Methodenartikel

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

DOI:

10.3791/58239

⸱

25. August 2018

 , 
1Department of Biology, San Francisco State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahrzehnten haben vektorübertragene Krankheiten wieder aufgetaucht und mit alarmierender Rate, wodurch erhebliche Morbidität und Mortalität weltweit ausgebaut. Effektive und allgemein verfügbaren Impfstoffe sind für einen Großteil dieser Erkrankungen erfordern die Entwicklung von neuartigen Krankheit Minderungsstrategien fehlen. Zu diesem Zweck beinhaltet eine vielversprechende Möglichkeit der Seuchenbekämpfung targeting Vektor Mikrobiom, die Gemeinschaft der Mikroben bewohnen den Vektor. Der Vektor Microbiome spielt eine Schlüsselrolle in der Erreger Dynamik und Manipulationen das Mikrobiom zu reduzierten Vektor Fülle oder Erreger-Übertragung für eine Handvoll vektorübertragene Krankheiten geführt haben. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Krankheit Steuer-und Regelanwendungen ein gründliches Verständnis der Vektor mikrobielle Ökologie, historisch durch unzureichende Technologie in diesem Bereich begrenzt. Das Aufkommen der Next Generation Sequencing Ansätze hat schnelle, hochparallele Sequenzierung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften ermöglicht. Ausrichtung auf das hoch konserviert 16 s rRNA-gen hat Charakterisierungen von Mikroben in Vektoren unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen erleichtert. Diese Technik beinhaltet die Verstärkung der 16 s rRNA-gen, Probe Barcoding über Laden Proben auf einer Durchflusszelle für die Sequenzierung, PCR und Bioinformatik Ansätze Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen. Art oder Gattung-Ebene Kennung für eine hohe Anzahl von Wiederholungen kann in der Regel durch diesen Ansatz, damit umgehen Herausforderungen mißraten Entdeckung, Auflösung und Ausgabe von traditionellen Kultivierung, Mikroskopie oder histologische Färbung erreicht werden Techniken. Daher ist diese Methode eignet sich gut für die Charakterisierung von Vektor Mikroben unter unterschiedlichen Bedingungen aber kann nicht aktuell informieren über mikrobielle Funktion, Stelle innerhalb des Vektors oder Reaktion auf Antibiotika-Behandlung. Insgesamt ist 16 s Next Generation Sequencing eine leistungsfähige Technik für die Identität und Rolle der Vektor Mikroben in der Dynamik der Krankheit besser zu verstehen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Wiederaufleben und Verbreitung von vektorübertragenen Krankheiten in den letzten Jahrzehnten Bedrohung eine ernsthafte für globale Gesundheit von Mensch und Natur. Wirksame Impfstoffe fehlen für die meisten dieser Krankheiten, und Bemühungen sind durch die komplexe biologische Natur der Vektoren und Vektor-Wirt Interaktionen behindert. Verständnis der Rolle der mikrobielle Wechselwirkungen innerhalb eines Vektors bei der Übertragung der Erreger können für die Entwicklung von neuen Strategien, die diese Herausforderungen umgehen. Insbesondere müssen die Wechselwirkungen zwischen Vektor-assoziierten mikrobielle Kommensalen, Symbionten und Krankheitserreger, genannt das Mikrobiom wichtige Konsequenzen für die Übertragung der Erreger. Überwältigende Beweise jetzt unterstützt diese Behauptung mit Beispiele, die zeigen einer Verbindung zwischen dem Vektor Mikrobiom und Kompetenz für Krankheiten wie Malaria, Zika-Virus und Lyme-Borreliose1,2,3. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Strategien zur Seuchenbekämpfung weit mehr Detailwissen über die Struktur, Funktion und Herkunft der Vektor mikrobiome. Identifizierung und Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen Vektor bilden einen wichtigen Weg in die Zukunft in diesem Bereich.

Ein Verfahren zur Identifizierung von mikrobiellen Bewohner eines Vektors Erreger erfolgt hier durch die Verwendung von westlichen schwarzen Beinen Zecke, Ixodes Pacificus, eine Vektor-Spezies von der Lyme-Borreliose-Erreger Borrelia Burgdorferi. Während Zecken mehr Arten von menschlichen Krankheitserreger als andere Arthropoden Hafen, ist relativ wenig über die Biologie und Gemeinschaft Ökologie der Tick mikrobiome4bekannt. Es ist offensichtlich, dass Zecken beherbergen eine Vielzahl von Viren, Bakterien, Pilze und Protozoen die Kommensalen, Endosymbionts und transiente mikrobiellen Bewohner5,4enthalten. Vorherige Arbeit hat gezeigt, dass starke Schwankungen der Ixodes mikrobiome Geographie, Spezies, Geschlecht, Lebensphase und Blutmehl Quelle6,7,8zugeordnet. Jedoch die Mechanismen, die diese Variante unbekannt bleiben und detailliertere Untersuchungen über den Ursprung und Montage dieser mikrobiellen Gemeinschaften zu rechtfertigen. Zecken können Mikroben durch vertikale Übertragung erwerben Kontakt mit Gastgebern und Aufnahme aus der Umgebung durch die Luftlöcher, Mund und anal Pore9. Verständnis der Faktoren, die Gestaltung der Ausbildung und Entwicklung der Zecke Mikrobiom, ist speziell der relative Anteil der vertikalen und ökologischen Übertragung, wichtig für das Verständnis der natürlichen Muster und Variationen in tick Microbiome Vielfalt und wie interagieren diese Gemeinschaften während der Übertragung der Erreger, mit möglichen Anwendungen, Krankheit oder Vektor-Steuerung.

Leistungsstarke Molekulare Techniken, wie Next Generation Sequencing, jetzt zur Identifizierung von mikrobieller Gemeinschaften existieren und können eingesetzt werden, um Vektor mikrobiome unter verschiedenen Umwelt- oder experimentellen Bedingungen zu charakterisieren. Vor dem Aufkommen dieser Hochdurchsatz-Sequenzierung Ansätze die Identifizierung von Mikroben stützte sich überwiegend auf Mikroskopie und Kultur. Während Mikroskopie eine schnelle und einfache Technik ist, sind morphologische Methoden zur Identifizierung von Mikroben von Natur aus subjektiv und grob und begrenzt durch geringe Empfindlichkeit und Erkennung10. Kultur-basierte Methoden sind im großen und ganzen für mikrobielle Identifizierung verwendet und können zur Anfälligkeit von Mikroben für Droge-Behandlungen-11zu ermitteln. Allerdings leidet diese Methode auch geringe Empfindlichkeit, wie es hat geschätzt, dass weniger als 2 % der ökologischen Mikroben in einem Labor Einstellung12kultiviert werden können. Histologische Färbung Ansätze sind auch eingesetzt worden, zu erkennen und bestimmte Mikroben innerhalb von Vektoren zu lokalisieren, Untersuchungen von verschiedenen Taxa Ausschüttungen innerhalb der Zecke zu aktivieren und Hypothesen über mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Allerdings sind Vorkenntnisse der mikrobiellen Identität für die Auswahl der geeigneten Flecken, was diesen Ansatz ungeeignet für mikrobielle Charakterisierung und Identifizierung erforderlich. Darüber hinaus histologische Färbung ist eine sehr zeitaufwendige und mühsame Prozess und skaliert nicht gut für große Probenmengen. Traditionelle Molekulare Ansätze wie Sanger-Sequenzierung sind ähnlich in ihrer Empfindlichkeit und Erkennung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften begrenzt.

Sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht die schnelle Identifizierung von Mikroben aus einer großen Anzahl von Proben. Das Vorhandensein von standard Markergene und Referenz Datenbanken weitere ermöglicht verbesserte taxonomische Auflösung oft auf die Gattung oder Art. Kleinen Untereinheit ribosomalen RNAs sind häufig verwendet, um dieses Ziel zu erreichen mit 16 s rRNA ist die am häufigsten aufgrund des Vorhandenseins von konservierten und Variable Regionen innerhalb des Gens, so dass für die Erstellung von universellen Primer mit einzigartigen Amplifikate für jede bakterielle Art13,14. Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Taxa in der Zecke Microbiome durch 16 s rRNA Next Generation Sequencing. Dieses Protokoll betont insbesondere die Schritte bei der Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung. Mehr Details über die Sequenzierung verallgemeinert und Bioinformatik Schritte vorgesehen sind, da gibt es eine Vielzahl von Plattformen Sequenzierung und Analyse-Programme verfügbar, jeweils mit umfangreicher Dokumentation. Die Machbarkeit dieses Ansatzes Next Generation Sequencing zeigt eine Untersuchung der mikrobiellen Gemeindeversammlung innerhalb eine wichtige Krankheit Vektor zuweisen.

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Protokoll

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1. kreuzen Sie Sammlung und Oberfläche Sterilisation

  1. Durch Ziehen einer 1 m2 weiße Tuch über einen Tick-assoziierten Lebensraum, Entfernen von Zecken Zecken an Wirtsarten, oder Aufzucht im Labor15,16Zecken sammeln. Verwenden Sie feine Pinzette, um Zecken zu manipulieren und bei-80 ° c aufbewahren
  2. Zecken in die einzelnen PCR-Rohre und entfernen Oberflächenverunreinigungen durch Vortexen für 15 s sukzessive mit 500 μL von Wasserstoffperoxid (H2O2), 70 % Ethanol und DdH2O.
  3. Legen Sie die Zecken in einem neuen PCR-Röhrchen und an der Luft trocknen lassen.
  4. In diesem Rohr mechanisch stören Tick Gewebe durch Zerkleinern die Zecken mit einem Mörser und Stößel (in dieser Studie verwendet), mit kleinen Perlen in einen Wulst-Schläger oder die Zecke mit einem Skalpell auseinander schneiden.

(2) DNA-Reinigung

  1. Reinigen Sie die DNA aus einzelnen Zecken, gemäß die Anweisungen in den im Handel erhältlichen DNA-Extraktion Kit. Für ein Endvolumen von 100 μL eluieren.
    Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine Übersicht der Schritte 2,2-2,8. Alternative Extraktionsmethoden sind Phenol-Chloroform Extraktion17,18, Ethanol Niederschlag19oder Extraktion mit einem Komplexbildner Material20,21.
  2. Erfolgreiche DNA-Reinigung mit einem Fluorometer oder Spektralphotometer zu bestätigen. Verwenden Sie für Fluorometry 10 μL der DNA Schablone in einem 190 μL doppelsträngigen DNA-Assay. Die erwartete Rendite ist 0,1 bis 1,0 ng/μl22. Spektrophotometrie verwenden Sie 1 μl DNA Schablone in einer Nukleinsäure-Quantifizierung. Die erwartete A260/280 Verhältnis ist etwa 1,823.
  3. Wenn nicht sofort zu Verstärkung, speichern die Proben bei-20 ° C.

3. 16 s rRNA-gen-Verstärkung

  1. Einrichten der Amplifikate PCR in eine 27,5 μL Reaktion mit: 5 μL jeder Grundierung auf 1 μM; 12.5 μL des im Handel erhältlichen PCR-Mix; und 5 μl DNA extrahiert aus einzelnen Zecken bei einer Konzentration von 5 ng/μl.
    Hinweis: Verwenden Sie die folgenden Primer für die Amplifikation der hypervariablen V3-V4 Region der 16 s rRNA gen13:
    5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
    5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3'
  2. Rohre in einem Thermocycler programmiert für verschieben: eine erste Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 25 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s, (2) 57 ° C für 30 s, (3) 72 ° C für 30 s; eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 5 min; und einen letzten Halt bei 10 ° C.
  3. Das erledigt die PCR ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Agarosegel. Suchen Sie nach einer Band bei 460 bp um Verstärkung zu bestätigen.
    Hinweis: Amplicon PCR-Produkt möglicherweise nicht auf dem Gel sichtbar wenn die probenkonzentration zu niedrig ist (< 10 ng). Grundierung Dimer Anwesenheit ist häufig in geringer Konzentration Proben. Wenn andere nicht-Zielorganismen Bands vorhanden sind, passen Sie die Anlasstemperatur oder verringern Sie die Anzahl der Zyklen.
  4. Wenn nicht sofort zu Reinigung, speichern Sie die Proben bei 4 ° c

(4) 16 s Amplikons Reinigung

  1. Mit einem neuen PCR-Schlauch für jede Probe, kombinieren Sie das PCR-Produkt mit DdH2O 60 μL insgesamt zu erhalten. Führen Sie für Proben mit geringer DNA-Konzentrationen PCR Amplifikate in dreifacher Ausfertigung zu reduzieren Verstärkung Voreingenommenheit und bündeln die Proben zu konzentrieren.
  2. Raumtemperatur und Wirbel, die sie vor dem Gebrauch gut verleihen Sie PARAMAGNETISCHE Perlen.
  3. 60 μl der Probe 48 μL der paramagnetischen Beads hinzufügen und 5 min. Platz die Rohre auf einem magnetischen Gestell für 5 min bis Lösung wird klar inkubieren. Den überstand zu entfernen.
    Hinweis: Diese Perle Konzentration zielt auf die Beseitigung der Grundierung Dimere (< 60 bp). Passen Sie ggf. die Wulst-Konzentration um andere unspezifische Streifenbildung zu entfernen.
  4. Mit Röhren auf magnetische Gitter hinzufügen 500 μL von frisch zubereiteten 80 % EtOH. Sofort nachdem alle Röhren EtOH hinzugefügt, pipette Flüssigkeit. Entfernen Sie nicht die Perlen. Die EtOH hinzufügen und entfernen noch einmal zu wiederholen.
  5. An der Luft Trocknen der Proben um überschüssige EtOH durch offengelassen die Rohre auf dem magnetischen Rack für 5 Minuten, oder bis kleine Risse sichtbar in die Perlen sind zu entfernen.
  6. Fügen Sie 20 μl TE-Puffer und inkubieren Sie die Proben aus der Magnet bei Raumtemperatur für ca. 5-10 min.
  7. Setzen Sie die Rohre wieder auf den Magneten. Sobald die Perlen und Flüssigkeit getrennt werden, übertragen des Überstands zu einem frischen Schlauch der gereinigte PCR-Produkt zu erhalten.
  8. (Optional) Visualisieren Sie das Produkt bestätigen erfolgreiche Amplikons Reinigung durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Gel. 460 bp-Band sollte sichtbar sein, und es dürfen keine Grundierung-Dimer.
  9. Wenn nicht sofort zum Index PCR Verfahren, speichern Sie die Proben 4 ° C.

5. Probieren Sie Barcoding und Reinigung

  1. Jede Probe weisen Sie einzigartige Grundierung Kombinationen auswählen, entweder vorwärts oder rückwärts Primer, oder beides, aus einem handelsüblichen Bibliothek Index Bausatz zu.
    Hinweis: Eindeutig beschriften Proben kann zur Differenzierung nach Sequenzierung. Kits bieten in der Regel genügend Primer um 96-384 Proben zu sequenzieren.
  2. Proben mit PCR in eine 25 μL Reaktion mit 2,5 μL jeder Grundierung (N7xx und S5xx), 12,5 μL der im Handel erhältlichen PCR master-Mix, 5 μL der DdH2O und 2,5 μL der gereinigten Amplikons Produkt zuordnen Sie der dual Primer oder Indizes.
  3. Die Rohre in einem Thermocycler programmiert für verschieben: eine erste Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 8-14 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s, (2) 55 ° C für 30 s, (3) 72 ° C für 30 s; eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 5 min; und einen letzten Halt bei 10 ° C.
  4. Das erledigt die PCR ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Agarosegel. Suchen Sie nach einer Band bei 550 bp um Verstärkung zu bestätigen.
    Hinweis: Verwenden Sie die Visualisierung Ergebnisse Index PCR Radfahren Bedingungen zu informieren. Senken Sie die Zyklenzahl zu unspezifischen Bindung verringern oder erhöhen Sie die Anzahl der Zyklus um sichtbare Bänder für jede Probe zu erhalten.
  5. Wiederholen Sie die Aufräumarbeiten, in Schritt 4 aufgeführt. Zur Vermeidung von Verdünnung während der Aufräumarbeiten durchführen Sie Index PCR in zweifacher Ausfertigung und bündeln Sie das Produkt hier.
  6. Wenn nicht sofort zu Bibliothek Quantifizierung und Normalisierung, speichern Sie die Proben bei 4 ° C.

6. Bibliothek Quantifizierung und Normalisierung

  1. Die Konzentration der einzelnen gereinigten, Barcode-Produkte aus Schritt 5.5 mit einem Fluorometer oder Spektralphotometer zu schätzen (siehe Punkt 2.2). Verdünnen Sie die Proben in TE-Puffer, Konzentrationen von ca. 13:00 zu erhalten.
    Hinweis: Bibliothek Quantifizierung ist notwendig, die Probe laden Konzentration empfohlen für die Sequenzierung Plattform zu erreichen. Bibliothek-Quantifizierung wird erreicht durch qPCR, sondern schätzen die probenkonzentration vor qPCR spart Zeit und Reagenzien. 13:00-Konzentration wird empfohlen, maximieren Sie die Genauigkeit der Bibliothek Quantifizierung, denn dies ist die mittlere Konzentration der qPCR-Standards in der Quantifizierung Kit24zur Verfügung gestellt.
  2. Führen Sie qPCR 6.0 μL qPCR-master-Mix (aus Bibliothek Quantifizierung Kit) 2.0 μl DdH2O und 2.0 μl der Probe oder Standard mit 10 μL Reaktion. Führen Sie jede Probe und standard in dreifacher Ausführung für höhere Genauigkeit und Präzision. Führen Sie jedes Beispiel auf drei oder mehr Verdünnung Ebenen (zB., 12:01, 1 Uhr und 22:00 für geschätzte ab Konzentrationen) um genaue Quantifizierung zu gewährleisten.
    Hinweis: Detaillierte Informationen über die zur Verfügung gestellten Grundierungen und Standards variieren basierend auf der Quantifizierung Kit verwendet und sind in den Datenblättern der Produkte zur Verfügung. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Quantifizierung Kit in dieser Studie verwendet.
  3. Verschieben Sie die qPCR Platte oder Rohre zu einem Echtzeit-PCR-Instrument für programmiert: eine erste Denaturierung von 95 ° C für 5 min; 35 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s und (2) 60 ° C für 45 s; und eine Dissoziation Schritt 1) 95 ° c für 15 s, (2) 60 ° C für 30 s und 3) 95 ° C für 15 s.
  4. Berechnen Sie den Mittelwert ab Konzentration für jede Probe mit der Quantifizierung Werte aus der qPCR-Ergebnisse und die Probe Verdünnung verwendet.
    Hinweis: zum Beispiel eine durchschnittliche Konzentration von 14:00 für eine Probe verdünnt 1: 100.000 ergibt eine original Start Konzentration von 200 nM. Wenn keiner der Verdünnung Ebenen für eine gegebene Probe innerhalb des Bereichs der standard Kurven liegt, können Quantifizierung Ergebnisse ungenau sein; in diesem Fall passen Sie die Verdünnung und durchführen Sie qPCR erneut.
  5. Jede gereinigten, Barcode-Probe 4 verdünnen nM in TE-Puffer, basierend auf den durchschnittlichen Konzentrationen in Schritt 7,5 berechnet.
    Hinweis: zum Beispiel für eine durchschnittliche probenkonzentration von 200 nM, verdünnte die Probe 01:50 in TE-Puffer 4 nM Konzentration zu erreichen. Die präzise probenkonzentration variiert je nach der Sequenzierung System und Reagenz-Kit verwendet. Finden Sie im Benutzerhandbuch Sequenzierung System für die empfohlenen Konzentration.
  6. Erstelle die kombinierte Bibliothek indem du gleiche Volumina (in der Regel 5 bis 10 μl) aller einzelnen Bibliotheken in ein einzelnes Rohr.
    Hinweis: wie alle Proben in einer 4 nM-Konzentration sollte gleiche Volumina hinzufügen einen gleichen Konzentration aller Proben in der gepoolten Bibliothek erreicht.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.4 auf der kombinierten Bibliothek, 4 nM-Konzentration zu bestätigen.
  8. Die kombinierte Bibliothek Konzentration berechnen und verdünnen oder neu bilden die endgültige, gepoolte Bibliothek mit Tris-Puffer bei Bedarf um 4 zu erreichen nM.
  9. Wenn nicht sofort zu probenbeladung, speichern die Proben bei-20 ° C. Führen Sie die Sequenzierung laufen kurz nach Quantifizierung, Verlust oder Änderungen an DNA-Konzentration während der Lagerung zu minimieren.

(7) Bibliothek Denaturierung und Verdünnung und Sequenzierung (am selben Tag durchführen)

  1. Die 4 nM kombinierte Bibliothek aus Schritt 6,9 mit NaOH zu denaturieren.
    Hinweis: Diese letzte Bibliothek vorbereitende Schritte für jede Sequenzierung System variieren. Lesen Sie in der Sequenzierung System Bedienungsanleitung für mehr detaillierte und aktualisierte Protokolle. Neue Benutzer müssen wahrscheinlich auf die Nutzung der Plattform Sequenzierung ausgebildet werden oder können ihre Bibliotheken zu einer Kern-Sequenzierung-Anlage senden.
  2. Verdünnen der denaturierten Bibliothek, um die gewünschte Belastung Konzentration mit Hilfe des Puffers in der Sequenzierung Reagenz-Kit (Table of Materials) zur Verfügung gestellt.
    Hinweis: Optimale Beladung Konzentrationen variieren je nach Sequenzierung System und in der Regel reichen von 1-250 pM25.
  3. Denaturieren Sie und verdünnen Sie die Sequenzierung Kontrolle.
    Hinweis: Hinzufügen eines Steuerelements Sequenzierung für Sequenzierung Probleme, die aus niedrigen Vielfalt Bibliotheken korrigiert. Denaturieren Sie die Sequenzierung Steuerung mit NaOH und verdünnen Sie, die gleiche Konzentration wie die Bibliothek.
  4. Kombinieren Sie die Bibliothek und Sequenzierung Kontrolle.
    Hinweis: Das Verhältnis der Sequenzierung Kontrolle kombinierte Bibliothek hängt die Bibliothek Vielfalt und Sequenzierung System verwendet, aber es ist in der Regel 1:1-26.
  5. Laden Sie die kombinierte Bibliothek und Sequenzierung Kontrolle Mischung auf die Sequenzierung Durchflusszelle.

8. Amplikons Sequenzanalyse

  1. Bewerten Sie den Gesamterfolg des Laufs durch die Untersuchung der laufen Metriken auf die Cloud-computing-Umgebung entspricht der Sequenzierung System verwendet.
    Hinweis: Die laufen Metriken, wie z.B. Anzahl der Sequenzierung liest, variiert je nach Sequenzierung Plattform und Reagenz-Kit verwendet. Zielwerte für gängige Sequenzierung Systeme sind in Tabelle 1aufgeführt.
  2. Laden Sie die rohen Sequenzierungsdaten und gewünschte Bioinformatik open-Source Software, Quantitative Einblicke in mikrobiellen Ökologie (QIIME)27 oder Mothur28.
    Hinweis: Beide QIIME und Mothur sind Open Source und kostenlos zum Download bereit. Detaillierte Anweisungen zur Verwendung dieser Programme können online eingesehen werden und sind für erstmalige Nutzer ausreichend detailliert. Die folgenden Schritte geben einen umfassenden Überblick über eine Bioinformatik-Pipeline in QIIME durchgeführt. Vertrautheit mit Python ist nicht notwendig, aber erleichtert die Umsetzung der folgenden Skripte
  3. Erstellen und Validieren der Zuordnungsdatei verwenden das Skript "validate_mapping_file.py" in QIIME.
    Hinweis: Die Zuordnungsdatei enthält alle Metadaten, die Datenanalyse, einschließlich Proben-ID, Amplifikate Grundierung Sequenzen und Beispielbeschreibung durchführen. Der Überprüfungsschritt prüft, ob alle erforderliche Daten in das richtige Format eingegeben wurden.
  4. Demultiplex und Filtern von Sequenzen mit dem Skript "split_libraries.py" (Abbildung 1).
    Hinweis: Dieses Skript weist Barcodes liest zu Proben, basierend auf der Index-Grundierung-Kombinationen und Probe-IDs geben Sie in der Zuordnungsdatei. Es führt auch mehrere Qualität Filtern Schritte zur Kontrolle für die Sequenzierung Fehler basierend auf benutzerdefinierten trenngrenzen für minimale Qualitätsfaktor, Sequenz Längen und Ende trimmen.
  5. Sequenzen mit dem Skript "pick_open_references_otus.py" weisen Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs zu).
    Hinweis: In diesem Schritt werden Sequenzen gegen eine Referenzsammlung Sequenz basierend auf einem Schwellenwert der Identität (in der Regel 97 %) zusammengefasst. Liest, die die Referenz-Sequence-Auflistung nicht übereinstimmen, werden gegeneinander zusammengefasst. De Novo und geschlossen-Referenz OTU Kommissionierung Optionen sind auch verfügbar, aber Open-Referenz Kommissionierung von QIIME Entwickler empfohlen.
  6. Normalisieren Sie die OTU-Tabelle mithilfe des Skripts "alpha_rarefaction.py" oder "normalize_table.py".
    Hinweis: Dieser Schritt korrigiert für Variation in Spalte Summen oder gesamtsequenz liest pro Probe, die durch moderne Sequenziertechnologien entstehen. Normalisierung kann mit traditionellen Verdünnung durchgeführt werden oder durch alternative Methoden wie z. B. die kumulative Summe Skalierung.
  7. Führen Sie mehrere Alpha-Diversität, Beta-Diversität und taxonomische Zusammensetzung Vielfalt Analysen auf einmal mit dem "core_diversity_analysis.py"-Skript.
    Hinweis: Alternativ diese Analysen können ausgeführt werden separat mit der einzelnen Scripte (z. B. "alpha_diversity.py").

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Ergebnisse

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Insgesamt 42 Zecken aus drei separaten Ei Kupplungen und zwei Umweltexposition Perioden 0 und 2 Wochen im Boden für die Sequenzierung Microbiome verarbeitet wurden. Jeder Behandlungsgruppe, als ein einziges Kupplung und Belichtung Mal enthalten 6-8 Tick Proben zu replizieren. Diese verarbeiteten Tick-Extrakte wurden auf einer nächsten Generation Sequenzer geladen und ergab 12,885,713 gepaart Ende liest Filter übergeben. Waren in diesem Lauf 3 Negativkontrollen aus dem Extraktionsschritt, ...

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Diskussion

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Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA geworden eine Standardmethode für die mikrobielle Identifizierung und aktiviert die Studie wie Vektor mikrobiome Erreger-Übertragung auswirken. Die hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verwendung dieser Methode zu untersuchen, mikrobielle Gemeindeversammlung in I. Pacificus, ein Vektor-Arten für Lyme-Borreliose; Allerdings kann es leicht angewendet werden, um andere Zeckenarten oder Arthropoden Vektor Arten zu studieren.

In der...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation vergibt an A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Artikelnamedes Material-/Ausrüstungsfirmenkatalogs#
1DNeasy Blut & Tissue KitQiagen69504
2Qubit 4 FluorometerThermoFisher ScientificQ3326
3NanoDrop 8000 SpektralphotometerThermoFisher ScientificND-8000-GL
42x KAPA HiFi HotStart ReadyMixKapa BiosystemsKK2501
5AMPure XP beadsAgen CourtA63880 
6Magnetisches RackThermoFisherScientific MR02
6TE PufferTeknovaT0223
7Nextera Index KitIlluminaFC-121-1011
8KAPA Library Quantification KitRocheKK4824
9MiSeq SystemIlluminaSY-410-1003
10MiSeq Reagenzien-Kit v3 IlluminaMS-102-3001
11 10 mM Tris-HCl mit 0,1% Tween 20TeknovaT7724

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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