Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Zusammenfassung

Es war eine Herausforderung für die Wissenschaftler rekombinante sekretorischen eukaryotic Proteine für strukturelle und biochemische Studien zum Ausdruck bringen. Das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der Systeme verwendet, um rekombinante eukaryotic sekretorische Proteine mit einigen Post-translationalen Modifikationen auszudrücken. Die sekretorischen Proteine müssen durch die sekretorischen Wege für Protein Glycosylation, Disulfid-Bindungen-Bildung und andere Post-translationalen Modifikationen weitergeleitet werden. Um die vorhandenen Insekten Zelle Ausdruck von sekretorischen Pflanzeneiweiß zu verbessern, wird ein Baculovirus Expressionsvektor durch die Zugabe von entweder ein GP67 oder ein Hemolin Signal Peptidsequenz zwischen dem Veranstalter und Klonen von mehreren Seiten geändert. Dieses neu gestaltete modifizierte vektorsystem produziert erfolgreich eine hohe Ausbeute an löslichen recombinant sekretierten Pflanze Rezeptorproteine von Arabidopsis Thaliana. Zwei der zum Ausdruck gebrachten pflanzlichen Proteinen, die extrazellulären Domänen von Arabidopsis TDR und PRK3 Plasma Membranrezeptoren, wurden für x-ray kristallographische Untersuchungen kristallisiert. Das modifizierte vektorsystem ist ein verbessertes Werkzeug, das potentiell für die Expression rekombinanter sekretorische Proteine im Tierreich als auch verwendet werden kann.

Einleitung

Es ist unerlässlich für ein Forschungslabor in der Lage, große Mengen an homogene rekombinante Proteine für Biochemische und biophysikalische Charakterisierungen, speziell für x-ray kristallographischen Studien sein. Es gibt viele etablierte heterologen Expressionssysteme wie Escherichia coli, Hefe, Insektenzellen, Säugerzellen, Pflanzenzellen, etc. unter ihnen, das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der wichtigsten häufig verwendeten Techniken, große Mengen von strukturell gefalteten großformatigen rekombinante eukaryotic Proteine für Protein Kristallisation¹produzieren.

....

Protokoll

Hinweis: Eine Insekt Zelle/Baculovirus-System mit veränderten Expressionsvektoren sekretorischen Pflanze Proteinexpression und Kristallisation wird verwendet.

1. Änderung eines Baculovirus Ausdruck Vektors mit der GP67-Signalpeptid für Pflanze Proteinexpression Sekretion

1. Ein DNA-Fragment mit einer 5' BglII schneiden Seite¹³, die GP67 Sekretion Signalsequenz und eine Multi-Klonen Website mit NotI, BamHI EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI und XhoI (Abbildung 1A) zu synthetisieren.
   Hinweis: Da BglII und BamHI verdaut DNA führte in den gleichen Klebstoffen enden, der linearisie....

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden zwei modifizierte pFastBac1 Baculovirus Expressionsvektoren verwendet, um auszudrücken die sekretierten Proteine mit der GP67 oder der Hemolin Signalsequenz, die intrinsische Signalsequenz des Zielgens zu ersetzen. Die virale GP67 haben Insekt Hemolin Gene nachgewiesen und zu hohen Sekretion Ausdruck Niveaus in den Zellen haben. Fusionsproteine mit einem dieser beiden Signalsequenzen sollen Sekretion Ausdruck Ebenen verbe.......

Diskussion

Angesichts der Vielfalt in Größe und Stabilität von den Tausenden der Proteine in den biologischen Systemen vorhanden, ist es oft für eine Forschung empirische Labor zu entscheiden, welche heterologen Expressionssystem muss für den Ausdruck eines spezifischen Proteins gewählt werden. E. Coli Expressionssystems ist oft die erste Wahl für Protein-Expression durch die kurze Lebensdauer der Bakterien, low-cost der Nährmedien und relativer Leichtigkeit Scale-up¹⁹. Für den Ausdruck der großen e.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Inkubatorschüttler	VWR	Modell Excella E25	27 oC
Inkubator	VWR	Modell 2005	27 oC
Zentrifuge	BECKMAN	Modell J-6	mit einem Ausschwingrotor
Herculase II Fusion DNA-Polymerase	Agilent	600677-51	Für die PCR-Amplifikation von DNA-Thermocycler
	BIO-RAD	Modell C1000 Touch	Für die PCR-Amplifikation von DNA
Inkubatorschüttler	New Brunswick Scientific	Modell I 24	Für die Züchtung von Bakterienkulturen
Kunden-DNA-Synthese	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Restriktionsendonuklease
BglII	New England Biolabs	R0144S	Restriktionsendonuklease
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriktionsendonuklease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriktionsendonuklease
T4 DNA-Ligase	New England Biolabs	M0202T	DNA-Ligation
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	DNA-Aufreinigung aus Agorase-Gel
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid-DNA-Aufreinigung aus Bakterienkultur
Agarose	Thermo Fisher Scientific	15510-019	Für DNA-Gel-Elektropherose
MAX Efficiency DH5α competen cell	Invitrogen	18-258-012	Für die Transformation von DNA-Ligationsmischung
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	Zur Herstellung von Bakterienkulturen
Ampicillin-Natriumsalz	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotika
Kanamycinsulfat	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotika
Tetracyclin	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotika
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotika
MAX Efficiency DH10Bac kompetente Zellen	Thermo Fisher Scientific	10361-012	Zur Herstellung von Bacmid
DNA S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	Für die DNA-Transformation
CellFECTIN II Reagenz	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Reagenz zur Transfektion von Insektenzellen
Bac-to-Bac Expression System	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Baculovirus-Insektenzellen Expressionskit
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	Für die Isolierung von rekomminanter Bacmid-DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	Für die Isolierung von rekomminanter Bacmid-DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Baculorirus-Expressionsvektor
Sf9-Zellen	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 Monolayer-Zellen
Hi5-Zellen	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five Insektenzellen
Grace' s Insektenmedium, unergänzt	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 Zelltransfektion minimales Medium
Grace' s Insektenmedium, ergänzt	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 Monolayer-Zellkulturmedium
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 Suspension Zellkulturmedium ohne FBS
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 Zellkulturmedium
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10.000 I.E./ml)
L-Glutamin (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
FBS-zertifiziert	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
6-Well-Platten	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	150-mm-Platten mit flachem Boden
	Thermo Fisher Scientific	353025	100/Karton
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific	1415-2500	500 Röhrchen/Beutel
15 ml Zentrifugenröhrchen mit konischem Schraubverschluss	USA Scientific	1475-0511	25 Röhrchen/Beutel
50 ml Zentrifugenröhrchen mit konischem Schraubverschluss	USA Scientific	1500-1211	25 Röhrchen/Beutel
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA
Harz pH-Indikatorstreifen	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH-Wert 0 - 14