Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for effektivt at homo- og heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar, ud over metoder til væv prøveudtagning, data generation og dataanalyse, for undersøgelse af kolde-responderende MicroRNA.
Abstract
MicroRNA (miRNAs) er endogene lille ikke-kodende RNA'er på omkring 20-24 nt, kendt for at spille en vigtig rolle i anlægget udvikling og tilpasning. Der er en akkumulerende beviser for, at udtrykkene for visse miRNAs, ændres når podning, en landbrugspraksis, der almindeligvis anvendes af landmænd til at forbedre afgrøde tolerance over for biotisk og abiotisk understreger. Flaske centnergræskar er en iboende klima-modstandsdygtige afgrøde i forhold til mange andre store Cucurbitæ, herunder vandmelon, gør det en af de mest udbredte grundstammer til sidstnævnte. De seneste fremskridt inden for høj overførselshastighed sekventering teknologier har givet store muligheder for at undersøge kolde-responderende miRNAs og deres bidrag til heterograft fordele; passende eksperimentelle procedurer er dog en forudsætning for dette formål. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for effektivt generere homo- og heterografts mellem den kolde-modtagelige vandmelon og kolde-tolerant flasken centnergræskar, ud over metoder til væv prøveudtagning, data generation og dataanalyse. De præsenterede metoder er også nyttige for andre plante-podning systemer, afhøre miRNA forordninger under forskellige miljøbelastninger, såsom varme, tørke og saltholdighed.
Introduction
Podning har længe været ansat som en landbrugs teknik til at forbedre afgrødeproduktionen og tolerance over for biotisk og abiotisk understreger1,2,3. I heterografting systemer, kan elite grundstammer forbedre vand og næringsstoffer optagelsen af planter, styrke modstand mod jord patogener, og begrænse de negative virkninger af metal toksicitet4,5, som kan give podninger en forbedret vækst vigor og øget tolerance over for miljøbelastninger. I mange tilfælde, heterografting kan også have indflydelse på frugt kvaliteter i gartneri planter, fører til forbedret frugtsmag og øget indhold af sundheds-relaterede forbindelser6,7. Det er blevet konstateret, at langdistance overførsel af Phytohormoner, RNA'er, peptider og proteiner mellem Rodstokken og scion er en grundlæggende mekanisme modulerende vækst og udvikling omprogrammering af scion planter8,9 ,10. Podning har været meget anvendt i undersøgelser af langdistance signalering og transport i forbindelse med miljømæssig tilpasning11. Podning eksperimenter er navnlig kraftfulde til entydig påvisning af overførte molekyler i modtagelse af væv eller vaskulær sap, og aktivering eller undertrykkelse af molekylære mål på grund af signal transmission12.
Ikke-kodende RNA'er, en stor klasse af RNA, der udøver vigtige regulerende funktioner i celler, der er rapporteret til at spille en rolle i at lette plante tilpasning til abiotisk stress13. miRNAs er endogene lille ikke-kodende RNA'er på omkring 20-24 nt. undersøgelser har afsløret miRNAs i forskellige aspekter af anlægget aktiviteter regulerende rolle, sådan som skyde vækst, lateral rod dannelsen14,15,16, næringsstof optagelse, sulfat metabolisme og homøostase17og svar til biotiske og abiotiske stress18. For nylig, var udtryk for miRNAs og deres mål gener relateret til salt stresstolerance i heterografted agurk frøplanter19. I de intervariety grafts druemost fandtes svarene fra miRNA udtryk for tørkestress for at være genotype-afhængige20.
Den hurtige udvikling og mindske omkostningerne ved høj overførselshastighed sekventering teknologi har givet en stor mulighed for undersøgelse af miRNA forordninger i agronomiske planter. Vandmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en vigtig cucurbit afgrøde dyrkes på verdensplan, er modtagelige for lave temperaturer. Flasken græskar (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) er en mere klima-robust cucurbit, der almindeligvis anvendes af landmænd til at pode med vandmelon. Det primære mål for den aktuelle undersøgelse er at etablere en standard, effektiv, og bekvem metode til at gøre heterografts mellem vandmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) og flasken græskar (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Denne protokol giver også en detaljeret eksperimentelle ordning og analytiske procedurer for undersøgelse af reguleringen af miRNA udtryk efter podning, hvilket er nyttigt for at afsløre de underliggende heterografting fordele mekanismer.
Vegetabilske materialer i denne undersøgelse omfatter vandmelon kultivar og flasken centnergræskar landrace. Vandmelon kultivar er en kommerciel sort med højt udbytte men modtagelige for lave temperaturer. Flaske centnergræskar landrace er en populær grundstammer til podning med vandmelon, agurk og flasken centnergræskar, på grund af sin fremragende tolerance over for lave temperaturer21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. seed sterilisation og spiring
- For overflade sterilisation, sættetid flasken græskar frø i et 500 mL bægerglas fyldt med vand ved 58 ° C med lejlighedsvise omrøring, indtil vandets temperatur falder til 40 ° C.
- I mellemtiden, sætte 3 kg af tørv jord ind i en nylon pose og sterilisere, autoklave det ved 120 ° C/0.5 MPa i 20 min.
- Holde iblødsætning flasken græskar frø i 4-5 timer mere med ingen omrøring.
- Når vandet når stuetemperatur, skyl frøene 2 x - 3 x med destilleret vand.
- Dræne det overskydende vand og tillade frø til at spire i en gaze pose ved 28 ° C i et vækst kammer i mørke.
- Efter spiringen, så frøene i plastic Potter (6 cm i diameter) fyldt med steriliseret tørv jord.
- Når flasken centnergræskar frøplanter har udviklet to fladtrykte kimbladene, Gentag trin 1.1-1.3 med vandmelon frø.
Bemærk: Denne tid ledelsen sikrer, at størrelser af scion og rodstok svarer godt for vellykket podning.
2. sætteplante vækst og podning
- Dyrke planter i et vækst kammer med en 16-h lys /8-h mørke cyklus, holde temperaturen ved 28 ° C i løbet af dagen (lys) og ved 22 ° C i løbet af natten (mørke). Vande planter ved at tilføje vand 1 x en dag sidst på eftermiddagen.
- Brug cut-podning metode22 til at heterografts, når planter af flasken centnergræskar (grundstamme) er på stadiet én sand-blad og kimbladene af vandmelon (scion) er opstået (ikke endnu samkopieret).
- Skær hypocotyls af vandmelon udplantningsplanterne på 2-3 cm under kimbladene, og toppen af flasken centnergræskar udplantningsplanterne på webstedet umiddelbart over sandt blade.
- Brug en tandstikker til at lave et hul i toppen af trimmet flasken centnergræskar frøplanter. Indsæt klippede vandmelon stiklinger i hullerne i flasken centnergræskar stiklinger til at gøre heterografts.
- Bruge en lignende metode som præsenteret i trin 2.2 til at gøre homografts.
Bemærk: Kombinationer af Homo- og heterografting bør altid foretages samtidigt (figur 1), som i dette tilfælde resulterer i følgende: vandmelon/flasken centnergræskar (WB, heterograft), vandmelon/vandmelon (WW, homograft) og flasken centnergræskar /bottle centnergræskar (BB, homograft).
Fig. 1: Illustration af transplantat kombinationer og de podede plantestrukturer. WB = vandmelon/flaske centnergræskar heterografting; WW = vandmelon/vandmelon homografting; BB = flasken centnergræskar/flaske centnergræskar homo-podning; WB-S = scion blade af vandmelon/flaske centnergræskar heterografts, der var samplet; WB-R = rodstok blade af vandmelon/flaske centnergræskar heterografts, der var samplet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
3. postgrafting Management, kuldebehandling, og prøvetagning
- Enwrap de podede planter med transparent polyethylen poser til at holde en forholdsvis høj luftfugtighed og bevare dem for 7 d under miljøforhold af 16-h lys/8-h mørke cyklusser, holde temperaturen ved 28 ° C i løbet af dagen (lys) og ved 22 ° C under den nat (mørk).
- Afdække transparent polyethylen poser på 7 dag. Lad planterne vokse for en ekstra 7-10 dage under de samme betingelser.
- Opdele de sunde ensartede planter i to grupper, en kold behandling (understreget) og en til kontrol (ikke-understregede). For kontrolgruppen, forlader stiklinger i den samme vækst afdeling (ved 28 ° C) for en yderligere 48 h, mens for gruppen kolde-understregede, overføre udplantningsplanterne til en vækst kammer med en konstant temperatur på 6 ° C, med lys/mørke forhold, som beskrevet i trin 2.1.
- Prøve blade af scion og Rodstokken fra podninger (figur 1). Fryse prøverne straks i flydende nitrogen og gemme dem på 70 ° C indtil brug.
4. biblioteket forberedelse og høj overførselshastighed sekventering
- Overføre de frosne prøver til en 2-mL microcentrifuge tube i flydende kvælstof.
- Tilføje en rustfrit stål perle (5 mm i diameter) til hvert rør, der indeholder væv.
- Homogeniseres væv til et fint pulver ved hjælp af en perle mill homogeniseringsapparat for 30 s.
- For hver podning kombination, tag lige store mængder (0,1 g) af jorden prøve fra ti frøplanter og bland dem i et 10 mL centrifugeglas. Tilføje en passende mængde guanidium hydrochlorid reagens (Table of Materials) baseret på fabrikantens forslag svarer til vægten, væv.
- Fjerne genomisk DNA forureninger ved at tilføje RNA-fri DNase I til 150 U/mL ved 37 ° C i 1 time.
- Bestemme samlet RNA mængde på en microcapillary elektroforese system til at sikre integritet, RNA nummer > 7,0.
Bemærk: En RIN > 7,0 sikrer en høj integritet af RNA prøver. - Forberede små RNA biblioteker ved hjælp af en kommerciel kit (Table of Materials) ifølge producentens anvisninger. Brug 1 µg af total RNA pr. prøve for at indlede.
- Tø bibliotek normalisering reagenser og adaptere ifølge producentens retningslinjer. Ligate små RNA'er med 5 ' og 3 ' adaptere og elueres og rense dem. Derefter, reverse omskrive 5 ' og 3' forbundet små RNA'er efter producentens retningslinjer.
- Udføre PCR-amplifikation efter producentens protokol. Vurdere kvaliteten og mængden af cDNA-biblioteker ved hjælp af en microcapillary elektroforese system.
- Indlæse 1 µL af en RNA bibliotek på en microcapillary elektroforese system til at sikre RIN > 7,0.
- Sekvens af små RNA biblioteker på en høj overførselshastighed sekventering instrument som beskrevet andetsteds23.
5. miRNA og Target gen forudsigelse
- For hver podning kombination, brug open source UEA sRNA workbench 2.4-plante version24 at fjerne dårlige sekvenser og at trimme adapter sekvenser fra de rå læsninger. Kassér sekvenser, der er mindre end 18 nt eller større end 32 nt.
- Sammenligne høj kvalitet "rene" sekvenser til open source Rfam 11,0-database til at genkende og fjerne læsninger af rRNA, tRNA, snoRNA og andre snRNAs.
- Juster de resterende læser til reference genomer ved hjælp af en kort-læser sekvens justering værktøj25. Ingen uoverensstemmelse er tilladt i dette trin.
Bemærk: Vandmelon "97103" genom forsamling V126 blev anvendt for justeringen med læsninger fra scion, og flasken centnergræskar "HZ" genom forsamling V127 blev brugt til læser fra en rodstok. - Sammenligne de resterende læser mod kendte modne miRNAs i open source miRBase 22,028. Læser, der er homologe til kendte miRNAs klassificeres som bevarede miRNAs.
- Sammenligne de sekvenser, der undlader at matche de kendte miRNA prækursorer med genomet sekvens. Brug MIREAP29 algoritme til at opdage potentielle roman miRNAs under standardindstillingerne.
6. differential udtryk og gen ontologi analyse
- Sammenligne udtryk niveauer af miRNAs baseret på deres Læs tæller. miRNAs med en P-værdi (Fisher eksakt test) < 0,05 og en absolut log2 værdi > 2 anses for at være varierende udtrykt.
- Brug en antisense oligonukleotid målet site udvælgelse værktøj (TargetFinder)30 til at forudsige potentielle supplerende mRNAs (miRNA target gener) til de varierende udtrykt miRNAs under standardparametre.
- Bruge gen ontologi (gå) berigelse analytisk værktøj31 at afsløre miRNA target gener ontologi (GO) mønstre under en P- værditærskel på 0,05 for Statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2: fænotyper af forskellige grafts ved stuetemperatur og kolde-understregede betingelser. (en) dette panel viser homo- og heterografted planter ved stuetemperatur som kontrol. (b) dette panel viser homo- og heterografted planter efter 48 h af kuldebehandling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Ved hjælp af metoden beskrevet, opnåede vi en stor succes (overlevelse) på 98% for podning. Fænotyper af forskellige grafts ved stuetemperatur og kolde-understregede betingelser er vist i figur 2. Efter 48 h af kuldebehandling, homografted vandmelon planter viste indlysende væksthæmning med visne unge blade, mens homografted flaske centnergræskar planter og vandmelon/flaske centnergræskar heterografts udstillet meget kraftigere vækst. Ingen symptomer på skader blev observeret i bladene af heterografts, der endog overgik homografted flasken centnergræskar planter, hvor de laveste løvblade blev beskadiget. Disse resultater klart viser fordelen ved heterografts i tildeling kolde tolerance.
Små RNA sekventering af de otte biblioteker givet ialt 258 millioner rå læsninger. Efter kvalitetskontrol (QC), i alt 146 millioner læser svarende til cirka 30 millioner unikke sekvenser blev bevaret (tabel 1). Baseret på dette sæt af ren sRNA sekvenser, 323 miRNAs, herunder 10 kendte og 313 roman miRNAs, blev forudsagt fra flasken centnergræskar, og 20 kendte og 802 roman miRNAs blev forudsagt fra watermelon.sRNAs af 24 nt består den største klasse af sRNA'er i alle podning kombinationer, uanset stuetemperatur eller kolde-understregede betingelser (figur 3).
| Behandling | Kode | Lol læser | sRNA | |
| I alt | Unikke | |||
| WW-CK | Rå | 30612962 | ||
| Ren | 19727501 | 3858868 | ||
| Tilknyttet genomisk | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | Rå | 30845546 | ||
| CK | Ren | 16832061 | 3787866 | |
| Tilknyttet genomisk | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | Rå | 39492123 | ||
| Ren | 26783053 | 6319473 | ||
| Tilknyttet genomisk | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-RASMUSSEN | Rå | 23763619 | ||
| Ren | 10187791 | 1784447 | ||
| Tilknyttet genomisk | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | Rå | 27557577 | ||
| Ren | 17879038 | 3336242 | ||
| Tilknyttet genomisk | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-CL | Rå | 29780991 | ||
| Ren | 13342206 | 3235570 | ||
| Kolde | Tilknyttet genomisk | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | Rå | 45708415 | ||
| Ren | 23071845 | 4310276 | ||
| Tilknyttet genomisk | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-RASMUSSEN | Rå | 30585408 | ||
| Ren | 19029266 | 3541729 | ||
| Tilknyttet genomisk | 17364239 | 3196106 | ||
Tabel 1: Statistik af små RNA'er i forskellige grafts ved stuetemperatur eller under kuldebehandling.
Figur 3: størrelse fordeling af sRNA læser i forskellige grafts. (en) dette panel viser størrelse fordelingen af sRNA læser i heterografts under kontrol eller kolde forhold. (b) dette panel viser størrelse fordelingen af sRNA læser i homografts under kontrol eller kolde forhold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Efter 48 h af kuldebehandling var 30 og 268 miRNAs op- og downregulated, henholdsvis i bladene af scion i heterografts. Dette var i skarp kontrast til resultaterne i bladene af grundstammer, hvor 31 og kun 12 miRNAs var op- og downregulated, henholdsvis (figur 4). I vandmelon/vandmelon homografts blev 64 og 83 miRNAs op- og downregulated, henholdsvis. I flasken centnergræskar/flaske centnergræskar homografts var disse numre 30 og 28. Tilsyneladende, heterografting forårsaget en gennemgribende omprogrammering af miRNA udtryk. GO-berigelse analyser af de formodede target gener af den varierende udtrykt miRNAs identificeret 78 beriget GO vilkår i ætling af heterografts, med 40 inddeles i biologiske processer, 2 i cellulære komponenter og 36 i molekylære funktioner (Figur 5). Vi fandt, at flere kendte GO vilkår/veje relateret til abiotiske/biotiske stress modstand og signal transduktion, eksempelvis chitin kataboliske proces (gå: 0006030, gå: 0006032), ethylen-aktiveret signalering pathway (gå: 0009873), polyamine biosyntetiske proces (GO: 0006596), og signaltransduktion af protein fosforylering (gå: 0009755), var involveret. Kombineret, tyder vores resultater på, at downregulation af miRNAs ved tuning overflod af udskrifter af deres mål gener, kan udgøre en vigtig mekanisme bag forbedret kold tolerance. I vandmelon/flaske centnergræskar grafts har den heterograft i sig selv en betydelig indvirkning på miRNA mønstre, der danner graft fordele.
Fig. 4: sammenligning af mønstre af op- og downregulated miRNAs svar på kolde stress i forskellige grafts. WB-S = scion blade af vandmelon/flaske centnergræskar heterografts, der var samplet; WB-R = rodstok blade af vandmelon/flaske centnergræskar heterografts, der var samplet; WW = vandmelon/vandmelon homografts; BB = flasken centnergræskar/flaske centnergræskar homografts. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: gå berigelse analyser af de formodede target gener af varierende udtrykt miRNAs i scion blade af heterografts ved kolde stress. WB-CL-S = scion blade af vandmelon/flaske centnergræskar heterografts under kuldebehandling; WB-CK-S = scion blade af vandmelon/flaske centnergræskar heterografts ved stuetemperatur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskrev vi i detaljer en yderst effektiv og reproducerbar metode til at gøre homo- og heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar. Denne metode, der kræver ingen særlige udstyr, er meget nem at betjene og typisk har en meget høj overlevelsesraten for podning. Metoden kan også bruges til at gøre grafts for andre Cucurbitæ, såsom mellem vandmelon, agurk og græskar.
Det er værd at bemærke, at den relative størrelse (alder) rodstok og scion er afgørende for at gøre en vellykket transplantat (trin 2.2 i protokollen). Vi bemærkede, at, hvis grundstamme anvendte var for stor i forhold til scion, graft union var vanskeligere at danne fordi stilken af scion var noget udhulet. Baseret på vores tidligere proteom data31, optagelse af selvstændige podede scion og selvstændige podede rodstok som kontrol anbefales kraftigt (trin 2.3 Protocol), fordi, så virkningen af podning skader kan være stort set elimineret.
Denne protokol indeholder også en detaljeret eksperimentelle ordning og særlige eksperimentelle procedurer for at undersøge mængderne af miRNAs i heterografting systemet. Denne metode vil også være nyttig for undersøgelser i andre plante-podning systemer til at afsløre mekanismerne af lokale og langdistance miRNA forordning. I de Repræsentative resultaterrapportere vi udtryk ændringer kun lokale miRNAs i scion eller rodstok som svar på en lav temperatur. Akkumulere rapporter har fremhævet inddragelse af langdistance små RNA transmission i podning-relaterede fænotypiske forandringer. Protokollen præsenteres her, som kombinerer metoder til podning og høj overførselshastighed dataanalyse, kan også bruges til miRNA transmission analyse mellem scion og Rodstokken. Princippet om differentiering overførte miRNAs fra lokale miRNAs er baseret på deres rækkefølge lighed med reference genomer (dvs., en miRNA i scion, der er mere som grundstamme genom anses for at være overført fra rodstok, og vice versa).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse. De små RNA sequencing data er deponeret i GenBank under stammesamlingsnummer SRP136842.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31772191), forskningsprojekt for offentlighedens interesse i Zhejiang provinsen (2017C 32027), den nøglen videnskab projekt af planteavl i Zhejiang (2016C 02051) og det nationale Program for Understøttelse af Top-notch unge fagfolk (til P.X.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
