Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Summary

Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Abstract

Fettgewebe spielt eine zentrale Rolle im Energie-Homöostase und Thermoregulation. Es besteht aus verschiedenen Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, Blutgefäße und Nerven Projektionen. Obwohl die molekularen Steuerung der Zelle Typspezifikation und wie diese Zellen interagieren zunehmend abgegrenzt, ein umfassenderes Verständnis dieser Fettgewebe-Resident-Zellen lässt sich durch die Visualisierung ihrer Verteilung und Architektur durch das ganze Gewebe. Bestehenden Immunohistochemistry und Immunfluoreszenz Ansätze für adipöse Histologie analysieren setzen auf Paraffin-eingebetteten Dünnschliffe. Dünnschliffe erfassen jedoch nur einen kleinen Teil des Gewebes; Infolgedessen können die Schlussfolgerungen voreingenommen sein, durch welchen Teil des Gewebes analysiert wird. Daher haben wir ein Fettgewebe, clearing-Technik, Adipo-Clear, um umfassende dreidimensionale Visualisierung der molekularen und zellulären Muster in ganze Fettgewebe zu ermöglichen. Adipo-Clear wurde von iDISCO / iDISCO +, mit spezifischen Änderungen gemacht, um vollständig zu entfernen die Lipid unter Beibehaltung der nativen Gewebe Morphologie im Gewebe gespeichert. In Kombination mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie zeigen wir hier die Verwendung von der Adipo-Clear-Methode, um hochauflösende volumetrischen Bilder von einer gesamten Fettgewebe zu erhalten.

Introduction

Bis vor kurzem war Fettgewebe als eine amorphe Sammlung von Fettzellen konzipiert. In den vergangenen Jahrzehnten hat unser Verständnis mit Fett jetzt erkannt, um ein komplexes Organ, enthält verschiedene Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, das Gefäßsystem und Nerv Projektionen werden anspruchsvoller, gewachsen. Interaktionen zwischen diesen Fettgewebe-Resident-Zellen haben Auswirkungen auf Fettgewebe und organismal Physiologie und Pathophysiologie¹ausgesprochen. Obwohl neue Studien wichtigere molekularen Mechanismen, die bestimmte Interaktionen entwirrt haben, erfordert ein umfassenderes Verständnis zuverlässige strukturelle Profilierung des gesamten Gewebes in drei Dimensionen (3D).

Unseren derzeitigen Kenntnissen von Fettgewebe Morphologie basiert größtenteils auf histologische Analyse von Dünnschliffen (5 μm) mit relativ hoher Vergrößerung Bildgebung (mehr als 10 X)^2,3. Dieser Ansatz hat jedoch einige erhebliche Einschränkungen. Erste, komplizierte faserigen Strukturen wie sympathischen Nerven und das Gefäßsystem, die bekanntermaßen die adipösen Funktion^4,5,6,7eine wichtige Rolle spielen, sind schwer zu bewerten durch dünne Abschnitte. Zweitens aufgrund seiner scheinbar amorphe Form und das Fehlen von repräsentativen strukturelle Einheiten zu konzentrieren, ist es schwierig, Fettgewebe Strukturen basierend nur auf Abschnitt Färbung zu schätzen wissen. Drittens, Fettgewebe hat einen sehr hohen Fettgehalt, schaffen Herausforderungen bei der Beschaffung konsequent Serienschnitte, die geeignet sind für 3D anatomische Rekonstruktion, einer konventionellen Methode verwendet, um ganze Gehirn Morphologie⁸zu studieren. Angesichts dieser Faktoren gibt es ein großer Bedarf für einen ganzen-Mount-Ansatz, der 3D-Visualisierung eines gesamten Fettgewebe-Depots und noch eine zelluläre Auflösung bieten kann.

Volumetrische 3D-Bildgebung eines ganzen Organs ist schwierig wegen der verhüllenden Auswirkungen der Lichtstreuung. Eine wichtige Quelle der Lichtstreuung in biologischen Geweben kommt von Lipid-wässrige Schnittstellen. Obwohl die Bemühungen um die Streuung zu beseitigen, indem Sie Lipide entfernen laufende für über ein Jahrhundert gewesen, gab es eine große Anzahl von jüngsten Innovationen⁹. Eine solche neu entwickelte Gewebe-Clearing-Methode ist Immunolabeling-fähigen 3D-Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO / iDISCO +)^10,11. Fettgewebe stellt jedoch eine besondere Herausforderung dar, die aufgrund ihrer hohen Lipide, und daher zusätzliche Änderungen an der iDISCO / iDISCO + Protokoll sind erforderlich, um vollständig die Lipide extrahieren und schützt das Gewebe vor dem Kollaps. Das geänderte Protokoll, die, das wir entwickelt haben, jetzt genannt Adipo-Clear, beschäftigt Methanol/Dichlormethan-basierte delipidierung von Fettgewebe, geeignet für hochauflösende Volumetrische Bildverarbeitung¹²optimalen Transparenz zu erreichen. Da die delipidierung Schritt weitgehend Quenchen endogen ausgedrückt fluoreszierende Proteine wie GFP und RFP, muss Visualisierung solcher Proteine durch Immunolabeling erzielt werden. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um Gewebe-Organisation von Fettgewebe ansässige Zellen untersuchen Abstammung Rückverfolgung Adipocyte Vorläuferzellen und adipösen Morphogenese während der Entwicklung.

Protocol

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren genehmigt durch die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss an der Rockefeller University durchgeführt.

(1) Gewebe-Vorbereitung

1. Führen Sie standard intrakardialen Perfusion mit ~ 20 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C, bis das Blut aus dem Gewebe vollständig entfernt wird.
2. Wechseln Sie die Perfusat zu ~ 20 mL Fixativ Lösung (4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer) bei 4 ° C, bis der Hals und Schweif deutlich versteift haben.
   Achtung: PFA ist giftig. Berührung mit Haut, Augen und Schleimhäute. Lösungen sollten in einem Abzug erfolgen.
3. Sezieren Sie die Fettpolster von Interesse sorgfältig, um die gesamte Fettpolster zu entfernen, ohne es zu beschädigen. Verwenden Sie stumpf endete Zangen um Kneifen oder Quetschen des Gewebes zu vermeiden. Vermeidung einer Kontamination der sezierten Gewebes mit jedem Fell.
4. Nach dem Beheben des Gewebes bei 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° c Für jedes Fettpolster Post-mit ~ 10 mL Fixierung-Lösung in einem 15 mL konische Rohr befestigen.
5. Waschen Sie das Gewebe 3 mal (1 h) mit 1 X PBS bei Raumtemperatur (RT).
6. Speichern Sie das Gewebe für kurzfristige (bis zu 2 Wochen) mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C und vor Licht geschützt werden. Für langfristige Lagerung (z.B.1-2 Jahre) wechseln Sie den Puffer zu 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid (als Konservierungsmittel).
   Achtung: Natriumazid ist hochgiftig, wenn oral oder über die Haut aufgenommen. Konzentriert Natriumazid Lösungen (bei 5 % oder mehr) unter einer Abzugshaube behandelt werden sollte.

2. Delipidierung und Permeabilisierung

Timing: 1-2 Tage

1. Bereiten Sie 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol Steigung mit B1n Puffer (Tabelle 1), (V/V), z. B.für 20 % Methanol/B1n Puffer, mischen Sie 20 mL Methanol und 80 mL B1n Puffer. Speichern Sie alle Puffer bei 4 ° C. Von 60 % und 80 % Methanol/B1n Puffer aufgrund der Sättigung werden Glycin Kristalle ausgefällt. Zu vermeiden, entfernen die Kristalle; Verwenden Sie die flüssige Lösung für folgenden Waschungen.
   Achtung: Methanol ist flüchtig, reizend und brennbar. Vermeiden Sie Haut- oder Augenkontakt.
2. Entfernen Sie vorsichtig die Haare aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion. Haare, Flusen oder Fremdkörper befestigt zum Beispiel verursacht Schatten während der Bildgebung. Übertragen Sie die gereinigte Probe in einen neuen Schlauch.
3. Führen Sie alle folgenden Schritte auf dem Eis oder bei 4 ° C, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie für kleine Proben (z.B. posterior subkutanen/Perigonadal Fettpolster von jungen schlanken Mäusen) 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben oder Proben mit hohem Fettgehalt (z.B., Fettpolster von fettleibigen Mäusen) 5 mL Röhrchen mit 4 mL der Lösung.
   1. Legen Sie die Rohre mit den Proben horizontal auf einem Orbitalschüttler festgesetzt ~ 100 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Inneren der Röhre frei bewegen können.
4. Entwässern Sie die Probe in einer abgestuften Reihe von 20 %, 40 %, 60 %, 80 % und 100 % Methanol/B1n-Puffer für die angegebene Zeit (Tabelle 2). Minimieren Sie die Carry-over-Lösung.
5. Delipidate der Probe mit 100 % Dichlormethan (DCM) (3 mal), jeweils mit der Inkubationszeit in Tabelle 2angegeben. Die Probe sollte auf den Boden des Röhrchens am Ende des zweiten und dritten DCM Waschungen sinken. Wenn nicht, erweitern die Inkubationszeit zu vollen delipidierung zu gewährleisten (z.B.reichen von 30 min bis 1-2 h).
   Achtung: DCM sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Röhren, die aus Polypropylen für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DCM verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DCM. DCM ist sehr volatil. Übertragen Sie die Probe in frische Lösung schnell um Austrocknung zu verhindern.
6. Waschen Sie sich zweimal mit 100 % Methanol für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
7. Optional: Wenn die Probe nicht gut PERFUNDIERTEN ist, kann die Farbe des Hämoglobins aus den verbleibenden Erythrozyten stark Autofluoreszenz führen. Bleichen Sie mit 5 % H₂O₂ in Methanol (1 Volumen von 30 % H₂O₂ bis 5 Bände von Methanol) über Nacht bei 4 ° C.
8. Die Probe in einer umgekehrten Methanol/B1n Puffer Serie rehydrieren: 80 %, 60 %, 40 %, 20 % Methanol/B1n und 100 % B1n Puffer (2 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
9. Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer (Tabelle 1) für 2 h bei RT
10. Die Delipidated Probe in PTxwH Puffer bei 4° C (bis zu 1 Jahr) speichern oder sofort mit dem Immunostaining Schritt fortfahren.

(3) ganze Mount Immunostaining

Timing: 8-10 Tage

Hinweis: Die folgenden Schritte sollten bei RT erfolgen soweit, mit schütteln und vor Licht geschützt. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung. Es empfiehlt sich, zuerst die Antikörper auf kleine Stücke des Gewebes oder Methanol behandelten Gewebeschnitte validieren.

1. Den primäre Antikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern.
2. Inkubieren Sie die Delipidated Probe mit dem primären Antikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
3. Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.
4. Der Sekundärantikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern.
   Hinweis: Zur Vermeidung von hohen Hintergrund verursacht durch Gewebe Autofluoreszenz sind mit Fluorophore, die Licht in den Regionen rote und dunkelrote emittieren konjugierten Sekundärantikörper empfohlen. Abhängig von der Anzahl der Laserlinien auf ein Mikroskop zur Verfügung kann bis zu 3-4 Marker in einer Probe gleichzeitig dargestellt werden.
5. Inkubieren Sie die Probe mit der Sekundärantikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
6. Waschen Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.
7. Optional: Für Gewebetypen, die zerbrechlich sind, beheben Sie die gefärbte Gewebe mit 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C zur Erhaltung der Gewebe Morphologie.
   Hinweis: Dieser Schritt kann Bildgebung Hintergrund erhöhen. Es ist nicht notwendig, führen Sie diesen Schritt für Fettgewebe.
8. Waschen Sie die Probe mit 1 X PBS in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min und 30 min.
9. Fusseln entfernen Sie vorsichtig aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion.

(4) Gewebe Clearing

Timing: 1-2 Tage

1. Optional: Einbetten der Probenmaterials in Agarose Probe Halterung für Licht-Blatt Mikroskopie zu erleichtern.
   Hinweis: Dieser Schritt ist dringend empfohlen für Fettgewebe, seine Form während der Aufnahme zu stabilisieren.
   1. Bereiten Sie die einbettende Lösung mit 1 % Agarose in 1 X PBS (w/V). Cool die einbettende Lösung für ~ 40 ° C zu vermeiden, dass die Probe übermäßiger Hitze.
   2. Legen Sie die gereinigte Probe in eine Form (z.B., Petrischale oder mit einem Gewicht von Boot) und ordnen sie in die gewünschte Position. Vermeiden Sie jede flüssige Übertragung. Die Einbettung Gemisch sanft über die Probe. Vermeiden Sie Luftblasen.
   3. Lassen Sie die Agarose voll an RT. Schnitt aus einem Block mit der Probe zu festigen.
      Hinweis: Die folgenden Schritte einschließlich Übernachtung Inkubationen sollte bei RT, mit schütteln und vor Licht geschützt erfolgen. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung.
2. Entwässern Sie die Probe in Methanol Farbverlauf mit H₂o: 25 %, 50 %, 75 % und 100 % (3 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2).
   Hinweis: Probe kann über Nacht bei 100 % Methanol Schritt gelassen werden.
3. Inkubation der Probe in 100 % DCM 1 h unter Schütteln (3 mal). Probe sollte auf der Unterseite des Rohres am Ende von jedem DCM waschen sinken. Wenn dies nicht der Fall ist, erweitern die Inkubationszeit zur vollständigen Entfernung von Methanol zu gewährleisten. Probe kann über Nacht bei 100 % DCM Schritt gelassen werden.
4. Inkubieren Sie die Probe in Dibenzyl Äther (DBE) über Nacht mit leichten schütteln um Brechungsindex passend zu erreichen.
   Hinweis: Probe wird schließlich im sichtbaren Licht transparent.
   Achtung: DBE ist gefährlich. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Im Inneren einer Abzugshaube mit doppellagige Handschuhe damit umgehen. Verwerfen Sie die Handschuhe, sobald es mit DBE verunreinigt ist. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Rohre (Polypropylen) für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DBE verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DBE. Reinigen Sie alle Spill mit 100 % Ethanol.
5. Inkubation der Probe mit frischen DBE mit leichtem Schütteln für 2 h. Store die Probe bei RT im Dunkeln oder gehen Sie direkt zu Bildgebung.
   Hinweis: Proben sollten innerhalb eines Monats abgebildet werden. Obwohl bestimmte Fluorophore stabiler als andere sind, ist langfristige Lagerung der Proben in diesem Stadium nicht empfohlen.

(5) Mikroskopie

1. Bildgebung mit einem Licht-Blatt-Mikroskop, das mit DBE kompatibel ist.
   Hinweis: Nur Ziele, die für organische Lösungsmittel Bildgebung zugelassen und abgestimmt mit dem Brechungsindex von DBE können verwendet werden, als Ziele in der DBE eingetaucht Bildgebung eintauchen.
   1. Montieren Sie die Agarose eingebettet Probe auf eine Halterung, die Bewegung während der Bildgebung verhindern kann. Tauchen Sie die Probe in einer DBE-gefüllte Kammer.
   2. Sammeln Sie einen Z-Stack für die gesamte Probe (z.B. 1-2 X Vergrößerung), ganze-Verteilung/Gewebestruktur des Markers von Interesse zu erhalten.
   3. Wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (z.B. 4-12 X Vergrößerung) der Regionen von Interesse für feine Strukturen Bild vergrößern.
      Hinweis: Kollagen ist ein wesentlicher Faktor für die extrazelluläre Matrix des Fettgewebes, die alle Fettzellen¹³umgibt. Kollagen ist ein typisches Emissionsspektrum reichen rund 400 nm bis 550 nm¹⁴. Bildgebung der Probe mit 488 Laserlinie (grün) und sammeln das emittierte Licht in einem Wellenlängenbereich, der in das Emissionsspektrum von Kollagen (z.B. 525-550 nm) liegt liefern das Gewebe Autofluoreszenz Signal, die bisher gezeigt wurde Fettzelle Kontur und allgemeine Gewebe Architektur¹²abzugrenzen.
2. Bildgebung mit einer invertierten konfokale oder ein zwei-Photonen-Mikroskop.
   1. Legen Sie die Probe Agarose eingebettet in eine Kammer-Folie mit einem Glasboden, ohne alle Kunststoffteile (oder andere DBE-kompatible bildgebende Kammer, die versiegeln kann). Stellen Sie sicher, DBE nicht austreten.
   2. Wählen Sie die Ziele mit längeren Arbeitsabstand, tieferes Eindringen zu erreichen.
      Hinweis: Bildgebung sollte mit einem inversen konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskop durch den Glasboden der Kammer Folie erfolgen. Vermeiden Sie direkten Kontakt zwischen der Probe und Dippen Ziele, die nicht für die DBE-basierte Bildgebung vorgeschlagen werden.

Results

Adipo-Clear bereit ganze Fett Pads abgebildet werden können, in 3D zu analysieren, wie Gewebe Morphologie und zellulären Interaktionen in den mageren und fettleibigen Staaten betroffen sind. Diese Methode kann leicht angewendet werden, um allgemeine adipösen Struktur zu analysieren, durch das Sammeln von Gewebe Autofluoreszenz Signal in den grünen Kanal. Wir haben bereits gezeigt, dass die Autofluoreszenz Signal in adipösen Überlagerungen günstig mit Perilipin Färbung, eine häufig verwend...

Discussion

Adipo-Clear ist eine einfache und robuste Methode für das clearing von Fettgewebe, die leicht in eine reguläre Laboraufbau durchgeführt werden kann. Im Vergleich zu anderen lösemittelhaltigen Clearing-Methoden wie iDISCO / iDISCO +^10,11,12, Adipo-Clear ist besonders optimiert für das clearing von Fettgewebe und andere Gewebe mit hohem Fettgehalt. Der delipidierung Schritt vollständig entfernt Lipide aus Fettgewebe, und daher erl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichlormethan	Sigma Aldrich	270991
Wasserstoffperoxid 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzylether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Natriumazid	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycin	Fisher Scientific	BP381-1
Kaninchen polyklonale Anti-Tyrosin-Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 Verdünnung
Ziege polyklonal anti-CD31/PECAM-1	R& D Systems	AF3628	Endkonzentration von 2 & Mikro; g/mL
monoklonales Anti-CD68 der Ratte, Klon FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Endkonzentration von 2 & Mikro; g/mL
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Endkonzentration von 5-10 µ g/mL
Esel Anti-Ziegen IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Endkonzentration von 5-10 µ g/mL
Donkey Anti-Ratte IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Endkonzentration von 5-10 µ g/mL
Bildkammer	ibidi	80287
Lichtblattmikroskop	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Bildgebungssoftware	LaVision BioTec	Imspector Software Mikroskopie
Visualisierungssoftware	Bitplane	Imaris