Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.
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Methodenartikel
Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die vorgestellte Methode soll zeigen, zum ersten Mal die Transplantation von Neugeborenen Thymi in die vorderen Auge Kammer isogenen Erwachsener Mäuse für in Vivo längs Echtzeit-Überwachung der Thymocytes´ Dynamik innerhalb einer vaskularisierte Thymus-Segment. Nach der Transplantation kann Laser-scanning-Mikroskopie (LSM) durch die Hornhaut in Vivo nicht-invasive wiederholte Bildgebung auf zelluläre Auflösung Ebene. Wichtig ist, verleiht der Ansatz vorherigen intravitalen T-Zell-Reifung imaging-Modelle die Möglichkeit für die kontinuierliche Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg-Aufnahmen im gleichen Tier. Weitere Vorteile des Systems sind die Transparenz der transplantierten Bereich makroskopische schnelle Überwachung des implantierten Gewebes, bei schönem und der Zugriff auf das Implantat, so dass für lokalisierte neben systemischen Behandlungen. Die Haupteinschränkung wird das Volumen des Gewebes, das passt im reduzierten Raum der Auge Kammer die Forderungen nach Lappen trimmen. Orgel-Integrität wird maximiert durch Sezieren Thymus Lappen in den Mustern, die zuvor gezeigt, dass funktional für Reife T-Zell-Produktion. Die Technik eignet sich möglicherweise um ein Milieu der medizinisch relevanten Fragen im Zusammenhang mit Thymus-Funktion zu verhören, die Autoimmunität, Immunschwäche und zentrale Toleranz enthalten; Prozesse, die mechanisch schlecht definierten bleiben. Die feinere Zerlegung des Mechanismen führen Thymocyte Migration, Differenzierung und Auswahl sollte für neue therapeutische Strategien zielen entwickelnde T-Zellen führen.
Einleitung
Intrathymic T-Zell-Differenzierung und T-Zell Subpopulation Auswahl bilden wichtige Prozesse für die Entwicklung und Wartung von zellvermittelte Immunität in Wirbeltieren1. Dieser Prozess beinhaltet eine komplexe Abfolge von straff organisierten Veranstaltungen, einschließlich der Rekrutierung von Vorfahren aus Blut, Zell-Proliferation und Migration, differentielle Expression der Membranproteine und massive programmierten Zelltod für Teilmengen Auswahl. Das Ergebnis ist die Freisetzung von Reifen T-Zellen reagiert auf eine ausreichend Bandbreite an fremde Antigene während der Anzeige minimierter Antworten auf selbst-Peptide, welche enden besied....
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Protokoll
Die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Miami genehmigt die Experimente nach IACUC Richtlinien.
1. Isolierung und Trimmen des Neugeborenen Thymi
- Bereiten Sie alle Reagenzien und Instrumente durch Autoklavieren oder andere Methoden, sterile Bedingungen zu gewährleisten.
- Um Verunreinigungen zu minimieren, führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter einem Laminar-Flow-Haube.
- Füllen Sie vor euthanizing Spender Mäuse einen sterile 60 Millimeter-Teller mit sterilen prechilled 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und auf Eis. Es wird zum Spülen und speicher....
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Ergebnisse
Thymus von Neugeborenen Mäusen wurden isoliert von B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas Mäuse wie in diesem Protokoll (Schritte 1.1-1.9) beschrieben. In diesen transgenen Mäusen leitet Huhn Beta-Actin Promotor den Ausdruck der roten fluoreszierenden Proteins Variante DsRed. MST unter dem Einfluss von unmittelbaren frühen Enhancer Cytomegalovirus (CMV) Erleichterung der Verfolgung von Implantaten.
Zu verhindern Gewebe Able.......
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Diskussion
Aufgrund der Bedeutung der T-Zell-Reifung für individuelle immun-Kompetenz4 und die mutmaßlichen Auswirkungen der Vorläufer Zelldynamik auf Reifen T-Zellen produziert die Thymusdrüse2,3wurden umfangreiche Bemühungen investiert Alternativen zu den klassischen fixierte Gewebe Snapshot Ansatz zu entwickeln.
Obwohl Gewebe Scheiben und andere Explantaten deutlich überlegen bei der Reproduktion Gewebearchitektur als M.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-Stipendien R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) und R21ES025673 (AC) und durch die besten/2015/043-Bewilligung (Consellería de Educació, Cultura ich Esport, Generalitat Valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Autoren danken dem SENT-Team an der Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien und Alberto Hernandez am Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Isofluoran-Verdampfer mit Isofluoran | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Präparierendoskop mit Lichtquelle | Zeiss | Stemi 305 | |
| Feine Dissektionszange | WPI | 500455 | |
| Zange mit mittlerer Dissektion | WPI | 501252 | |
| Feine Dissektionszange mit gebogener Spitze | WPI | 15917 | |
| Vannas Schere | WPI | 503371 | |
| Präparierschere | WPI | 503243 | |
| Skalpell | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G Nadeln | BD | 304622 | |
| Einweg-Transferpipette | Thermofisher | 201C | |
| Wärmekissen und Wärmelampe | Kent Scientific Corp | Infrarot | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile Schale | SIGMA | CLS430166 | |
| Steril 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile | Tücher Kimberly-Clark | LD004 | |
| Medikamente zur Schmerzbehandlung | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Kochsalzlösung oder Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomikroskop | Leica | MZ FLIII | |
| Kopfhalter Adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gasmaske | Narishige | GM-4_S | |
| Konfokalmikroskop | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar-Flow-Haube | Telstar | BIO IIA |
Referenzen
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
