Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Summary

Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Abstract

Fettgewebe spielt eine zentrale Rolle im Energie-Homöostase und Thermoregulation. Es besteht aus verschiedenen Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, Blutgefäße und Nerven Projektionen. Obwohl die molekularen Steuerung der Zelle Typspezifikation und wie diese Zellen interagieren zunehmend abgegrenzt, ein umfassenderes Verständnis dieser Fettgewebe-Resident-Zellen lässt sich durch die Visualisierung ihrer Verteilung und Architektur durch das ganze Gewebe. Bestehenden Immunohistochemistry und Immunfluoreszenz Ansätze für adipöse Histologie analysieren setzen auf Paraffin-eingebetteten Dünnschliffe. Dünnschliffe erfassen jedoch nur einen kleinen Teil des Gewebes; Infolgedessen können die Schlussfolgerungen voreingenommen sein, durch welchen Teil des Gewebes analysiert wird. Daher haben wir ein Fettgewebe, clearing-Technik, Adipo-Clear, um umfassende dreidimensionale Visualisierung der molekularen und zellulären Muster in ganze Fettgewebe zu ermöglichen. Adipo-Clear wurde von iDISCO / iDISCO +, mit spezifischen Änderungen gemacht, um vollständig zu entfernen die Lipid unter Beibehaltung der nativen Gewebe Morphologie im Gewebe gespeichert. In Kombination mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie zeigen wir hier die Verwendung von der Adipo-Clear-Methode, um hochauflösende volumetrischen Bilder von einer gesamten Fettgewebe zu erhalten.

Introduction

Bis vor kurzem war Fettgewebe als eine amorphe Sammlung von Fettzellen konzipiert. In den vergangenen Jahrzehnten hat unser Verständnis mit Fett jetzt erkannt, um ein komplexes Organ, enthält verschiedene Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, das Gefäßsystem und Nerv Projektionen werden anspruchsvoller, gewachsen. Interaktionen zwischen diesen Fettgewebe-Resident-Zellen haben Auswirkungen auf Fettgewebe und organismal Physiologie und Pathophysiologie¹ausgesprochen. Obwohl neue Studien wichtigere molekularen Mechanismen, die bestimmte Interaktionen entwirrt haben, erfordert ein umfassenderes Verständnis zuver....

Protocol

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren genehmigt durch die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss an der Rockefeller University durchgeführt.

(1) Gewebe-Vorbereitung

1. Führen Sie standard intrakardialen Perfusion mit ~ 20 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C, bis das Blut aus dem Gewebe vollständig entfernt wird.
2. Wechseln Sie die Perfusat zu ~ 20 mL Fixativ Lösung (4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer) bei 4 ° C, bis der Hals und Schweif deutlich versteift haben.
   Achtung: PFA ist giftig. Berührung mit Haut, Augen und Schleimhäute. Lösungen sollten in einem Abzug erfolgen....

Results

Adipo-Clear bereit ganze Fett Pads abgebildet werden können, in 3D zu analysieren, wie Gewebe Morphologie und zellulären Interaktionen in den mageren und fettleibigen Staaten betroffen sind. Diese Methode kann leicht angewendet werden, um allgemeine adipösen Struktur zu analysieren, durch das Sammeln von Gewebe Autofluoreszenz Signal in den grünen Kanal. Wir haben bereits gezeigt, dass die Autofluoreszenz Signal in adipösen Überlagerungen günstig mit Perilipin Färbung, eine häufig verwend.......

Discussion

Adipo-Clear ist eine einfache und robuste Methode für das clearing von Fettgewebe, die leicht in eine reguläre Laboraufbau durchgeführt werden kann. Im Vergleich zu anderen lösemittelhaltigen Clearing-Methoden wie iDISCO / iDISCO +^10,11,12, Adipo-Clear ist besonders optimiert für das clearing von Fettgewebe und andere Gewebe mit hohem Fettgehalt. Der delipidierung Schritt vollständig entfernt Lipide aus Fettgewebe, und daher erl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichlormethan	Sigma Aldrich	270991
Wasserstoffperoxid 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzylether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Natriumazid	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycin	Fisher Scientific	BP381-1
Kaninchen polyklonale Anti-Tyrosin-Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 Verdünnung
Ziege polyklonal anti-CD31/PECAM-1	R& D Systems	AF3628	Endkonzentration von 2 & Mikro; g/mL
monoklonales Anti-CD68 der Ratte, Klon FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Endkonzentration von 2 & Mikro; g/mL
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Endkonzentration von 5-10 µ g/mL
Esel Anti-Ziegen IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Endkonzentration von 5-10 µ g/mL
Donkey Anti-Ratte IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Endkonzentration von 5-10 µ g/mL
Bildkammer	ibidi	80287
Lichtblattmikroskop	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Bildgebungssoftware	LaVision BioTec	Imspector Software Mikroskopie
Visualisierungssoftware	Bitplane	Imaris