Methodenartikel

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

DOI:

10.3791/58237

⸱

14. Juni 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.

Zusammenfassung

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CRISPR/Cas9 Technologie beschleunigt sich Genom-Technik in vielen Zelltypen, aber so weit gen Lieferung und stabile gentechnische Veränderung im primären NK-Zellen herausfordernd gewesen. Transgen-Lieferung mit Lentivirale oder retrovirale Transduktion führte beispielsweise in einer begrenzten Ausbeute von gentechnisch NK-Zellen durch erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptose. Wir beschreiben hier eine DNA-freie Methode für Genom-Bearbeitung von menschlichen Grund- und erweiterten NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Diese Methode erlaubt effiziente ko von TGFBR2 und HPRT1 Gene in NK-Zellen. RT-PCR-Daten zeigten eine signifikante Abnahme der Gen-Expression-Ebene, und ein Zytotoxizität Assay eines repräsentativen Zelle Produkts vorgeschlagen, dass die RNP-modifizierte NK-Zellen weniger empfindlich auf TGFβ wurde. Genetisch veränderte Zellen möglicherweise erweiterte Post-Elektroporation durch Stimulation mit bestrahlten mbIL21 exprimierenden Feeder-Zellen.

Einleitung

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Krebs-Immuntherapie wurde in den letzten Jahren vorgebracht worden. Genetisch veränderte chimeric Antigen-Rezeptor (Auto)-T-Zellen sind ein hervorragendes Beispiel von veränderter Immunzellen erfolgreich in Krebsimmuntherapie eingesetzt. Diese Zellen wurden vor kurzem genehmigt durch die FDA für die Behandlung gegen CD19 + B-Zell-Tumoren, aber Erfolg ist bisher beschränkt sich auf Krankheiten, die mit ein paar Aktionsleisten Antigene und targeting so begrenzten Antigen Repertoire ist anfällig für Fehler durch immun Flucht. Darüber hinaus haben Auto-T-Zellen auf die Verwendung von autologen T-Zellen wegen der Gefahr der Graft - Versus - Host-Seuche verursacht durch allogenen T-Zellen konzentriert. Im Gegensatz dazu, NK-Zellen sind in der Lage, Tumor Zielen auf ein Antigen-unabhängige Weise zu töten und verursachen keine GvHD, wodurch sie einen guten Kandidat für Krebs Immuntherapie6,7,8,9.

CRISPR/Cas9 Technologie wurde vor kurzem in engineering Immunzellen verwendet, aber genetisch Umprogrammierung NK-Zellen mit Plasmiden seit jeher schwierig. Dies wurde aufgrund von Schwierigkeiten bei Transgen Lieferung in einer DNA-abhängigen Weise wie Lentivirale und retrovirale Transduktion verursacht erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptosis und der begrenzten Produktion gentechnisch NK-Zellen-4 , 9.

Viele angeborene immune Zellen express hohes Maß an Rezeptoren für Pathogen-assoziierte molekulare Muster wie Retinoic Säure-induzierbaren gen ich (RIG-ich), die es ermöglichen erhöhte Anerkennung von Fremd-DNA. Unterdrückung dieser Wege hat höhere Effizienz der Transduktion in NK-Zellen aktiviert, bei Verwendung von DNA-basierten Methoden für gentechnische Veränderung10.

Hier beschreiben wir die Methode für die Verwendung einer DNA-freie-Genom-Bearbeitung von primären und erweiterten menschlichen NK-Zellen unter Verwendung Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs besteht aus drei Komponenten, rekombinante Cas9 Protein komplexiert mit synthetischen Single-Guide RNA, bestehend aus einem komplexierten CrRNA und TracerRNA. Diese Cas9/RNPs sind in der Lage Spalten genomische Ziele mit einem höheren Wirkungsgrad im Vergleich zu ausländischen DNA-abhängige Ansätze aufgrund ihrer Lieferung als funktionelle komplexe. Darüber hinaus kann schnelle Abfertigung von Cas9/RNPs aus den Zellen der Ziel-Effekte wie Induktion der Apoptose reduzieren. So dienen sie Durchbrüche oder Knock-ins für homologe Rekombination6,7in Kombination mit DNA zu erzeugen. Wir haben gezeigt, dass Elektroporation von Cas9/RNPs ist eine einfache und relativ effiziente Methode, die die bisherigen Einschränkungen der gentechnischen Veränderung in NK-Zellen überwindet.

TGFβ ist eine große immunsuppressive Cytokine, die die Aktivierung und Funktionen von NK-Zellen hemmt. Es wurde vermutet, dass targeting TGFβ Weg Immunzelle Funktionen erhöhen kann. Wir gezielt die Region Codierung TGBR2 ektodomäne die bindet TGFβ11. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen einen deutlichen Rückgang der Ebene der mRNA Expression dieses Gens und weiteren zeigen, dass die veränderten NK-Zellen gegen TGFβ resistent geworden. Darüber hinaus behalten die veränderten Zellen Lebensfähigkeit und proliferative Potential, wie sie in der Lage, erweiterte Post-Elektroporation mit bestrahlten Feeder-Zellen. Daher die folgende Methode ist ein vielversprechender Ansatz zur NK-Zellen genetisch manipulieren, für jeden weiteren klinischen oder wissenschaftliche Zwecke.

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Protokoll

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Gesunden Spenders buffy Coats wurden als Quellenmaterial aus dem Central Ohio Region amerikanischen Roten Kreuz erhalten. Diese Forschung war entschlossen, ausgenommen Forschung werden durch die institutionelle Review Board der bundesweit Kinderkrankenhaus.

1. menschliche NK Zelle Reinigung und Ausbau

  1. PBMCs von Buffy Coat12isolieren.
    1. 35 mL buffy Coat Probe auf 15 mL Ficoll-Paque Schicht.
    2. Zentrifugieren bei 400 X g für 20 Minuten ohne Bremse und sammeln die PBMC aus der Schnittstelle.
    3. Die wiederhergestellten PBMCs dreimal durch Zugabe von mindestens ein gleiches Volumen an PBS waschen, waschen Sie für 5 Minuten bei 400 X g zentrifugieren und Absaugen der PBC. NK-Zellen kann in diesem Stadium von RosettesSep13isoliert werden.
  2. Erweitern von NK-Zellen durch die Stimulierung mit bestrahlten 10 x 106 mbIL21 exprimierenden Feeder-Zellen am Tag 0, 7 und 14. Ersetzen Sie Medien mit frischen RPMI mit 10 % FBS, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 100 IU/mL von Il-2 für die gesamte Medienlautstärke jeden zweiten Tag.

2. gRNA Design und Auswahl

  1. Wählen Sie die spezifische genomic Loci Ziel mit online-Tools, z. B. NCBI, Ensemble.
    Beispiel.
    Beschreibung: Transforming Wachstumsfaktor-Beta-Rezeptor 2 (TGFBRR2) ektodomäne
    Datensatz anzeigen: PF08917
    InterPro anzeigen: IPR015013
    Position: 49 157 aa
    Gezielte Abfolge: Exon 4 des TGFBR2-Gen (ENSG00000163513)
  2. Um die gRNAs zu entwerfen, nutzen Sie CRISPR-Design-Web-Tools wie http://crispr.mit.edu und "Benchling."
    1. Geben Sie in die DNA-Sequenz in Schritt 2.1ausgewählt. Wählen Sie Menschen (hg 19) als ein Ziel-Genom. CRISPR-Führer (20 Nukleotiden gefolgt von einer PAM-Sequenz: NGG) wird aus der zuvor eingegebene Sequenz gescannt werden. Es zeigt auch mögliche Ziel Übereinstimmungen in den ausgewählten Genom.
    2. Wählen Sie die besten drei gRNAs, die die höchste Punktzahl, basierend auf ihre Ziel- und Ziel-Preise haben. Tabelle 1 zeigt beispielsweise der gestalteten CRISPR-RNAs auf Exon 4 des TGFBR2-Gen vorgeschlagen von CRISPR-Design-Web-Tools.
  3. Reihenfolge der CRISPR-RNAs als synthetische Sequenz-spezifische CrRNAs.
  4. Bestellen Sie eine erhaltene transactivating RNA (TracrRNA) durch partiellen Homologie mit dem CrRNA zu interagieren.

3. Design löschen Screening-Primer

  1. Design-Primer überspannt die gRNA spaltstellen für T7E1 Mutation Assay.
  2. Einsatz Primer mindestens 100 bp Weg von den vorhergesagten spaltstelle kleine einfügen-Löschung (Indels) an der SgRNA-Ziel-Site sicherzustellen wird auf 1,5 % Agarosegel nach der Mutation Assay angezeigt. Tabelle 2 zeigt die Primer, die verwendet werden, um die TGFBR2 ektodomäne zu verstärken.

(4) Transduktion von menschlichen Grund- und erweiterten NK-Zellen

Hinweis: Transduktion von Cas9/RNPs Elemente in NK erfolgt durch Elektroporation mit 4D System wie folgt.

  1. Zelle Vorbereitung
    1. Für primäre NK-Zellen, 4 Tage frisch isolierte NK-Zellen in RPMI Medium in Anwesenheit von 100 IE/mL von Il-2 inkubieren und führen die Elektroporation an Tag 5. Ersetzen Sie die Medien täglich, wie zuvor und am Vortag Transduktion beschrieben.
    2. Für erweiterte NK-Zellen, stimulieren die Zellen am Tag 0 mit bestrahlten Feeder-Zellen in einem Verhältnis von 1:1 und die Elektroporation am Tag 5 oder 6 oder 7 durchführen. Ersetzen Sie die Medien täglich, wie zuvor und am Vortag Transduktion beschrieben.
    3. Am Tag der Elektroporation bereiten Sie ein T25-Fläschchen gefüllt mit 8 mL frisches RPMI, enthält 100 IE/mL von Il-2 für Zellen Electroporation und Pre incubate Fläschchen in einem befeuchteten 37 ° C und 5 % CO2 Inkubator.
      Hinweis: Aufgetauten Zellen oder Zellen, die 2Nd oder 3rd Stimulation durchlaufen haben können elektroporiert jederzeit nach ihrer Genesung wie beschrieben werden.
    4. Nehmen Sie 3 bis 4 × 106 Zellen pro Bedingung für 26 µL Transduktion Mix.
      Hinweis: Sehr hoher Konzentration von NK-Zellen in Elektroporation Lösung verbessert die Transduktion Rate.
    5. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS, alle FBS zu entfernen die häufigsten RNase Aktivität enthält. Drehen sie jedes Mal bei 300 X g für 8 Minuten.
      Hinweis: Betrachten Sie 7 Elektroporation Bedingungen für Cas/RNPs als einzigen gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) und eine Kombination von zwei gRNAs (gRNA1 gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + gRNA3) und ein Steuerelement mit keine Cas9/RNPs.
  2. Bilden die CrRNA:tracerRNA / Komplex
    1. CrRNAs (gRNA1, gRNA2 und gRNA3) und TracerRNA in 1 x TE Lösung Endkonzentrationen von 200 μM aufzuwirbeln. Mix-2.2 μL von jeweils 200 μM gRNA mit 200 μM TracerRNA wie in Tabelle 3dargestellt.
    2. Erwärmen Sie die Proben bei 95 ° C für 5 min und auf den Tisch auf Raumtemperatur (15-25 ° C) abkühlen lassen. Shop Nukleinsäuretablette RNAs und CrRNA: TracerRNA/Komplex bei-20 ° C für die spätere Verwendung.
  3. Bilden Sie die RNP-Komplex
    Hinweis:     um Zeit zu sparen, bilden komplexe während des Waschens RNP Schritt 4.1.5.
    1. Verdünnen Sie für einzelne CrRNA:tracrRNA duplex Reaktion Cas9 Endonuklease, 36 μM wie im Beispiel in Tabelle 4gezeigt.
    2. Für Kombination Transduktion von CrRNA:tracrRNA Maisonetten, verdünnen Cas9 Endonuklease, 36 μM, wie im Beispiel gezeigt Tabelle 5.
    3. Hinzufügen Cas9 Endonuklease CrRNA:tracrRNA Duplex langsam während der wirbelnden PIPETTENSPITZE, über 30 s bis 1 Minute.
    4. Inkubieren Sie die Mischung bei 15-20 min bei Raumtemperatur. Wenn nicht bereit, die Mischung nach der Inkubation zu verwenden, halten Sie die Mischung auf dem Eis bis zur Verwendung.
  4. Elektroporation
    1. Die gesamte Ergänzung der Elektroporation Lösung P3 hinzufügen und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
    2. Aufschwemmen der Zelle Pellet (3 bis 4 × 106 Zellen aus Schritt 4.1.5) in 20 μL der P3 primäre 4D Elektroporation Lösung. Vermeiden Sie Luftblasen beim pipettieren.
      Hinweis: die Zellen sollten nicht für eine lange Zeit in P3 Lösung überlassen werden.
    3. Sofort fügen Sie 5 µL der RNP Komplex (Schritt 4.3 hinzu), die Zellsuspension.
    4. Mischen Sie 1 μL von 100 μM Cas9 Elektroporation Enhancer an die Cas9/RNPs/Zelle hinzufügen.
    5. Cas9/RNPs/Zelle Mischung in 20 μL Elektroporation Streifen zu übertragen.
    6. Klopfen Sie leicht die Streifen um sicherzustellen, dass die Stichprobe die Unterseite der Streifen umfasst.
    7. Starten Sie 4D Elektroporation System und wählen Sie das EN-138 -Programm.

5. Post Transduktion

  1. Lassen Sie die Zellen in den Streifen 3 Minuten ruhen.
  2. Die Küvette 80 µL der Pre äquilibriert Kultur Medien hinzu und übertragen Sie sanft die Probe in Flaschen.
  3. 48 Stunden nach Transduktion, Auszug genomischen DNA aus 5 × 105 Zellen für die Gen-Deletionen screening.
  4. Verstärken Sie das Gen des Interesses unter Verwendung der Zündkapseln in Schritt 3.2 mit Taq-DNA-Polymerase-Kits entwickelt.
  5. PCR-Amplifikate Heteroduplexes für die T7EI Verdauung zu bilden und das Produkt für 30-60 Minuten mit einem T7EI Enzym in 37 ° c inkubieren
    Hinweis: Die T7EI, die Probe wird bevorzugt für das screening, wie es ist schnell, einfach und bietet reinigen Elektrophorese Ergebnisse im Vergleich zur Verwendung von Surveyor-Assay. Aber diese Methode kann nicht erkennen, Einfügungen und Löschungen von < 2 Basen, die durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) Aktivität in Cas9 RNPs Experimente14generiert werden.
  6. Führen Sie die verdaute DNA auf 1,5 % Agarosegel bei 110 V für 30-45 Minuten, alle 15 Minuten visualisieren das Gel.
  7. Stimulieren Sie den Rest der Zellen mit den mbIL21-mit dem Ausdruck Feeder-Zellen in einem Verhältnis von 1:1.
  8. Fünf Tage nach der Stimulation extrahieren die RNA für die Gen-Expression-Ebene mit qPCR.
  9. Führen Sie Calcein Assays als zuvor gemeldeten12. Kurz, laden Sie Zielzellen mit Calcein AM (im Beispiel gezeigt, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY Zellen diente). Zytotoxizität Assays durch ausruhen über Nacht in IL2 NK-Zellen vorbereiten (100 IE/mL) plus oder minus 10 ng/mL lösliche TGFβ. Führen Sie Calcein Assays in der gleichen Zytokine wie der NK-Zellen über Nacht ausgeruht waren.

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Ergebnisse

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Elektroporation Effizienz

Zur Optimierung der Elektroporation von Cas9/RNPs haben wir 16 verschiedene Programme mit Transduktion von GFP-targeting SiRNA und DNA Plasmid in NK-Zellen getestet. Flow Cytometry Test zeigte, dass die EN-138 den höchsten Anteil an Lebensfähigkeit und Transduktion Zelleffizienz (35 % lebenden GFP positive Zellen) für beide Teilchen (Abbildung 1 und

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Diskussion

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DNA-abhängige Änderung der NK-Zellen hat4,9streitig gemacht. Wir, stellten daher direkt eine synthetisch vorgeformten Ribonucleoprotein (RNPs) Komplex und Cas9 Protein als gereinigtes Protein in Grund- und erweiterten NK Zellen8. Diese Methode erlaubte uns, Deckelung, zu beseitigen, Beschatten, und andere transkriptionelle und translationalen Prozesse gestartet durch RNA-Polymerase II, die NK Zelle Apoptose DNA-abhängige Signaltransduktion...

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Offenlegungen

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DAL dient diente als Berater für Kurier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories und Miltenyi Biotec / Eigenkapital/Leitung CytoSen Therapeutics hat.

Danksagungen

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Wir erkennen Brian Tullius für seine freundliche Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RosetteSep&Handel; Menschlicher NK ZellanreicherungscocktailSTEMCELL Technologies15065Die RosetteSep™ Der Human NK Cell Enrichment Cocktail wurde entwickelt, um NK-Zellen durch Negativselektion aus Vollblut zu isolieren.
Ficoll-Paque® PLUSGE Healthcare - Biowissenschaften17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA Technologies1072532TracrRNA, die proprietäre chemische Modifikationen enthält, die eine erhöhte Nukleaseresistenz verleihen. Hybridisiert zu crRNA, um das Cas9-Enzym
Alt-R® zu aktivieren CRISPR-Cas9 crRNAIntegrated DNA TechnologiesSynthetisch hergestellt als Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basierend auf der Sequenz der designten gRNA, die auf das Gen des Interesses abzielt
Alt-R® Genom-Editing-DetektionskitIntegrierte DNA-Technologien1075931Jedes Kit enthält T7EI-Endonuklease, T7EI-Reaktionspuffer und T7EI-Assay-Kontrollen.
Platin® Taq DNA Polymerase High FidelityInvitrogen11304-011
4D-Nukleofector & Handel; SystemLonzaAAF-1002B
Humanes rekombinantes IL-2-ProteinNovartis65483-0116-07
P3 Primärzelle 4D-Nukleofector™ X KitLonza V4XP-3032Enthält pmaxGFP™ Vektor, Nukleofector & Handel; Lösung, Ergänzung, 16-Well-Nukleocuvette&Handel; Strips
Non-Targeting: Custom siRNA, Standard 0,05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1074181Cas9 Nuclease
DNeasy® Blut & TaschentuchhandbuchQiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGFβBiolegend580706
Alt-R® CRISPR-Cas9-Kontrollkit,Integrated DNA Technologies1072554Enthält tracrRNA, HPRT-Positivkontroll-crRNA, Negativkontroll-crRNA#1, HPRT-Primer-Mix und nukleasefreien Duplex-Puffer.
IDTE pH 7,5 (1X TE Lösung)Integrated DNA Technologies11-01-02-02
Alt-R® Cas9 ElektroporationsverstärkerIntegrierte DNA-Technologien1075915Cas9 Elektroporationsverstärker
Human

Referenzen

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