Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv og skalerbar rettet differensiering av klinisk kompatibel hornhinnen Limbal epitel stamceller fra menneskelige Pluripotent stamceller

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58279
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen introduserer en enkel to-trinns metode for å skille hornhinnen limbal epitel stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller under xeno- og mater celle-fri kultur forhold. Metodene for celle-kultur presenteres her aktivere kostnadseffektive, storskala produksjon av klinisk kvalitet celler gjelder hornhinnen cellen terapi bruk.

Abstract

Hornhinnen limbal epitel stamceller (LESCs) er ansvarlig for kontinuerlig fornyelse hornhinnen epitel, og dermed opprettholde hornhinnen homeostase og visuell klarhet. Menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede LESCs gi en lovende celle kilde for hornhinnen cellen erstatning terapi. Udefinert, xenogeneic kultur og differensiering betingelser gi variasjoner i forskningsresultater og hindre klinisk oversettelsen av hPSC-avledet therapeutics. Denne protokollen gir en reproduserbar og effektiv metode for hPSC-LESC differensiering under xeno- og mater celle-gratis forhold. Først fungerer monolayer kultur udifferensierte hPSC rekombinant laminin-521 (LN-521) og definerte hPSC medium som grunnlag for robust produksjon av høy kvalitet starter materiale for atskillinger. For det andre, gir en rask og enkel hPSC-LESC differensiering metode LESC bestander i bare 24 dager. Denne metoden inneholder en firedagers overflate ectodermal induksjon i suspensjon med små molekyler, etterfulgt av tilhenger kultur fase på LN-521/kollagen IV kombinasjon matrise i definerte hornhinnen epithelial differensiering medium. Cryostoring og utvidet differensiering ytterligere renser celle befolkningen og lar bank cellene i store mengder for cellen terapi produkter. De resulterende høy kvalitet hPSC-LESCs gir en potensiell ny behandling strategi for hornhinnen surface rekonstruksjon å behandle limbal stamcelleforskningen mangel (LSCD).

Introduction

Gjennomsiktig hornhinnen ved okulær overflaten gjør lyset inn netthinnen og gir fleste øyets refraktiv makt. Det ytterste laget, lagdelt hornhinnen epitel, genereres kontinuerlig av limbal epitel stamceller (LESCs). LESCs ligge i basale laget av limbal nisjene på corneoscleral veikryss1,2. LESCs mangler spesifikke og unike markører, så deres identifikasjon krever en mer omfattende analyse av mulige markører. Epitel transkripsjon faktor p63, og spesielt N-terminalt avkortet utskrift av alpha isoformen av p63 (ΔNp63α), har blitt foreslått som en relevant positiv LESC markør3,4. Asymmetrisk fordeling av LESCs tillater dem til selv-fornye, men også produsere avkom overføre centripetally og peke. Som cellene fremgang mot hornhinnen overflaten de gradvis miste deres stemness og endelig terminalt skille overfladisk squamous celler som er kontinuerlig tapt fra hornhinnen overflaten.

Skade på noen av hornhinnen lagene kan føre til alvorlig synshemming og hornhinnen mangler er dermed en av de viktigste årsakene til synstap over hele verden. I limbal stilk cellen mangel (LSCD), er limbus ødelagt av sykdom eller traumer som fører til conjunctivalization og opacification av hornhinnen overflaten og påfølgende tap av syn5,6. Cellen erstatning terapi bruker autologous eller allogene limbal grafts tilbyr en behandling strategi for pasienter med LSCD4,7,8,9. Men høsting autologous grafts bærer en risiko for komplikasjoner for sunn øyet, og donor vev er en mangelvare. Menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs), spesielt menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), kan tjene som en ubegrenset kilde av klinisk relevante celletyper, inkludert hornhinnen epitelceller. Derfor representerer hPSC-avledet LESCs (hPSC-LESCs) en attraktiv ny cellen kilde for okulær cellen erstatning terapi.

Tradisjonelt har både metodene udifferensierte hPSC kultur og deres differensiering protokoller til LESCs stolt på bruk av udefinert mater celler, dyr sera, betinget media eller amniotic membraner10,11, 12 , 13 , 14 , 15. nylig innsats mot tryggere cellen terapi produkter har bedt om søk etter mer standardisert og xeno-fri kultur og differensiering protokoller. Resultatet er flere definerte og xeno-fri metoder for langsiktig kultur udifferensierte hPSCs nå tilgjengelige16,17,18. Som et kontinuum, rettet differensiering protokollene stole på molekylære signaler å hPSCs hornhinnen epithelial skjebne er nylig introdusert19,20,21,22, 23. Mange av disse protokollene brukt ennå enten udefinert, mater basert hPSCs som starter materiale eller komplekse, xenogeneic vekstfaktor cocktail for differensiering.

Formålet med denne protokollen er å gi en robust, optimalisert, xeno- og mater-fri hPSC kultur metoden og påfølgende differensiering å hornhinnen LESCs. Monolayer kultur pluripotent hPSCs på laminin-521 (LN-521) matrise i definerte, albumin-fri hPSC medium (spesielt viktig 8 Flex) tillater rask produksjon av homogen starter materiale for atskillinger. Etter en enkel, to-trinns Differensieringsstrategi guider hPSCs mot overflaten ectodermal skjebne i suspensjon, etterfulgt av tilhenger differensiering til LESCs. En celle befolkningen der > 65% express ΔNp63α oppnås innen 24 dager. Xeno - og mater-frie protokollen har blitt testet med flere hPSC linjer (både hESCs og hiPSCs), uten noen som helst krav for cellen linje bestemt optimalisering. Protokollene for helgen-free vedlikehold, passaging, cryostoring og hPSC-LESC phenotyping beskrevet her gjør produksjonen av store grupper av høykvalitets LESCs for klinisk eller forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Universitetet i Tammerfors har godkjenning av nasjonal myndighet for Medicolegal saker Finland (Dnro 1426/32/300/05) å gjennomføre forskning på menneskelige embryoer. Instituttet har også støtteerklæringer av etiske komiteen av Pirkanmaa sykehuset å utlede, kultur, og skille hESC linjer (Skottman/R05116) og bruke hiPSC linjer i ophthalmica forskning (Skottman/R14023). Ingen nye linjer var avledet for denne studere.

Merk: Protokollen beskrevet er basert på bestemt, kommersielt tilgjengelige hPSC og hornhinnen epitel differensiering media. Se Tabellen for materiale for Produsent/leverandør informasjon og katalog tall.

1. etablere Xeno - og mater-frie hPSC kultur

  1. Forberedelser
    1. Coat 24-vel plater med menneskelige rekombinant laminin-521 (LN-521). For den første mater-fri (FF) passasjen, bruke LN-521 ved en konsentrasjon av 1.09 µg/cm2og 0.55 µg/cm2 for følgende avsnitt. De foreslåtte LN-521 konsentrasjonene tjene som et utgangspunkt for vellykket FF kultur, men kan senkes.
      1. Tine LN-521 medisinglass sakte på 4 ° C som instruert av produsenten.
        Merk: Riktig håndtert LN-521 løsning kan lagres på 4 ° C i opptil 3 måneder etter tining.
      2. For å forberede belegg løsningen, fortynne riktig mengde LN-521 lagerløsning med 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered saltvann (DPBS) som inneholder Ca2 + og Mg2 + til et totalt volum på 300 µL per brønn.
      3. Pipetter belegg løsningen brønnene, forsegle godt platen med parafilm og ruge over natten på 4 ° C. Belagt plater kan lagres på 4 ° C 2 uker.
        (Valgfritt): eventuelt for en rask belegg protokoll, ruge bra plater med belegg løsning for 2t ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. Klargjør hPSC kultur medium (spesielt viktig 8 Flex) ved supplere basale medium med angitte supplement, som instruert av produsenten. Legge til 50 U/mL penicillin-streptomycin. Merk at utformingen er følsom for lys og høye temperaturer. Tine supplement og varme media ved romtemperatur (RT), beskyttet mot lyset. Bruk supplert hPSC mediet innen to uker etter tilskudd.
  2. Overføring av hPSC til FF kultur på LN-521
    1. Forvarm alle nødvendige materialer og reagenser til RT i laminær strømning panseret.
    2. Passasjen hPSCs fra standard kultur-systemet på mater lag (f.eks deaktivert menneskelige foreskin (hFF) eller mus embryonale fibroblaster) eller andre FF kultur systemer med standard metodikk. For eksempel kan hPSC kolonier kultivert på hFF mater celler være dissekert små biter med en skalpell og brikkene deretter enebolig med en pinne-spissen. Menneskelige PSCer kultivert bruker FF kultur systemer kan overføres ved hjelp av cluster passaging metoden med eller uten forutgående enzym behandling.
    3. Fjern LN-521 belegg løsningen fra 24-brønnene og tilsett 1 mL forvarmes hPSC medium per brønn.
      Merk: Ikke la brønnene tørke som LN-521 deaktiveres ved tørking.
    4. Overføre kolonien stykker/mobiltelefon klynger til LN-521 belagt 24-brønner i hPSC medium med en pipette. Overføring 20-30 kolonien stykker per Vel, unngå overbefolkning brønnene.
    5. Erstatt medium med 1 mL av hPSC medium dagen etter overføring og hver dag etter. Kulturer er klar for passaging 3-4 dager senere som hPSCs har vokst ut til kolonier med glatte, udifferensierte morfologi. For referanse, se figur 1B (første bildet). For første FF passering, koloniene bør ikke få lov til å vokse til en fullt confluent monolayer, men kulturene bør være passaged når kolonier når en tilnærmet størrelse 1 mm.
  3. Passaging og vedlikehold av FF hPSC kultur
    1. Forvarm alle nødvendige materialer og reagenser til RT i laminær strømning panseret.
    2. For andre FF passasjen og utover, passasje FF hPSCs når kulturen har nådd 80-100% confluency. Passasjen FF hPSCs til nye LN-521 belagt 24-vel plater med enkelt celle passaging to ganger i uken (på mandager og torsdager) å opprettholde høy kvalitet kulturer med udifferensierte morfologi og å oppnå helg uten fôring diett. For detaljer, se18,24,25.
      1. Skyll FF hPSCs to ganger med 1 mL 1 x DPBS uten Ca2 + og Mg2 +.
      2. Koble FF hPSCs med xeno-fri trypsin-EDTA (spesielt TrypLE Velg enzym) av rugende 500 µL per brønn ved 37 ° C, 5% CO2. For optimal inkubasjon tid, at cellene å runde opp, men ikke å løsne. Dette skjer vanligvis 3 min ved 37 ° C, 5% CO2 (ikke overstige 5 min).
      3. Fjern xeno-fri trypsin-EDTA og umiddelbart legge 500 µL per brønn av definerte trypsin inhibitor.
      4. Koble FF hPSCs av forsiktig, men likevel grundig pipettering for å få en enkeltcelle suspensjon. Overføre FF hPSC suspensjon gjennom en 40 µm celle sil i et 15 mL konisk sentrifuge rør som inneholder forvarmes hPSC medium.
      5. Vask brønnene med 1 mL av hPSC medium og legge til vask medium til 15 mL konisk sentrifuge røret.
      6. Sentrifuge enkeltcelle suspensjon i 5 min på 300 x g Sug opp cellen pellets og resuspend i 1 mL forvarmes hPSC medium.
      7. Telle celler med hemocytometer eller automatisert celle teller.
      8. Fjern LN-521 belegg løsningen (0.55 µg/cm2) fra 24-brønnene og legge hPSC medium som 1.2.3.
      9. Plate FF hPSCs på 0.55 µg/cm2 LN-521 belagt 24-brønner på en celle tetthet 40.000-50.000 celler/cm2.
      10. Erstatt medium med fersk hPSC medium dagen etter passaging, og hver dag etter unntatt søndager.
    3. Cellene er klar til å brukes for differensiering 3-4 dager etter passaging, når kulturen har nådd > 85% confluency. For å sikre den høye kvaliteten på hPSCs, se karakterisering metodene som er beskrevet i detalj i tidligere arbeider18,24,25. Det anbefales å bare kultur hPSCs opp til passasjen nivå 15 i FF systemet bruker enkeltcelle passaging for å unngå karyotypic endringer. Bare bruk høy kvalitet, udifferensierte hPSCs som starter materiale for atskillinger.

2. rettet differensiering og kryonisk bevaring av hPSC-avledet LESCs

  1. Forberedelser
    1. Forberede xeno uten basal induksjon medium (basale induksjon medium): Supplement Dulbecco endret Eagle's medium (spesielt KnockOut DMEM) med 15% xeno-fritt serum erstatning (spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-glutamin, 0,1 mM 2 - mercaptoethanol, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 50 U/mL penicillin-streptomycin. Bruk basale induksjon mediet innen to uker.
    2. Forberede medier for hornhinnen induksjon i suspensjon kultur.
      1. Dag 1: Supplement basale induksjon middels med 5 μM blebbistatin.
      2. Dag 2: Supplement basale induksjon medium med 10 µM SB-505124 og 50 ng/mL menneskets grunnleggende fibroblast vekst faktor (bFGF).
      3. Dag 3-4: Supplement basale induksjon medium med 25 ng/mL bein Morfogenetiske proteinet 4 (BMP-4).
    3. Forberede hornhinnen epitel differensiering medium (differensiering mellom, spesielt CnT-30) tilhenger kultur: legge kosttilskudd til basale middels i henhold til produsentens instruksjoner og legge til 50 U/mL penicillin-streptomycin.
      Merk: Differensiering middels formulering er følsomme for lys. Bruk supplert differensiering mediet innen 6 uker etter at tilskudd.
    4. Pels 100 mm vev kultur retter for tilhenger differensiering (se trinn 2.3) med en blanding av 5 µg/cm2 menneskelige placental kollagen type IV (col IV) og 0,5 µg/cm2 LN-521 fortynnet i 1 x DPBS som inneholder Ca2 + og Mg2 +, en totalt belegg volum 5 ml per fat. Forberede og lagre belegg med col IV og LN-521 som beskrevet i 1.1.1.3.
  2. Trinn I: hornhinnen induksjon i suspensjon kultur
    1. Forvarm alle nødvendige materialer og reagenser til RT i laminær strømning panseret.
    2. Koble FF hPSCs til enkelt celle suspensjon med xeno-fri trypsin-EDTA som beskrevet i trinn 1.3.2.1–1.3.2.6. Telle celler, og Distribuer 2-3 x 106 celler per lav vedlegg 6-vel plate også, i totale volumet av 3 mL basale induksjon middels med 5 μM blebbistatin å skape EB overnatting på 37 ° C, 5% CO2 (dag 1).
    3. På neste dag (dag 2), fjerne mediet og erstatte med 3 mL basale induksjon medium med 10 µM SB-505124 og 50 ng/mL bFGF.
    4. Følgende to dager (dager 3-4), fjerne mediet og erstatte med 3 mL basale induksjon medium med 25 ng/mL BMP-4.
  3. Trinn II: Hornhinnen differensiering i tilhenger kultur
    1. Forvarm alle nødvendige materialer og reagenser til RT i laminær strømning panseret.
    2. På dag 5, plate EBs ned på 100 mm vev kultur retter belagt med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521.
      1. Fjern belegg løsningen fra 100 mm vev kultur retter og tilsett 10 mL forvarmes differensiering middels per fat.
        Merk: Ikke la rettene tørke som LN-521 deaktiveres ved tørking.
      2. Overføre EBs fra en 6-vel plate også til to til tre 100 mm vev kultur retter (ca 50 EBs per cm2) av pipettering. Distribuere EBs jevnt ved forsiktig risting.
    3. Opprettholde cellene i tilhenger kultur ved 37 ° C, 5% CO2, erstatte mediet med 10 mL av fersk differensiering middels tre ganger per uke (på mandag, onsdag og fredag) for de neste 2,5-3 uker. Merk cellene regelmessig for fremveksten av riktig epithelial morfologi bruker fase kontrast mikroskop.
  4. Trinn III: Cryo-bank hPSC-avledet LESCs
    1. Forvarm alle nødvendige materialer og reagenser til RT i laminær strømning panseret, unntatt kryonisk bevaring mediet som bør bli pre kjølt.
    2. Løsne hPSC-avledet LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA og telle celler, som instruert for FF hPSCs trinn 1.3.2.1–1.3.2.6, men ved hjelp av differensiering medium.
      Merk: For hPSC-avledet LESCs, optimal inkubasjon tid med xeno-fri trypsin-EDTA er lengre (ca 5 min). Bruke 3 mL xeno-fri trypsin-EDTA og definerte trypsin hemmer per 100 mm parabolen.
    3. Etter å telle celler, gjenta sentrifugering i 5 min på 300 x g, Sug opp medium og resuspend celle pellet pre kjølt, xeno-fri hPSC kryonisk bevaring medium. Pipetter singelen celle suspensjon i cryotubes slik at hver cryotube inneholder 0,5 til 1 x 106 celler i 1 mL kryonisk bevaring medium.
    4. Plass rør i en fryser beholder overføring umiddelbart (innen 5 min)-80 ° c over natten.
    5. På dagen kan du overføre rør til flytende nitrogen for langtidslagring.
  5. Trinn IV: Tining cryopreserved hPSC-LESCs
    1. Før tining, pels retter/vel platene med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521.
    2. Forvarm alle nødvendige materialer og reagenser til RT i laminær strømning panseret.
    3. Fjern belegg løsningen fra retter/brønner og legge til riktig mengde forvarmes differensiering medium.
      Merk: Ikke la rettene tørke som LN-521 deaktiveres ved tørking.
    4. Tine cellene raskt på RT og øyeblikkelig overføre celle suspensjon slik 15 mL konisk sentrifuger som inneholder 5 mL av forvarmes differensiering medium.
    5. Sentrifuge celle suspensjon 5 min på 300 x g, Sug opp og resuspend pellet differensiering medium å fjerne ethvert kryonisk bevaring medium.
    6. Plate cellene på retter/brønner belagt med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521, differensiering medium på en tetthet av 40.000-50.000 celler/cm2. Opprettholde cellene på 37 ° C, 5% CO2, erstatte differensiering mediet tre ganger i uken.

3. phenotyping av hPSC-avledet LESCs

  1. Kvalitativ immunofluorescence analyse
    1. For immunofluorescence, pels 24 - eller 12-godt plate brønner med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521 og plate/tine hPSC-LESCs i differensiering medium på en tetthet på 40 000 – 50 000 celler/cm2.
    2. Når kulturer har nådd confluency, fikse cellene med 4% paraformaldehyde (PFA): vask brønnene to ganger med 1 x DPBS uten Ca2 + og Mg2 +og ruge 15-20 min med 4% PFA på RT. Deretter vaskes to ganger med 1 x DPBS å fjerne PFA rester. Bruk 0,5-1 mL av løsninger per brønn.
      Merk: Fast celler kan lagres i 1 x DPBS på 4 ° C i opptil en uke før flekker.
      Forsiktig: PFA er giftig og etsende. Håndtere PFA i avtrekksvifte og ha verneklær, vernebriller og hansker.
    3. Sug opp 1 x DPBS og permeabilize cellemembranene av rugende i 10-15 min med 0,1% Triton X-100 i 1 x DPBS.
    4. Sug opp 0,1% Triton X-100 og blokkere uspesifikke antistoff bindende områder av rugende 1t med 3% bovin serum albumin (BSA) i 1 x DPBS på RT. forberede primære antistoff fortynninger i 0,5% BSA på 1 x DPBS.
      Merk: Se tabell 1 for anbefalte primære antistoffer.
    5. Sug opp 3% BSA og Inkuber med riktig utvannet primære antistoff overnatting på 4 ° C.
    6. Vask brønnene 3 x i 5 min med 1 x DPBS. Klargjøre sekundære antistoff fortynninger i 0,5% BSA på 1 x DPBS.
      Merk: Se tabell 1 for anbefalte sekundære antistoffer.
    7. Sug opp 1 x DPBS og ruge med passende, riktig utvannet sekundære antistoff 1t på RT, beskyttet mot lyset.
      Merk: Dette trinnet på, holde prøvene beskyttet fra lys for å hindre falming av fluorescerende fargestoffer.
    8. Vask brønnene 3 x 5 min med 1 x DPBS og til slutt counterstain kjerner med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og montere med fluorescens montering media. DAPI kan brukes separat i henhold til produsentens instruksjoner eller inkludert i montering medium. Sted rundt coverslips (diameter 19 mm og 13 mm for 12 - og 24-godt plater, henholdsvis) i hver brønn. Følg produsentens instruksjoner om tørking og lagring av montert prøvene.
    9. Bilde farget cellene med fluorescerende mikroskop.
  2. Kvantitativ immunofluorescence analyse
    1. Forberede cytospin prøver av hPSC-avledet LESCs på objektet briller.
      1. Løsne hPSC-avledet LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA og telle celler, som beskrevet i trinn 2.4.2.
      2. Når du teller, legge pre kjølt 1 x DPBS og sentrifuge for 5 min på 300 x g. Juster eksempel volumet og celle konsentrasjon i henhold til produsentens anvisninger gitt cytocentrifuge, f.eks 50.000 – 100.000 celler i et eksempel volum på 150 µL.
      3. Spin celler til objektet glass med en cytocentrifuge f.eks 5 min på 28 x g og fastsette umiddelbart for 15-20 min med 4% PFA i 1 x DPBS på RT. For anbefalte spinning tid og hastighet, se brukerhåndboken for den gitte cytocentrifuge.
    2. Videre til farging cytospin prøvene som beskrevet i trinn 3.1.3–3.1.8 bruk flytende blokkering pennen surround-prøvene med en hydrofobe sirkel og gjennomføre den flekker i et slippverktøy for økonomisk praksis. Vasker kan utføres i beholdere med lysbildet holdere, for å sikre effektiv fjerning av overflødig antistoffer og minimal bakgrunn flekker. Counterstain kjerner med DAPI og montere farget prøvene med fluorescens montering media, dekker med coverslips. Følg produsentens instruksjoner om tørking og lagring av montert prøvene.
    3. Ta 5-10 bilder per prøve fra tilfeldig utvalgte steder bruker f.eks 10 X forstørrelse av fluorescens mikroskop.
    4. Anslå andelen positivt farget celler i forhold til totalt (DAPI positive) celler, f.eks med ImageJ Image Processing og analyse programvare (https://imagej.nih.gov/ij/). Fortrinnsvis analysere > 500 celler per prøve.
      1. Åpne bildet skal analyseres i ImageJ programvare. Kopiere bildet og filter med standard Gaussian blur å fjerne støy.
      2. Opprette en terskel. Juster til terskelverdiene optimalt utvalg av positivt farget celle kjerner, og bruke. Dupliserte bildet nå konverteres til en binær.
      3. Prosessen binære bildet med binære behandling verktøy "Fylle hull" og "Vannskille", som automatisk vil skille sammenslåtte områder som representerer én kjerner.
      4. Bruk verktøyet "Analyser partikler" til automatisk listen områder av interesser (ROIs) til Avkastningen manager-vinduet, som åpnes ved å bruke kommandoen. Lukk det binære bildet.
      5. Visualisere ROIs i originalbildet ved å velge "Vis alle" i Avkastningen Manager. Bekreft riktig valg av farget celle kjerner, og eventuelt manuelt fjerne og legge til personlige valg.
  3. Flyt cytometri analyse
    1. For å bekrefte p63α uttrykk nivåene, beis celler for flowcytometri.
      1. Løsne hPSC-avledet LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA og telle celler, som beskrevet i trinn 2.4.2.
      2. Vask cellene to ganger med 1 mL pre kjølt 1 x DPBS og sentrifuge for 5 min på 300 x g. fastsette og permeabilize med klar til bruk fiksering/permeabilization løsning for 20 min på 4 ° C. Etter vask cellene to ganger med 1 mL pre kjølt 1 x permeabilizing vaskebuffer.
        Merk: Dette trinnet på, holde cellene 4 ° C eller is, medmindre annet er opplyst.
      3. FORSIKTIG: Fiksering/permeabilization løsningen inneholder 4,2% formaldehyd. Håndtere farlig løsningen i avtrekksvifte og bruk verneklær, vernebriller og hansker.
      4. Dele opp prøvene i 5 mL polypropylen rør. Hvert utvalg må inneholde 100.000-200 000 celler og prøve volumet skal justeres til ca 100 µL av 1 x vaskebuffer.
      5. Legge til 2 µL fluorochrome konjugert p63-α FACS antistoff (for anbefalte antistoff, se tabell av utstyr og materialer) inn i prøven rørene. La ett utvalg unstained kvinne som negativ kontroll. Vortex prøvene og Inkuber 1t på RT, beskyttet mot lyset.
      6. Vask cellene to ganger med 1 mL av pre kjølt 1 x vaskebuffer og til slutt resuspend pellets med 300 µL av bufferen. Lagre rørene på is, beskyttet mot lyset.
    2. Analysere prøvene med en flyt cytometer. Bruk unstained kvinne negativ kontroll prøven gating av riktig celle befolkningen og unntatt fluorescerende bakgrunn signalet. Analysere minst 10.000 p63-α-farget celler. For detaljerte tekniske implementering, se brukerhåndboken for gitt flyt-cytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fra hPSCs til hPSC-LESCs

Hele prosessen fra inducing differensiering av FF hPSCs å cryostoring hPSC-LESCs tar rundt 3.5 uker. Skjematisk oversikt over metoden differensiering utheving nøkkel trinnene vises i figur 1A. Figur 1B viser typisk morphologies av celle populasjoner i ulike faser av protokollen. Dataene som presenteres er oppnådd med Regea08/017 hESC og UTA.04607.WT hiPSC linjen, både avledet og preget på Universitetet i Tammerfors, Finland, som beskrevet tidligere26,27,28.

På LN-521 i hPSC medium danner udifferensierte, høy kvalitet FF hPSCs første forskjellige koloniene med skarpe kanter, som Flett til homogen monolayers ved samløpet (figur 1B, første bildet). Flere individuelt avledet og genetisk distinkte hESC og hiPSC linjer ble vellykket tilpasset og kultivert med dette systemet. FF hPSC befolkningen multiplisere ca 3-fold innenfor hver passering, gir robust måte å generere xeno- og mater-fri starter materiale for atskillinger25. 24 h induksjon i EB medium vanligvis produserer en suspensjon av stramt, vanlig EBs av varierende størrelse (figur 1B, andre bildet). Under overflaten ectodermal induksjon i suspensjon (dag 2-4), bør EB morfologi ikke endre seg dramatisk. Koloniale utvekst vises snart etter EBs er belagt på col IV/LN-521 kombinasjon matrise i differensiering medium (figur 1B, tredje og fjerde bilder), og innen 21-25 dager av differensiering cellene danner confluent homogen lag med mangekantet morfologi typisk til epitelceller (figur 1B, femte bilde). Cellene kan da være cryostored for senere bruk. Levedyktighet og morfologi er godt bevart etter tining hPSC-LESCs (figur 1B, forrige bilde).

Vanligvis gi 3 x 106 FF hPSCs belagt til en enkelt 6-vel plate nok EBs å være belagt for tilhenger kultur i 2-3 celle kultur retter (100 mm). Fra hver 100 mm rett, kan 1 til 1,5 x 106 celler høstes for cryobanking av dag 22-25 av differensiering. Gjennomsnittlig genererer hver udifferensierte FF hPSC 0,7 celler dag 25 (figur 2).

Validering av hPSC-avledet LESCs

I fravær av spesifikke LESC markør proteiner bekreftes riktig celle fenotypen med et sett av indikatorer som viser nedgangen i uttrykk for pluripotency forbundet proteiner og økt uttrykk av anerkjente LESC markører. På dag 24 av differensiering, det store flertallet av hPSC-avledet LESCs express parvise boksen protein PAX6 (PAX6), den viktigste regulatoren av øye utvikling, samt p63α, anerkjent LESC markøren. Avkortet p63-isoformen ΔNp63 er co uttrykt i de fleste av p63α-positive celler, bekrefter mest hornhinnen-spesifikke ΔNp63α-positive celle fenotypen. Basal epithelial markører og antatte LESC markører cytokeratin (CK) -15 og CK-14 uttrykkes delvis mens pluripotent stamceller trådkorsmarkør OCT3/4 og modne hornhinnen epithelial CK-12 er undetectable på dette punktet. Angir differensieringen av FF hPSCs mot den unipotent limbal epiteliale forfedre, men ikke ennå terminal differensiering i eldre hornhinnen epitelceller. (Figur 3A) HPSC-LESCs beholde kunne sine fenotypen etter utvinning fra cryostorage (Data sammenlignes med figur 3A).

Etter 24 dager med differensiering, ΔNp63 ble uttrykt i 66.2% (n = 33, SD 9,3%) av Regea08/017 hESC-LESCs, og 65,7% (n = 10, SD 4,1%) Uta.04607.wt hiPSC-LESCs (kvantifisert fra cytospin prøver, figur 3B). Etter utvinning fra cryostorage, 82.2% (n = 10, SD 5,7%) av hESC-LESCs og 90,5% (n = 10, SD=3.7%) av hiPSC-LESCs uttrykt ΔNp63 (kvantifisert fra bra plater på dag 26-28, finne 3B).

Det p63α uttrykket ble ytterligere bekreftet med flyt cytometri analyse for Regea08/017 hESC-LESCs. På dag 25 av differensiering var 62% av de ferske differensiert hPSC-LESCs positivt på p63α. To dager etter utvinning fra cryostorage (dag 28 i totalt), var 81% av cellene p63α-positive (Figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: skjematisk illustrasjon av hPSC-LESC differensiering protokollen (A) og typisk celle morphologies observert i ulike faser i prosessen (B). EBs er dannet fra en enkelt celle suspensjon av høy kvalitet, udifferensierte hPSCs under første 24 h. tredagers små molekyl induksjon mot overflaten ektoderm i suspensjon etterfølges av tilhenger differensiering fase. Dag 24 av differensiering viser fleste cellene typiske LESC-lignende morfologi. Representant bilder vist for Regea08/017 hESC linje før og under differensiering. Svart skala bar = 200 μm, gyldig for alle bilder i panelet. Forkortelser: Blebb.: blebbistatin, SB: SB-505124 små molekyl hemmer, bFGF: grunnleggende fibroblast vekstfaktor, BMP-4: bein Morfogenetiske proteinet 4, LN-521: menneskelig rekombinant laminin 521, col IV: menneskelig placental kollagen type IV, hPSC: menneskelig pluripotent Stamcelle, EB: embryoid kroppen, LESC: limbal epitel stamceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: celle avkastning. Boxplots viser antall celler fått for cryostoring på dag 22-25 av differensiering, delt på antall udifferensierte hPSCs belagt EB formasjon trinn på dag 0. På gjennomsnittlig 0.72 (SD 0,4) celler ble produsert fra hver pluripotent Regea08/017 hESC, mens 0.78 (SD 0,67) celler ble produsert fra hver UTA.04607.WT hiPSC. n: antall differensiering eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Forventet fenotypen av hPSC-avledet LESCs. Immunofluorescence antistoffer merking (A) viser uniform uttrykk for øye utvikling regulator PAX6 og anerkjent LESC markører p63α og dens ΔNp63 isoformen, i tillegg til to andre foreslo LESC markører - CK15 og 14. Pluripotency trådkorsmarkør OCT3/4 og modne hornhinnen epithelial CK-12 er negative. Representant hvis bilder vises for Regea08/017 hESC-LESCs på dag 24 av differensiering. Skalere barer = 100 µm. (B) ΔNp63 celle teller fra ferske differensiert og cryostored hPSC-LESCs viser at cellene beholder ikke bare, men viser økt ΔNp63 uttrykk etter cryostorage. Cellen telling resultater Vis > 65% av de ferske differensiert hPSC-LESCs farget positivt for ΔNp63 før cryobanking prosedyren, og > 80% etter vellykket utvinning. n = antall separat differensiering eksperimenter (minst 600 celleområde regnes per prøve og > 1600 celler per punkt) (C) flyt cytometri analyse viser 62% av de ferske differensiert hPSC-LESCs og 81% av tinte cellene positivt for p63α, bekrefter cellen telling resultater for linje Regea08/017. * Angi tinte celler ABC. Rød histogrammet for positiv utvalget og svart for negative (unstained kvinne) prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Antistoff Verten Fortynning
Primære antistoffer for hvis
PAX6 kanin 1:200
p63α mus 1:200
ΔNp63α kanin 1:200
CK-15 mus 1:200
CK-14 mus 1:200
CK-12 geit 1:200
OCT3/4 geit 1:200
Sekundær antistoffer for hvis
Alexa Fluor 568 anti-geit Ig esel 1:800
Alexa Fluor 568 anti-musen Ig esel 1:800
Alexa Fluor 488 anti-kanin Ig esel 1:800
Alexa Fluor 488 anti-musen Ig esel 1:800

Tabell 1: anbefalt primære og sekundære antistoffer brukes til immunofluorescence (hvis) merking av hPSC-avledet LESCs. Se Tabellen for materiale for produsenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forventede resultatet av denne protokollen er vellykkede og robuste generasjon av LESCs fra en enkeltcelle suspensjon av FF hPSC innen ca 3,5 uker. Som corneal epitel utvikler seg fra overflaten ektoderm29, det første trinnet i protokollen tar sikte på styring hPSCs mot denne linjen. En kort 24 h induksjon med transformasjon av vekstfaktor beta (TGF-β) antagonist SB-505124, og bFGF brukes til å indusere ectodermal differensiering, etterfulgt av 48t mesodermal BMP-4 stikkordet å presse cellene mot overflaten ektoderm. Følgende tilhenger differensiering trinn på col IV/LN-521 kombinasjon matrise med kjemisk definerte differensiering medium brukes å fremme differensiering mot LESCs.

Høy kvalitet av utgangsmaterialet (FF hPSCs) er avgjørende for vellykket differensiering. Bare FF hPSC kulturer med nær samløpet og 100% av udifferensierte fenotypen bør brukes. Vanlige hPSC karyotyping anbefales som enkelt celle passaging disponerer hPSCs for karyotypic avvik som fører til vekst og differensiering fordeler30. Langvarig eksponering for trypsin kan føre utilstrekkelig EB formasjon eller hPSC død. Protokollen ble testet med fem individuelt avledet og genetisk distinkte hPSC linjer, både hESC og hiPSC. Det var ikke behov for cellen linje endringer til små molekyl konsentrasjoner eller induksjon ganger. Men under den innledende optimaliseringen av protokollen angitt overdreven celledød eller utseendet på celler med fibroblastic, neuronal eller andre morfologi differensiering til uønskede overleveringslinjer. I slike tilfeller kreve metoden finjustering. Kultur fartøyet formatene gir et utgangspunkt og kan bli oppskalert fra de anbefalte størrelsene.

Hele protokollen fra hPSC kultur LESC differensiering og kryonisk bevaring er definert, slik at enkel overgang til god produksjon praksis (GMP) for produksjon av cellen terapi produkter. Som kommersielle media og reagenser gjennomgå robust utvikling, produksjon og kvalitetssikring prosedyrer, gir de en konsekvent og ensartet kvalitet plattform for hPSC kultur og atskillinger. Definerte vilkårene minimere parti til parti variasjon, som gir en fordel over eksisterende hPSC-LESC differensiering protokoller10,11,12,13,14, 20 , 22 , 23. rask og relativt enkle protokollen gir også en fordel over tredimensjonale hornhinnen organoids som er vanskelig å standardisere over linjer og laboratorier, og krever robust metoder å rense ønsket celletyper31 ,32. I tillegg gir svært effektive protokollen robust betyr å produsere LESCs for forskningsformål, f.eks sykdom modellering, genteknologi, narkotikarelaterte screening og toksikologiske tester. Videre kan plattformen lett finjustert for differensiering av andre okulær epithelial celletyper som netthinnens pigment epitelceller (RPE celler)25.

Vellykket limbal celle erstatning terapi krever bare noen få tusen p63-positive LESCs4, per øyet, men kvalitetssikring krever ekstra celle populasjoner og derfor storskala produksjon. Cryobanking gjør utarbeidelsen av tilgjengelige celle aksjer for transplantasjon og kvalitet og sikkerhet testing. Videre, hPSC-LESC renhet forbedrer etter cryostoring, og videre etter passaging og langvarig kultur25, som foreslått av økt ΔNp63 uttrykk.

I sammendraget genererer denne robuste metoden ΔNp63α-positive celler fra hPSCs i 3.5 uker under xeno- og mater celle-fri kultur forhold. Metodene for celle-kultur presenteres her gjør produksjonen av høykvalitets LESCs gjelder okulær cellen terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Studien ble støttet av akademiet i Finland (bevilgning nummer 297886), menneskelige reservedeler programmet av Tekes, finsk finansiering Direktoratet for teknologi og innovasjon, finsk øyet og vev Bank Foundation og finske kulturelle Foundation. Forfatterne takker biomedisinsk laboratorium teknikere Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt og Outi Heikkilä utmerket kundestøtte og bidrag til cellekultur. Professor Katriina Aalto-Setälä er anerkjent for å gi hiPSC linjen brukes og BioMediTech Imaging Core anlegget for tilbyr utstyr for fluorescens bildebehandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ Gibco #14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ Lonza #17-512F/12
100 mm cell culture dish Corning CellBIND #3296 Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plate Corning CellBIND #3336 Culture vessel format for IF samples
24-well plate Corning CellBIND #3337 Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanol Gibco #31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachment Corning Costar #3471 Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-21202 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig ThermoFisher Scientific #A-21206 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat Ig ThermoFisher Scientific #A-11057 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-10037 Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) PeproTech Inc. #AF-100-18B Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution BD Biosciences #554722 Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences #554723 Washing buffer for flow cytometry
Blebbistatin Sigma-Aldrich #B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) PeproTech Inc. #120-05A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #A8022-100G
Cytokeratin 12 antibody Santa Cruz Biotechnology #SC-17099 Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibody R&D Systems #MAB3164 Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibody ThermoFisher Scientific #MS-1068-P Primary antibody for IF
CnT-30 CELLnTEC Advanced Cell Systems AG #Cnt-30 Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human) Sigma-Aldrich #C5533 Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing Container Sigma-Aldrich #BCS-405
CryoPure tubes Sarsted #72.380 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin Inhibitor Gibco #R-007-100
Essential 8 Flex Medium Kit Thermo Fisher Scientific #A2858501
GlutaMAX Gibco #35050061
Laminin 521 Biolamina #Ln521 Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibody BioCare Medical #4892 Primary antibody for IF
OCT3/4 antibody R&D Systems #AF1759 Primary antibody for IF
p63α antibody Cell Signaling Technology #ACI3066A Primary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) Cell Signaling Technology #56687 p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibody Sigma-Aldrich #HPA030775 Primary antibody for IF
Penicillin/Streptomycin Lonza #17-602E
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich #158127 Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific #P36931 DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific #A2644601
TrypLE Select Enzyme Gibco #12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco #10829018
KnockOut SR XenoFree CTS Gibco #10828028
MEM non-essential amino acids Gibco #11140050
SB-505124 Sigma-Aldrich #S4696
Triton X-100 Sigma-Aldrich #T8787 Permeabilization agent for IF
VectaShield Vector Laboratories #H-1200 DAPI mountant for liquid mounting for IF
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II Tharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 140 menneskelige embryonale stamceller menneskelige indusert pluripotent stamceller hornhinnen limbal epitel stamceller xeno-fri mater-fri små-molekylet induksjon regissert hornhinnen differensiering
Effektiv og skalerbar rettet differensiering av klinisk kompatibel hornhinnen Limbal epitel stamceller fra menneskelige Pluripotent stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hongisto, H., Vattulainen, M.,… More

Hongisto, H., Vattulainen, M., Ilmarinen, T., Mikhailova, A., Skottman, H. Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (140), e58279, doi:10.3791/58279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter