Gewebe wurden gesammelt von frisch Tote und mäßig Autolysierte gestrandete Wale24, darunter 6 gestrandete Wale und Delfine von 4 verschiedenen Arten, 1 Grampus früh (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis Hosei (Lh), 1 Stenella Attenuata (Sa). Jede gestrandeten Wal hatte eine Feldnummer für individuelle Kennung. Die Gewebe-Probenvorbereitung für ICP-MS-Analyse folgte die Methode M.H. Chens Lab gegründet, und M.H. Chen Labor durchgeführt der ICP-MS-Analyse11,13,25.

  1. Leber und Niere Gewebe für ICP-MS-Analyse von gestrandeten Walen zu sammeln und bei −20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
  2. Sammeln Sie paar passende Leber und Niere Gewebe aus dem gleichen gestrandeten Walen für AMG-Analyse (siehe Schritt 2).
  3. Schneiden Sie die äußere Schicht der Gewebeproben für ICP-MS-Analyse mit einem Edelstahl-Skalpell gesammelt. Schneiden Sie den inneren Teil der Gewebeproben in kleine Würfel (ca. 1 cm3) und legen Sie sie in Zip-Lock Beutel aus Kunststoff. Normalerweise enthält jede Tasche 10 g der Gewebe.
  4. Speichern Sie die Plastiktüten mit Gewebeproben −20 ° C für nachfolgende Verfahren.
  5. Setzen Sie die 1 cm3 Würfel, die Proben in ein Einfrieren System (-50 ° C, Vakuumpumpe mit einem Hubraum von mindestens 98 L/min, 0.002 mBar) für mindestens 72 Stunden bis zum Trocknen vollständig getrocknet durch wiegen auf die Konstante.
  6. Die getrockneten Würfel zu Pulver mit einem Homogenisator für nachfolgende Gewebe Verdauung zu homogenisieren.
  7. Wiegen Sie 0,3 g homogenisierte gefriergetrocknet Proben in 30 mL Polytetrafluorethylen (PTFE) Flaschen und mischen sie mit 10 mL Salpetersäure 65 % w/w.
  8. Die PTFE-Flaschen anziehen Sie Verschlüsse, aber lassen Sie die Verschlüsse aufdreht.
    Hinweis: Dadurch den braunen Rauch in der PTFE-Flaschen und Reflux zu bilden in der Flasche für die Verdauung bis braunen Rauch verschwindet und wird klar.
  9. Erwärmen Sie die verdauten Proben mit einer Heizplatte von 30 ° C bis 110/120 ° C (nach der braunen Rauch bilden Zustand) in der PTFE-Flaschen für 2 bis 3 Wochen bis bräunliche Gas in den Flaschen PTFE farblos wird und die Flüssigkeit in der PTFE-Flaschen durchscheinend Gree wird Nish blass gelb oder ganz klar.
    Hinweis: Führen Sie den Erwärmungsprozess in chemischen Dampfhaube.
  10. Erhitzen Sie die verdauten Proben bei 120 ° C zu verdampfen der Salpetersäure in der PTFE-Flaschen bis nur 0,5-1 mL bleibt.
    Hinweis: Durchführen Sie der Aufheizvorgang in einem chemischen Abzug, und immer überwachen Sie die Temperaturerhöhung um sicherzustellen, dass keine bräunliche Gas aus der PTFE-Flaschen-Verschlüsse entweicht.
  11. Ziehen Sie die Verschlüsse und kühlen sie bei Raumtemperatur für ca. 1 h.
  12. Stelle den Trichter mit Filter Papiere auf 25 mL Volumetrische Fläschchen und waschen die restliche Flüssigkeit mit 1 M Druckaufschluss3 zu einem Endvolumen von 25 mL.
    Anmerkung: Waschen Sie die Flasche für mindestens dreimal und die Schließung zweimal.
  13. Überprüfen Sie die analytische Qualität der ICP-MS-Analyse mithilfe der standard-Referenz-Materialien, einschließlich DOLT-2 (Dogfish Leber) und Wohnheim-2 (Dogfish Muskel).
  14. Verwenden Sie Duplikate jeder analytische Probe und Triplicates von standard Referenzmaterialien für ICP-MS-Analyse.
  15. Im Durchschnitt der Ag-Konzentrationen von jedem analytischen Proben und präsentieren der Daten als Trockengewicht Grundlage Konzentration (μg/g Trockengewicht).

(2) Gewebe Probenvorbereitung für die AMG-Analyse

  1. Paar passende Leber und Niere Gewebe für AMG Analyse von einem gestrandeten Wal zu sammeln und bis zum Gebrauch in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren.
    Hinweis: Bewahren Sie die Gewebeproben in Plastikflaschen in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF, pH 7.0) für 24 bis 48 Stunden. Das Volumen der NBF sollte mindestens 10-mal größer als die Gewebevolumens.
  2. Trimmen Sie der Formalin fixiert Leber und Niere Gewebe mit Einweg-Mikrotom Klingen aus rostfreiem Stahl und die getrimmten Gewebeschnitte in Kassetten mit Etiketten.
    Hinweis: Die Größe der einzelnen Gewebeschnitte sollte ca. 2 cm x 1 cm und die Dicke der einzelnen Gewebe sollte höchstens 3 mm. Legen Sie die Leber und Niere Gewebe von der gleichen Person in der gleichen Kassette.
  3. Austrocknen der getrimmte Gewebe Abschnitte mit einem Gewebe-Prozessor durch eine Reihe von abgestuften Ethanol (70 % für 1 h, 80 % für 1 h, 95 % 1 h, 95 % für 2 h, 100 % für 1 h x 2 Färbung Gerichte und 100 % für 2 h), nicht-Xylol (für 1 h und 2 h in verschiedenen befleckenden Gerichte) , und Tauchen Sie die dehydrierte Gewebeproben in Paraffin (für 1 h und 2 h in verschiedenen befleckenden Gerichten).
  4. Legen Sie die dehydrierte Gewebeproben in den Böden von Stahl Histologie Formen und Betten Sie dehydrierte Gewebeproben mit Paraffin ein.
  5. Kühlen Sie die Formalin Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe Blöcke auf kalte Platte fest, bis das Paraffin erstarrt. Schneiden Sie die Proteinkinase-Blöcke mit Mikrotom, bis die Gewebeoberfläche ausgesetzt ist.
  6. Entspannen Sie die Proteinkinase Blöcke −20 ° C für 10 min. Abschnitt die Proteinkinase-Blöcke bei 5 µm Mikrotom.
  7. Füllen Sie ein Wasserbad mit bidestilliertem Wasser bei 45 ° C. Heben Sie die Bänder von Gewebeschnitten und machen sie auf der Oberfläche des warmen Wassers Schwimmen mit Pinzette und Pinsel.
  8. Trennen Sie die Bänder der Gewebeschnitte mit einer Pinzette. Legen Sie einen Abschnitt auf einen Objektträger.
  9. Legen Sie den Objektträger auf einer Folie wärmer und lassen Sie Abschnitte über Nacht trocknen bei 37 ° C.
  10. Setzen Sie den Objektträger in Folie-Racks und deparaffinize sie durch Einweichen in 3 verschiedenen befleckenden Gerichte der reine nicht-Xylol (ca. 200 bis 250 mL) für 8, 5 und 3 min.
  11. Hydrat die Gewebeschnitte in Folie-Racks durch Einweichen in verschiedenen befleckenden Gerichten abgestufte Ethanol Lösungen (100 % Äthanol zweimal, einmal 90 % Ethanol und 80 % Ethanol einmal [1 min]), und spülen Sie sie in bidestilliertem Wasser.
    Hinweis: Diese Lösungen sind etwa 200 bis 250 mL in verschiedenen befleckenden Gerichten. Bei jedem Waschgang reicht 30 sec.
  12. Das Gewebe in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % Triton x-100, Waschen mit PBS für mehrere Male Abschnitten, und spülen Sie sie dann in bidestilliertem Wasser spülen.
    Hinweis: Diese Lösungen sind etwa 200 bis 250 mL in verschiedenen befleckenden Gerichten. Für jeden war, reicht 30 sec.
  13. Bereiten Sie gleiche Mengen der drei Komponenten (Initiator, Moderator und Aktivator) zur Verfügung gestellt vom Silber Erweiterung Kit in Dunkelheit und mischen Sie gründlich.
    Hinweis: Die Lösungen der Moderator und Aktivator sind klebrig, so benutzen Sie bitte pipette mit Breite Spitze Öffnungen (oder schneiden Sie die Tipps für größere Öffnungen zu erstellen). Für jede Folie ist in der Regel genug 300 μL der gemischten Lösung (abhängig von der Größe des Abschnitts Gewebe). Wenn 10 Folien verwendet werden, also die Menge der einzelnen Komponenten (Initiator, Moderator und Aktivator) 1000 μL (gemischte Lösung ist 3000 μl für 10 Folien).
  14. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte in der gemischten Lösung für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Decken Sie vollständig die Gewebeschnitte auf den Folien mit der gemischten Lösung. Eine längere Inkubationszeit kann zu falsch-positiven AMG Signale führen.
  15. Der Objektträger mit bidestilliertem Wasser waschen und Färben sie in Hämatoxylin für 10 s als eine gegenfärbung.
  16. Der Objektträger mit fließendem Leitungswasser waschen, abtrocknen und mit Eindeckmittel zu montieren.
  17. Untersuchen Sie die Folien unter einem Lichtmikroskop.
  18. Nach dem Zufallsprinzip erfassen Sie zehn histologische Bilder mit einem 40 X Objektiv von jedem Gewebe Abschnitt mithilfe einer angeschlossenen Digitalkameras mit Bildbearbeitungssoftware Computer.

(3) Semi-Quantitative Analyse für AMG Positive Werte der histologische Bilder

Hinweis: AMG positiver Wert bedeutet den Prozentsatz des Bereichs mit AMG positive Signale.

  1. Die histologische Bilder analysieren mittels Bildanalyse-Software (ImageJ).
  2. Das histologische Bild durch Drücken Datei öffnen | Offene.
  3. Das ausgewählte Bild in drei Farbkanäle (rot, blau und grün) aufgeteilt, durch Drücken der Bild | Typ | RGB-Stack.
  4. Quantifizieren Sie die AMG positive Signale mit den Blau-Kanal. Nukleare falsche positive Signale sind in der Regel unter den blauen Kanal verringert, wenn Hämatoxylin Fleck für nukleare gegenfärbung (Abbildung 2) angewendet wird.
  5. Messen Sie den Prozentsatz des Bereichs mit AMG positive Signale in jeder histologischen Bild mit dem Schwellenwert-Werkzeug (Bild | Anpassen | Schwelle).
  6. Manuell anpassen der Grenzwert des Schwellenwerts für jedes histologischen Bild (von 90 bis 110) basierend auf das Vorhandensein der falschen positive Bereiche in Kerne und/oder roten Blutkörperchen.
    Hinweis: In Verzug zu setzen, sollte die AMG positive Signale in rot hervorgehoben werden.
  7. Presse analysieren | Legen Sie Messungen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich Bruchteil angeben, dass der Bereich Bruchteil erfasst wird.
  8. Presse analysieren | Maßnahme. Die positive Prozent Bereich jedes histologischen Bildes wird in der Spalte % Bereich des Ergebnisfensters angezeigt.
  9. Im Durchschnitt die positive prozentuale Bereiche 10 histologische Bilder von jedem Gewebe-Abschnitt und definieren Sie das Ergebnis als der AMG positive Wert für jeden Abschnitt des Gewebes.

figure-protocol-1
Abbildung 2: das Vorhandensein von nuklearen falsche positive Signale unter verschiedenen Farbkanäle (gegenfärbung: Hämatoxylin Fleck). Repräsentative nuklearen falsche positive Signale sind durch gelbe Pfeile angedeutet. PPA = positiven Prozentwert der Bereiche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Einrichtung der Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) durch Regressionsmodell

Hinweis: Die folgende Analyse wird im Prisma 6.01 für Windows durchgeführt.

  1. Die Korrelation zwischen den Ergebnissen der ICP-MS und AMG positive Werte zu bewerten.
  2. Öffnen Sie die Software, erstellen Sie eine neue Projektdatei enthält, und wählen Sie XY und Korrelation.
  3. Input-Daten einschließlich der Ergebnisse der ICP-MS und AMG positive Werte.
  4. Presseschau und Korrelation zu wählen, unter der Kategorie XY-Analyse , die Stärke der Verbindung zwischen den Ergebnissen der ICP-MS und AMG bei positiven Werten von Pearson Korrelationsanalyse zu analysieren.
    Hinweis: Die Ergebnisse der ICP-MS und AMG positive Werte müssen positiv miteinander korreliert werden. Andernfalls sollten die nachfolgenden Regressionsmodell nicht entwickelt werden.
  5. Vergleichen Sie statistisch die Regressionsmodelle, einschließlich lineare Regression, quadratische Regression, kubische Regression und lineare Regression über Origin, durch Statistiken Software12,26,27.
    Hinweis: Wenn das Regressionsmodell eine unrealistische Ag Konzentration erzeugt, sollte das Regressionsmodell verlassenen12sein.
  6. Zurück in der Datentabelle (links) und Presseschau | Nicht-lineare Regression (Kurvenanpassung) unter der Kategorie XY Analyse | "OK".
  7. Im Fenster Parameter: nicht-lineare Regression, wählen Sie verschiedene Regressionsmodell in der Seite passen und dann vergleichen verschiedene Regressionsmodelle auf der Seite vergleichen.
  8. Wählen Sie auf der Seite vergleichendie Vergleichsmethoden, einschließlich der Summe der Quadrate extra F-Test und Akaikes Information Kriterium (AIC). Verwenden Sie nach den Ergebnissen der Vergleichsmethoden eine relativ angemessene Regressionsmodell in der CHAA.
  9. Schätzen Sie Ag-Konzentrationen der Wale Leber und Niere Gewebe mit unbekannten Ag Konzentrationen mithilfe der CHAA.
  10. Die Genauigkeit und Präzision von CHAA für Leber und Niere Gewebe zu bewerten. Der Unterschied zwischen Präzision und Genauigkeit ist in Abbildung 3dargestellt.
  11. Genauigkeit: Berechnen Sie die mittlere Standardabweichung (SD) aus den Unterschieden zwischen bekannten und geschätzten Ag-Konzentrationen.
  12. Präzision: Führen Sie wiederholte Messung (mindestens dreifacher) AMG positive Werte von Schnittserien aus dem gleichen FFPE-Gewebe. Berechnen Sie den Mittelwert SD der Messungen von Leber oder Niere Gewebe aus Unterschieden zwischen bekannten und geschätzten Ag-Konzentrationen
    Hinweis: Die Methoden zur Bewertung der Genauigkeit und Präzision sind in Abbildung 4dargestellt.

figure-protocol-2
Abbildung 3: der Unterschied zwischen Genauigkeit und Präzision. Genauigkeit bedeutet, wie nah die Messung an den wahren Wert (d. h. Ag Konzentration bestimmt durch ICP-MS); Präzision bedeutet die Reproduzierbarkeit der Messung (d. h., die Konsistenz zwischen der wiederholten Messungen von AMG positive Werte von dreifacher Gewebeschnitte). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-protocol-3
Abbildung 4: das Schema, die Darstellung der Methoden zur Bewertung der Genauigkeit und Präzision. CHAA = Wal histologischen Ag Assay; Proteinkinase = Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten; ICP-MS = induktiv gekoppelten Plasma Massenspektroskopie; AI = jeweils der Ag Konzentrationen bestimmt durch ICP-MS von jedem Paar abgestimmt Gewebeprobe; BI = jeweils der Ag Konzentrationen geschätzt von CHAA jedes Paar abgestimmt Gewebeprobe; CI, Di und Ei = jeweils der Ag-Konzentrationen geschätzt von CHAA dreifacher Proben aus jedem Paar abgestimmt Gewebeprobe; Ich = 1 bis n. Finden Sie die Rohdaten der Genauigkeit und Präzision Tests im Bereich der repräsentative Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

5. Abschätzung der Ag-Konzentrationen von CHAA.

  1. Die Leber und Niere Gewebe von gestrandeten Walen zu sammeln und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren.
  2. Das Formalin fixiert Gewebe routinemäßig zu verarbeiten (siehe Schritt 2).
  3. Die Ag-Konzentrationen der Wale Leber und Niere Gewebe mit unbekannten Ag-Konzentrationen von CHAA zu schätzen (siehe Schritte 3 und 4).

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Ergebnisse

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Repräsentative Bilder der AMG positive Signale in den Wal Geweben Leber und Niere sind in Abbildung 5dargestellt. Die AMG positive Signale sind variabel große braune bis schwarze Granulate in verschiedenen Größen im Zytoplasma der proximalen renale tubuläre Epithel, Hepatozyten und Kupffer Zellen. Gelegentlich sind amorphe goldgelb bis braun AMG positive Signale in das Lumen und Basalmembran von einigen proximalen Nierentubuli zur Kenntnis genommen. Es gibt e...

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Diskussion

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Der Zweck der Artikel Studie soll eine adjuvante Methode, Ag Quantil Unterorgan Ebenen und Ag-Konzentrationen im Gewebe Wale abzuschätzen. Die aktuellen Protokolle umfassen (1) Ermittlung der Ag-Konzentrationen in Wale Geweben von ICP-MS, (2) AMG Analyse von paar abgestimmt Gewebeproben mit bekannten Ag Konzentrationen (3) Einrichtung des Regressionsmodells (CHAA) für die Schätzung der Ag-Konzentrationen von AMG positive Werte, 4) Bewertung der Genauigkeit und Präzision von CHAA und 5) Schätzung der Ag-Konzentrationen vo...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Taiwan Cetacean Verseilung Netzwerk für Probenentnahme und Lagerung, einschließlich der Taiwan Cetacean Society, Taipei; Das Cetacean Research Laboratory (Prof. Lien-Siang Chou), das Institut für Ökologie und Evolutionsbiologie, National Taiwan University, Taipei; das National Museum of Natural Science (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; und die Meeresbiologie und Cetacean Research Center, National Cheng-Kung University. Wir danken auch der Forestry Bureau, Rat für Landwirtschaft, Exekutiv-Yuan für ihre Genehmigung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HQ Silber VerbesserungskitNanosonden# 2012
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006Paraffin
100% EthanolMuto Pure Chemical Co., Ltd4026
Nicht-XylolMuto Pure Chemical Co., Ltd4328
Silan beschichteter ObjektträgerMuto Pure Chemical Co., Ltd511614
Deckglas (25 x 50 mm)Muto Pure Chemical Co., Ltd24501
MalinolMuto Pure Chemical Co., Ltd20092
GM Hämatoxylin-FärbungMuto Pure Chemical Co., Ltd3008-1
10% neutrale gepufferte FormalinlösungChin I Pao Co., Ltd---
Spitze (1000 μ L)MDBio, Inc.1000
PIPETMAN Classic P1000Gilson, Inc.
15 ml ZentrifugenröhrchenGeneDireX, Inc.PC115-0500
DornhaileberResearch Council of CanadaDOLT-2
DornhaimuskelNational Research Council of CanadaDORM-2
Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS)PerkinElmer Inc.PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6 Liter GefriertrocknungssystemLabconco7752030Für die Gefriertrocknung
MARKE® SILBERBRAND MesskolbenMerckZ326283
30 mL Standardfläschchen, flacher Innenraum mit 33 mm VerschlussSavillex Corporation200-030-12Für die Diagestion
Salpetersäure, superpur®, 65,0%Merck1.00441Für die Diagestion
Heizplatte/RührerCorning®PC-220Für die Diagestion
High-Shear-LabormischerSilversonSL2TFür die Homogenisierung
Steriles Probengefäß aus Polypropylen (250 ml)Thermo Scientific™6186L05Für die Homogenisierung
DigitalkameraNikon CorporationDS-Fi2
LichtmikroskopNikon CorporationECLIPSE Ni-U
Shandon™ Finesse&Handel; 325 manuelles MikrotomThermo Scientific™
Accu-Cut® SRM&Handel; 200 rotierendes MikrotomSakura1429
Mikrotom-Klinge S35FEATHER®207500000
Objektträger-Färbeschale und -abdeckungBrain Research Laboratories#3215
Färbegestell aus StahlBrain Research Laboratories#3003
Shandon EinbettungszentrumThermo Scientific & trade;S-EC
Shandon Citadel® Tissue-VerarbeiterThermo Scientific™
DiawärmerLab-Line Instruments26005
WasserbadShandon Capshaw3964
FilterpapierMerck1541-070
Prism 6.01 für WindowsGraphPad SoftwareStatistiksoftware
ImageJNational Institutes of Health
Edelstahl GewebeeinbettungsformShenyang Roundfin Trade Co., LtdRD-TBM003Für Paraffin-Emedding
F123602 National A78100001H69800003

Referenzen

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Silber NanopartikelSchwermetalllokalisationquantitative BildanalyseFormalin fixierte Paraffin eingebetteteMassenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasmahistologischer Silber AssayGewebeverarbeitungLichtmikroskopie

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