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Methodenartikel

Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper

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DOI:

10.3791/58285

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25. Oktober 2018

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1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Beschrieben, ist die Vorbereitung von Antigenen liposomalen Nanopartikeln und ihre Verwendung in anregenden B-Zell Aktivierung in Vitro und in Vivo. Konsistente und robuste Antikörperantworten führte zur Entwicklung eines neuen Modells der Erdnuss-Allergie. Das Protokoll zur Erzeugung von Antigenen Liposomen kann auf verschiedene Antigene und Immunisierung Modelle ausgedehnt werden.

Zusammenfassung

Antikörperantworten bieten wichtige schützende Immunität auf ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Es bleibt ein hohes Interesse bei der Schaffung von robusten Antikörper für die Impfung sowie wie pathogenen Antikörper verstehen, Antworten zu Allergien und Autoimmunkrankheiten zu entwickeln. Robuste Antigen-spezifischen Antikörper-Reaktionen zu erzeugen, ist nicht trivial. In Mausmodellen bedarf es oft mehrere Runden von Impfungen mit Adjuvans, die zu viel Variabilität in der Höhe der induzierten Antikörper führt. Ein Beispiel ist in Mausmodellen von Erdnuss-Allergien wo stabile und reproduzierbare Modelle, die Maus Zahlen und den Einsatz der adjuvanten minimieren vorteilhaft wäre. Präsentiert hier ist eine hoch reproduzierbare Mausmodell der Erdnuss-Allergie Anaphylaxie. Dieses neue Modell stützt sich auf zwei Faktoren: (1) Antigen-spezifische Splenocyten sind adoptively von einer Erdnuss sensibilisiert Maus übertragen, in eine naive Empfänger Maus, normalisieren die Anzahl von Antigen-spezifische B- und T-Zellen über eine große Anzahl von Mäusen; und (2) Empfänger Mäuse anschließend mit einem starken multivalente Immunogen in Form von liposomalen Nanopartikel, die Anzeige der wichtigsten Erdnuss Allergens (Ara h 2) gesteigert werden. Der große Vorteil dieses Modells ist die Reproduzierbarkeit, die letztlich die Anzahl der verwendeten Tiere in jeder Studie, bei gleichzeitiger Minimierung der Anzahl der Tiere erhalten mehrere Injektionen der adjuvanten senkt. Der modulare Aufbau dieser immunogenen Liposomen bietet relativ einfache Anpassungsfähigkeit zu anderen allergischen oder Autoimmun-Modelle, die pathogenen Antikörper beinhalten.

Einleitung

Nahrungsmittel-Allergie betrifft 8 % der Kinder in den Vereinigten Staaten, und stieg in der Prävalenz in den vergangenen zehn Jahren1. Allergie gegen Erdnuss betrifft 1 % der Kinder und ist nicht in der Regel entwachsen2. Obwohl mehrere vielversprechende klinische Studien sind im Gange für die Behandlung von Nahrungsmittelallergien, einschließlich oraler Immuntherapie (OIT), sublinguale Immuntherapie (SLIT) und Epicutan Immuntherapie (EPIT), gibt es derzeit keine FDA-zugelassene Behandlungsstrategien für die Desensibilisierung Erdnuss-Allergiker3,4,5,6,7,8. Daher müssen allergische Personen Allergene zur Vermeidung von Anaphylaxie strikt vermeiden. Es bleiben viele Fragen in Bezug auf Routen der Sensibilisierung und zugrundeliegende Mechanismen der Lebensmittel-Allergie-Entwicklung.

Maus-Modellen sind ein wertvolles Werkzeug für die Mechanismen der Allergie zu studieren sowie die Entwicklung neuer tolerogene und Desensibilisierung Therapien9,10,11,12. Dies gilt vor allem weil die großen Erdnuss Allergen (Ara h 2; Ah2) beim Menschen ist auch das dominierende Allergen in mehreren beschrieben Maus Modelle13,14. Während Mausmodelle der Erdnuss-Allergie bei der Untersuchung der Mechanismen der Sensibilisierung und Toleranz von unschätzbarem Wert sind, ist ein Nachteil, dass sie können variabel sein und erfordern den Einsatz von Hilfsstoffen. Potentere immunogenen wäre eine Möglichkeit, die innere Variabilität solcher Modelle zu minimieren. Da B-Zellen stark durch multivalente Antigene aktiviert sind, sind Antigene Liposomen anzeigen das Allergen eine gute Wahl wegen ihrer Fähigkeit, potentiell B-Zellen durch die B-Zell-Rezeptor (BCR) aktivieren, während auch die Eigenschaft des effizient Grundieren die T-Zell-Fach durch unspezifisch durch Antigen-präsentierenden aufgegriffen wird Zellen.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Konjugation Protein-Antigene, liposomale Nanopartikel mit einer einfache und modulare Strategie. Mit einem Ersatz-Antigen, Anti-IgM-Fab-Fragment, wir zeigen wie stark solche Antigenen Liposomen können in anregenden B-Zell-Aktivierung werden. Antigene Liposomen anzeigen Ah2 Antigen wurden verwendet, um ein neues Mausmodell der übertragenen Sensibilität zu entwickeln. In diesem Modell sind Splenocyten von verifizierten Erdnuss allergische Mäuse, mit Erdnuss-spezifische Speicher B- und T-Zellen, in naiven Congenic Mäuse übertragen. Speicher-Antikörper-Reaktionen werden durch Injektion von Liposomen in den Empfänger Mäuse, um Antikörper gegen Ah2 induzieren mit Ah2 konjugierten induziert. Gefolgt von nur einen Schub mit löslichen Ah2, geben Ah2-spezifische Antikörper Anlass zu einer starken anaphylaktischen Reaktion, wenn diese Mäuse anschließend mit Ah2 herausgefordert werden. Wie Mäuse durchläuft die allergische Reaktion sehr einheitlich reagieren und Adjuvans nicht erhalten haben, dieser Ansatz ist eine wünschenswerte Erdnuss-Allergie-Modell und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es in anderen getrieben durch Antigene gerichtet an Mausmodellen Dienstprogramm möglicherweise Allergene und möglicherweise Autoantigene.

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Protokoll

Die allgemeine Methode der Kupplung Protein, Lipid und Einbeziehung in Liposomen basiert größtenteils auf früheren Arbeiten15. Alle nachstehend beschriebene Tiere Verfahren wurden von der University of North Carolina in Chapel Hill institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt. Alle Mäuse in der Erdnuss-Allergie-Modell verwendeten sind BALB/cJ Weibchen gekauft von 3 Wochen alt. Die University of Alberta Tierpflege und verwenden Ausschuss (ACUC) genehmigte Experimente, die Verwendung von Maus Milz für ex-Vivo -Analyse von C57Bl/6 Mäusen von mindestens 6 Wochen alt.

(1) Konjugation von Protein Antigen pegylierten Lipid

  1. Eine 250 mL-Isolierflasche 3 g vernetztes Dextran Gel Perlen mit einer Fraktionierung Palette von 1.500 – 30.000 Dalton (Da) hinzufügen. Geben Sie 60 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS zu) und rühren Sie ständig mit einer magnetischen Stir Bar. Verschließen Sie die Flasche und befestigen Sie ein Vakuum, Entgasung auf einem Teller rühren für ein Minimum von 1 h zu initiieren.
  2. In einer Chromatographie-Glassäule 1,0 cm x 30 cm mit dem Umsatz-Stopper geschlossen PBS hinzufügen der Spalte zu waschen. Den Umsatz-Stopper öffnen und Entleeren der Spalte. Nach waschen, Hinzufügen der Spalte die Gülle von de-vergast Perlen. Ständig fügen Sie die Gülle bis die Spalte zu einer Perle-Höhe von ca. 24 cm verpackt ist.
  3. Sobald die Spalte ein "Kopf" von ca. 4 – 5 cm PBS über die gepackten Perlen hat, sind folgende Schritte bereit.
    1. Erstellen Sie einen Schwerkraft fließen Siphon durch Messung ein Stück Schlauch lang genug zu erreichen eine Regal 1 – 2 Füße über dem oberen Rand der Spalte und erstellen Sie eine Schleife, die am unteren Rand der Spalte fällt und beginnt wieder am Anfang der Spalte. Fügen Sie eine Umsatz-Stopper an einem Ende des Schlauches, verlassen einer Seite des geöffneten Schlauch. Legen Sie das offene Rohrende in einer 500 mL Flasche PBS und Platz auf dem Regal über der Spalte.
    2. Nehmen Sie das Ende mit dem Umsatz-Stopper und anbringen Sie eine 10 mL Spritze. Öffnen Sie Umsatz Stopfen Ventil Schlauch dran und ziehen Sie PBS durch das Rohr. Die PBS drei Viertel des Weges durch den Schlauch angekommen, schnell ziehen Sie die Spritze und den Umsatz-Stopper an die Spitze der Spalte hinzufügen – Flüssigkeit sollte auf die Säule laufen.
      Hinweis: Der "Kopf" des PBS links auf der Oberseite der Spalte sollte zwischen 1 und 3 cm betragen. Die minimale Menge um die Spalte zu waschen ist 3 Spalte Bände.
  4. Bestimmen Sie die Menge des Proteins (Mol) mit Lipid anhand seiner Molekulargewicht (MW) verknüpft werden.
    Hinweis: Das Fab-Fragment der Ziege Anti-Maus IgM (selbst eine IgG) dient hier als eine universelle Surrogat-Antigen für polyklonale Stimulation von B-Zellen. Entsprechend der Fab-Fragment der Ziege IgG hat ein MW ca. 48 KiloDalton (kDa) und ist im Handel erhältlich, in einer Gesamtmenge von 1,3 mg. Somit ist die Menge an Protein zu verknüpfenden 27.1 µmol.
  5. Die vom Aussterben bedroht-Koeffizient des Proteins des Interesses zu bestimmen. Wenn unbekannt, messen die Protein-Absorption bei 280 nm mit einem Spektrophotometer und Teilen der A-280 -Wert durch die Anzahl der Muttermale im Schritt 1.4 berechnet.
    Hinweis: Das Aussterben Koeffizienten von Fab Ziege IgG bei 280 nm ist 64.600 M-1.
  6. Um sicherzustellen, dass Spur Mengen von Amin-haltigen Puffer entfernt, entsalzen das Protein auf die Spalte erstellt in Schritten 1.1-1.3 und Proteinfraktionen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (~ 500 µL pro Fraktion) zu sammeln.
    1. Angeschlossen an die Spitze der Spalte Umsatz Stopfen Ventil schließen Sie und entfernen Sie den oberen Rand der Spalte. Wenn nicht bereits geöffnet, Umsatz Stopfen Ventil am unteren Rand der Spalte öffnen und warten, bis die "Haupt" der PBS oben auf die Perlen trifft.
    2. Fügen Sie langsam in das Protein des Interesses an die Spitze der mit einem Glas Perlen Pasteurpipette vorsichtig zu Störungen an der Spitze der Perlen zu minimieren hinzu.
    3. Der "Kopf" der Proteinlösung oben angekommen der Perlen hat, fügen Sie 1 mL PBS sanft über eine Pasteurpipette. Wiederholen Sie dreimal. Fügen Sie PBS um einen Kopf von 4 – 5 cm zu erstellen, und wiederholen Schritt 1.3 um die Spalte zu waschen.
      Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn feststeht, dass kein Amin-haltigen Puffer vorhanden ist.
  7. Bestimmen Sie die Fraktionen, die Eiweiß enthalten von A280 Messwerte und bündeln Sie die Fraktionen, die etwa 90 % Erholung des Proteins zu geben.
    Hinweis: Dies in der Regel verdünnt das Protein 1,5-2-Fach. Die Proteinkonzentration nach Zusammenlegung zu bestimmen. Konzentrieren Sie das Protein in diesem Schritt, gegebenenfalls unter Verwendung eines Zentrifugation Konzentrators.
  8. Das Protein 2,5 Molaren entspricht der Heterobifunctional-Vernetzer hinzufügen.
    1. Zunächst wiegen etwa 5 mg Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio) Propionat (SPDP, MW = 314 g/Mol) zu einem Microcentrifuge Schlauch. Bestimmen Sie die Lautstärke auf die SPDP aufzulösen, nehmen die molare Proteinkonzentration und multiplizieren Sie ihn mit 250 X 100 X Lösung generieren, die einem 2,5 Molaren Überschuß in der Reaktion geben wird.
      Hinweis: zum Beispiel wenn die Proteinkonzentration 50 µM ist, ist eine Lösung von SPDP bei 12,5 mM erforderlich. Dies entspricht 5 mg SPDP 1,27 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO).
  9. Das Protein des Interesses an einer 1: 100 Verdünnung SPDP hinzufügen. Legen Sie die Reaktion auf eine oszillierende Schüttler bei Raumtemperatur (RT) für ca. 1 h.
  10. Entfernen überschüssiges SPDP schützen die endogenen Disulfid Bond(s) des Proteins in den nachfolgenden Reduzierungsschritt, equilibrate und waschen Sie die Spalte erstellt Schritte 1.1-1.3 in 100 mM Natriumacetat (NaOAc) bei pH 5,5 oder erstellen Sie eine identische Spalte ausschließlich für den Gebrauch in diesem Puffer.
  11. Entsalzen Sie nach 1 h Inkubation mit SPDP das Protein an der Säule equilibriert in 100 mM NaOAc. Führen Sie diesen Schritt in identischer Weise als Schritt 1.6 außer mit 100 mM NaOAc (pH 5,5) als der Eluent. Sammeln Sie die Fraktionen, bestimmen Sie die A280und bündeln Sie die oberen Brüche. Waschen Sie die Spalte mit PBS-Puffer.
  12. Bereiten Sie eine Lösung von 2,5 M von DVB-t (MW = 154 g/Mol) doppelt destilliertes Wasser (DdH2O). Die gepoolte Brüche des Proteins für 5-10 min 25 mM DTT hinzufügen.
  13. Messen Sie die A280 des Proteins zu und teilen Sie dies mit dem Aussterben. Auch bestimmen Sie die A-343. Berechnen Sie die Verknüpfung Verhältnis basierend auf das Molarity des Proteins (ein280) und Linker (ein343).
    Hinweis: Schalten Sie die A340 Auto-Kalibrierung, wenn ein Spektralphotometer Nanodrop verwenden. Die343 Messung stellt die Absorption von Pyridin-2-Thion-Gruppe (vom Aussterben bedroht-Koeffizient = 7550 M-1), die aus der SPDP Vernetzer durch die DVB-t entfernt. Einem Molverhältnis von Linker: Protein-Verhältnis von 1,2 – 1,5 wird in der Regel erreicht, wenn die Reaktion mit einem 2,5 Molaren Überschuß der SDPD auf einer Vielzahl von Proteinen durchführen.
  14. Die Spalte gewaschen mit PBS-Puffer wie oben beschrieben überfahren Sie die gepoolten Brüche. Die Fraktionen zu sammeln, bestimmen die A280und pool Top Brüche. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins durch A280 nach Zusammenlegung der Fraktionen.
  15. Bereiten Sie DSPE-PEG (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Dies wird an das Protein im Verhältnis 10:1 molare hinzugefügt werden. Bereiten Sie 100 X Lager DSPE-PEG (2000)-Maleimide, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
    1. Beispielsweise wenn die Proteinkonzentration nach Schritt 1.14 10 µM ist, bereiten Sie einen Vorrat an DSPE-PEG (2000)-Maleimide bei 10 mM. Sorgfältig abwägen, DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/Mol) und den entsprechenden Betrag von DMSO hinzufügen. Mehrere Runden sanft aufschütteln und beschallen können es vollständig gelöst bekommen.
  16. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen der Fraktionen aus Schritt 1.14 und übertragen Sie die Lösung vorsichtig in eine kleine (10-25 mL) Runde untere Kolben (RBF). Fügen Sie den entsprechenden Betrag von 100 x DSPE-PEG (2000)-Maleimide mit dem Protein, eine 1 X 10-divisibel Molaren Überschuss, endgültige Konzentration zu erreichen. Vorsichtig schwenken die Lösung, um sicherzustellen, dass die DMSO vollständig dispergiert ist.
  17. Laufen Sie Reaktion über Nacht unter Stickstoff in einem versiegelten RBF. Verwenden Sie einer Gummiseptum und in einer Dampfhaube.
    1. Entfernen Sie die Atmosphäre durch Punktion das Septum mit einer 20 G Nadel einer Spritze 3 mL am Ende der Schläuche befestigt, um ein Vakuum zu, und aktivieren Sie Vakuum für 3 – 5 s.
    2. Ersetzen Sie die Atmosphäre mit Stickstoff. Füllen einen Ballon an einer 3 mL Spritze mit Stickstoff halbieren und eine 20 G Nadel befestigen. Stechen Sie das Septum um die Atmosphäre im Inneren der Rundboden-Küvette mit Stickstoff zu füllen. Die Entfernung von der Atmosphäre und Ersatz mit Stickstoff noch einmal zu wiederholen und den Stickstoff-Ballon über Nacht angeschlossen lassen.
  18. Bereiten Sie eine separate vernetztes Dextran Gel Perle Spalte mit einer Fraktionierung Palette von 4.000 – 150.000 Da in einem 1,0 cm x 50 cm Glas Chromatographiesäule (lt. Schritte 1.1-1.3).
  19. Am nächsten Tag entfernen das Protein aus der Rundboden-Flasche vorbereitet in Schritt 1.17 und ausführen (befolgen Sie die in Schritt 1.6 Methode) über die vernetzte Dextran Gel Perle Spalte (aus Schritt 1.18).
    Hinweis: Der Gesamtbetrag auf der Spalte laden sollte nicht mehr als 2 mL betragen. Wenn eine größere Reaktion verwendet wurde, zweigeteilt und laufen auf getrennten Spalten oder führen auf einen größeren Durchmesser-Spalte.
    1. Sammeln Sie die Fraktionen zu, bestimmen Sie die A280, Pool Top Brüche, und bestimmen Sie die Konzentration des Proteins zu. Das Vorhandensein von der Lipid wird keinen Einfluss auf die Messungen.
  20. Speichern der gepoolten Endkörnungen der Lipid-chromosomal Protein bei 4 ° C bis einsatzbereit.

(2) Liposomen-Vorbereitung

  1. Wiegen Sie die Lipide: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/Mol; Cholesterin (3 b-Hydroxy-5-Cholestene, 5-Cholesten-3 b-Ol), MW = 386,7 g/Mol; und DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol erstellen eine 5 mg/mL Lösung der DSPC, 4 mg/mL Lösung von Cholesterin und 2 mg/mL Lösung von DSPE-PEG(2000) in Chloroform.
  2. Sicherzustellen, dass das molare Verhältnis von Lipiden in den Liposomen: 57 % DSPC, 38 % Cholesterin und 5 % DSPE-PEG(2000), wie in Tabelle 1dargestellt.
    Hinweis: Es ist wichtig, die Menge des Antigens auf die Liposomen kontrollieren, die in der Regel von 0,01-0,1 reicht %. In Tabelle 1dient 0,1 % der Ziege Anti-Maus IgM Fab-Fragment mit pegylierten Lipid verknüpft. Es ist entscheidend für die 10-divisibel Molaren Überschuss der DSPE-PEG (2000)-Maleimide berücksichtigen, die hinzugefügt wurde, das Protein im Schritt 1.15, um sicherzustellen, dass der Gesamtbetrag der pegylierten Lipid 5 % nicht übersteigt.
  3. Bei der Erstellung Lipide für Extrusion, beachten Sie die abschließende Lipid-Beträge (µmol). Ein Beispiel zur Berechnung der molaren Lipid-Konzentrationen für die Erstellung von Liposomen in einer 1,25 µM insgesamt Lipid-Konzentration finden Sie unter Tabelle 1 .
  4. Sobald die richtige Menge an jeder Lipid, zusammengezählt werden berechnet wurde, verbinden Sie alles in einem Reagenzglas 12 mL Borosilikatglas.
  5. Sorgfältig die Chloroform Abblasen.
    1. Verwenden Sie den Schlauch und eine 3 mL Spritze mit Nadel, vorbereitet im Schritt 1.17.1, um sorgfältig Chloroform in der Röhre mit Stickstoff abzulassen. Wehen Sie sanft einen Strom von Stickstoff auf die Lösung und dreht das Rohr mit der anderen Hand. Achten Sie darauf, zu minimieren, Spritzwasser oder verursacht die Flüssigkeit Weg an der Seite des Schlauches zu laufen, wie es möglicherweise schwieriger, das in Lösung im nächsten Schritt bekommen.
  6. Jedes Rohr 100 µL von DMSO hinzufügen und diese Lösung über Nacht lyophilize. Decken Sie die Spitze des Rohres mit einem nicht-statische Labor abwischen, mit einem Gummiband befestigen und frieren Sie-80 ° C ein.

(3) Liposomen Extrusion

  1. Fügen Sie 1 mL PBS, enthält das Lipid-chromosomal Protein zu den 12 mL Röhrchen mit den Lipiden. Beschallen Sie die Lösung für ca. 30 s, 1 min im Wasserbad Beschallung. Pause für 5 min oder länger zwischen jeder Runde und 3 – 4 Mal wiederholen.
  2. Bereiten Sie einen Extruder, wie vom Hersteller gerichtet.
    1. Fügen Sie der Filter unterstützt die interne Membran-Unterstützung hinzu, legen Sie ein paar Tropfen (10 µL) PBS auf Paraffin-Film. Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich eine Kante der Filter Unterstützung und Tauchen sie in der Drop-10 µL.
    2. Setzen Sie den Filter in den o-Ring. Dies gilt für beide Seiten. Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich einen 0,8 µm Filter am Rande und Tauchen Sie in der Drop-10 µL und Mantel außen an den o-Ring mit PBS. Setzen Sie 0,8 µm Filter sanft auf den o-Ring so dass der Filter nicht mehr hängen die interne Membran unterstützt ein.
  3. Platzieren Sie den Extruder Heizung Block auf einer heißen Platte den Extruder Vorwärmen. Niedriger schalten Sie die heiße Platte ein und warten Sie den Extruder Block Heizung, um die gewünschte Temperatur zu erreichen. Um mögliche Probleme mit der Proteinaggregation zu vermeiden, nicht erhitzen Sie den Block letzten 37 ° C.
  4. Laden Sie die beschallte Probe in eines der Extrudieren Spritzen in den Extruder platziert. Legen Sie die Extruder-Spritze in das andere Ende des Extruders. Sicherstellen Sie, dass die leeren Spritzenkolbens auf Null gesetzt ist. Die leere Spritze füllt, wie das Lipid durch die Membran Polycarbonat 0,8 µm extrudiert wird. Versuchen Sie zu vermeiden, vorbei an Luftblasen Kreuz und quer durch die Membran.
  5. Legen Sie die fertig montierten Extruder in Heizblock. Schieben Sie den Kolben der Fertigspritze mit Lipiden, die leere Spritze. Abhängig von der Lipidkonzentration wird dies schwierig durchzusetzen sein. Wiederholen Sie 20 X.
  6. Entfernen Sie die fertig montierten Extruder aus Heizblock. Langsam ziehen Sie die gefüllte Spritze aus dem Extruder, achten Sie darauf, Lipide sammeln, die beim Entfernen austreten kann. Legen Sie die Liposomen in eine saubere Flasche. Wiederholen Sie die Schritte mit 3,4-3,6 Polycarbonat 0,2 µm und 0,1 µm Membranen.
  7. Erstellen Sie eine 0,7 x 50 cm2 vernetzte Agarose Bead Spalte mit Trennung zwischen 0,7-10 Mega Daltons (MDa) equilibriert mit PBS-Puffer. Fügen Sie die Liposomen hinzu und führen Sie wie in Schritt 1.6 aus. Brüche mit Liposomen werden Übertragung von Licht im Bereich von 250 – 400 nm gesunken.
  8. Die Liposomen bei 4 ° C zu speichern und nicht einfrieren.

4. Calcium Flux, B-Zell-Aktivierung von Antigenen Liposomen zu überwachen

  1. Mäuse von Kohlendioxid (CO2) oder Isofluran Überdosierung nach institutionellen Standardarbeitsanweisungen einschläfern. Bestätigen Sie Euthanasie von Mäusen durch zervikale Dislokation.
  2. Chirurgische Instrumente und Mäuse Karkasse mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Einsatz 10 cm lang, 0,8 mm Spitze gebogen Iris Zange um die Haut der Brusthöhle aus dem Brustkorb zu trennen. Verwenden Sie 10 cm lang, gerade Präparierscheren, um einen distalen Schnitt mit einem bilateralen Schnitt zu machen.
  3. Verwenden Sie gebogene Iris Zange und sezierenden Schere, um die Milz aus der Bauchhöhle zu extrahieren. Entfernen Sie Fettgewebe rund um die Milz zu und legen Sie sie in einem 15 mL Polystyrol konische Rohr gefüllt mit RPMI1640 Mittel mit 1 % fetalen Kälberserum (FCS) und Penicillin-Streptomycin.
  4. Transfer-Milz und Medien über ein Sieb 40 µm Zelle auf eine 50 mL konische Rohr angebracht. Mit dem Kautschuk-Ende des Spritzenkolbens ein 3 mL, sanft die Milz zu vernichten. Waschen Sie die 40 µm Zelle Sieb mit den Medien. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis nur das Fettgewebe in der 40 µm Zelle Sieb übrig ist. Spülen Sie das Sieb mit 3 bis 5 mL der Medien zur Zelle steigern.
  5. Zentrifugieren Sie Zelle Homogenat 300 X g für 5 min bei RT Nach Zentrifugation überstand verwerfen und das Pellet 10 mL 1 X RBC Lyse Puffer hinzufügen. Pipette rauf und runter, lassen Sie für 2 – 3 min. bei RT und anschließend Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei RT
  6. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie Erythrozyten erschöpft Splenocyten in 10 mL der Medien. Ergebniszelle Zahlen mit Hilfe einer Hemocytometer oder andere Zelle Zähleinrichtung zu bestimmen. Pellet-Zellen durch Zentrifugation wie oben beschrieben.
    Hinweis: Die ideale Endkonzentration notwendig für Indo-1 Laden der Splenocyten ist 10-20 x 106 Zellen/mL, aber eine geringere Konzentration der Zellen verwendet werden.
  7. Aufschwemmen Sie Splenocyten 15 x 106 Zellen/ml in Kalzium Flussmittel Ladepuffer (RPMI1640-haltigem Medium 1 % FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), 1 mM Magnesiumchlorid MgCl2, 1 mM Ethylenglykol-BIZ ( Β-Aminoethyl Äther)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA) und 5 % Penicillin-Streptomycin). Fügen Sie in 1,5 µM Indo-1 aus einem 1 mM DMSO-Stammlösung, invertieren die Röhre mehrmals um zu mischen. Vor Licht schützen und Zellen bei 37 ° C Wasserbad für 30 min inkubieren.
  8. Im Anschluss an die 30 min Inkubation in 5 x die Menge an Kalzium Flussmittel Ladepuffer hinzufügen. Zentrifuge bei 300 X g für 7 min bei RT.
  9. Färben Sie für die Anspritzung auf B-Zellen, Zellen mit 1: 200 Anti-Maus CD5-PE und Anti-Maus 1: 200 B220-PE/Cy7 in 0,5 mL Ladepuffer bei 4 ° C für 20 min, vor Licht geschützt werden.
  10. Waschen Sie Splenocyten im Kalzium Fluss laden Puffer und Zentrifuge bei 300 X g für 7 min bei RT Aufschwemmen Zellen um 10 – 20 x 106 Zellen/mL in Kalzium Flussmittel ausgeführt Puffer (Hank es ausgeglichen Salzlösung (HBSS) mit 1 % FCS, 1 mM MgCl2 und 1 mM Kalzium-Chlorid (CaCl2)). Speichern Sie auf Eis, bis bereit zu laufen auf Durchflusszytometer vor Licht geschützt.
  11. Setup-Durchflusszytometrie mit ungefärbten und einzigen Fleck Steuerelemente auf Schadensersatz.
    1. Führen Sie die gefärbten Zellen um die Tore entsprechend einzurichten (siehe Abb. 2A). Indo-1 (violett) im Vergleich zu Indo-1 (blau) Grundstück einrichten, anpassen die Spannungen in den Indo-1-Kanälen, die Zellen bei einer Neigung von 45 – 60 ° um das Signal zu maximieren Färbung zu platzieren: Rausch-Verhältnis von Indo-1 Violett: blaue Änderung im Verhältnis nach B-Zell-Stimulation.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Spannungen nicht zu hoch sind, dass ein erheblicher Prozentsatz der Zellen (> 5 %) sind gegen die Spitze des Plots.
    2. Erstellen Sie eine Diagonale Tor, das den oberen linken Teil (violett+Blau–) des Grundstücks, kapselt, dass ohne Stimulation < 10 % der Zellen sind in das Tor, das im Idealfall zu erhöhen sollte > 75 % nach Stimulation.
  12. Ein aufgestellter 5 mL Runde Polystyrol Unterrohr (Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Rohr) 0,5 mL Zellen hinzufügen und die Zellen auf 37 ° C für 3 – 5 min im Wasserbad erwärmen. Ort der FACS-Röhre in der 37 ° C wasserummantelten Kammer, die mit einem wiederverwendbares Wasserbad verbunden ist.
    1. Führen Sie das Rohr in die Waterjacket auf das Durchflusszytometer und Erwerb, ohne Speicherung der Daten, mit etwa 5.000 – 10.000 Veranstaltungen/s zu initiieren. Sobald die Zellen (15 – 30 s) stabilisiert haben, initiieren Erwerb und sammeln Daten für mindestens 10 s, den Hintergrund zu etablieren.
    2. Bei 10 s schnell entfernen Sie den Schlauch aus der Durchflusszytometer, fügen Sie die Stimulation (5-50 mM Antigenen Liposomen in 2 – 20 mL), Puls-Wirbel und FACS Rohr auf das Durchflusszytometer zurück. Erhalten Sie Datenerfassung und-Speicherung durch diese Zeit zu und sammeln Sie Daten für 3 – 5 Minuten.
  13. Analysieren von Daten in entsprechenden Analyse-Software unter die Kinetik-Funktionen.

5. Vorbereitung des Erdnussextrakt

  1. Erdnuss Proteine durch das Mischen von Erdnuss Mehl im Verhältnis 1:5 (Wt:vol) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 M Natriumchlorid (NaCl) zu extrahieren. Mischen Sie die Lösung auf magnetische rühren Platte für 2 h bei RT unter Beibehaltung bei pH 8,5.
  2. Zentrifuge Lösung bei 3.000 X g für 45 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie und sterilisieren Sie Filter-überstand nacheinander durch einen 0,4 µm-Filter, gefolgt von einem 0,2 µm-Filter. Proteinkonzentration von Bicinchoninic Säure (BCA) Assay mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard zu bestimmen.
  3. Reduzieren und eine Probe von Erdnuss Proteine mit 50 mM Dithiothreitol (DTT) in einem Puffer mit Lithium-Dodecyl-Sulfat bei einem pH-Wert von 8,4, ermöglicht eine maximale Aktivität des Reduktionsmittels und Wärme bei 70 ° C für 10 min denaturieren.
  4. Führen Sie 10 µg denaturierten Erdnuss Protein auf einem Bis-Tris 4 – 12 % vorgefertigt Polyacrylamid Gel entwickelt, um optimale Trennung gradient Gel mit Molekulargewicht Pre-standard gebeizt.
  5. Färben Sie das Gel mit Disulfonated Triphenylmethan und destain mit DdH2O. Identify bekannt großen Erdnuss Allergene Ara h 1, 2 und 3 im Extrakt Vorbereitungen. Ara h 1 erscheint am 63 kDa, Ara h 2 sollte erscheinen als zwei Isoformen in 17 und 19 kDa und Ara h 3 erscheint am 37 kDa (saure Untereinheit).

(6) Sensibilisierung von Mäusen, Erdnuss

  1. Cholera-Toxin 1 mg in 1 mL Reinstwasser aufzuwirbeln. Bereiten Sie 200 µL verdünnt Erdnuss-Extrakt enthält 2 mg Erdnuss Protein und 10 µg Cholera Toxin mit PBS-Puffer.
  2. 200 µL der Erdnuss-Extrakt mit Cholera Toxin (2 mg Erdnuss Protein und 10 µg Cholera Toxin) über orale Magensonde zu jeweils 4 – 5 Wochen alt BalB/cJ weibliche Maus zu verwalten. Wiederholen Sie einmal pro Woche für drei Wochen (d. h. Tage 0, 7 und 14).
  3. Verwalten Sie 300 µL verdünnt Erdnussextrakt (mit 5 mg Erdnuss Protein und 10 µg Cholera Toxin) über orale Magensonde zu jeder Maus in der vierten Woche (d. h. am 21. Tag).

(7) Herausforderung Mäuse mit Erdnuss-Extrakt

  1. Am 28. Tag bereiten Sie Erdnussextrakt, eine Endkonzentration von 1 mg/mL in PBS. Grundlinie Körpertemperaturen mit einem rektalen Thermometer (ca. 37,5-38,5 ° C) zu messen. Verabreichen Sie 200 µL (200 µg) des Erdnussextrakt über intraperitoneale (i.p.) Injektion.
  2. Messen Sie Körpertemperatur mit rektalen Thermometer alle 15 min für 1 h nach der Injektion. Ein erfrischendes Bad im Körpertemperatur zeigt Allergie gegen Erdnüsse.
    Hinweis: Hypothermie ist ein Markenzeichen der Anaphylaxie bei Mäusen. Diese Herausforderung wird zeigen, dass Mäuse auf Erdnüsse allergisch. In der Regel entwickeln 90 % von Mäusen Balb/cJ, die Sensibilisierung Protokoll unterzogen werden allergische Reaktionen während der Herausforderung durch mindestens eine 2 – 3 ° C Temperaturabnahme gekennzeichnet.

8. Isolierung des Splenocyten von allergische Mäuse und Adoptiv-Transfer

  1. Die Splenocyten von naiven und Erdnuss allergische Mäuse zu isolieren.
    1. Am Tag 30 einschläfern Sie naiv und bestätigten Erdnuss allergische Mäuse durch die Gabe von 3 L/min CO2 in einer Gaskammer. Bestätigen Sie Euthanasie von Mäusen durch bilaterale Thorakotomie. Chirurgische Instrumente und Maus Kadaver mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Verwenden Sie Zange um die Haut der Brusthöhle aus dem Brustkorb zu trennen. Einsatz direkt Präparierscheren um einen bilateralen Schnitt die linken und rechten Rippen brechen zu machen.
    2. Verwenden Sie sezierenden Schere und Zange um die Milz aus der Bauchhöhle zu extrahieren. Fettgewebe rund um Milz vor dem Einlegen in Polystyrol 15 mL konische Rohr, gefüllt mit 10 mL RPMI 1640 Medium zu entfernen.
    3. Gießen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Haube Milz und Medien in 35 mm Polystyrol Petrischale. Halten Sie naiv und allergische Splenocyten in separaten Petrischalen und Medien während Zelle isoliert. Verwenden Sie sterilisierte Pinzette und sezierenden Schere Milz in drei Stücke schneiden und zur Petrischale zurückkehren.
    4. Mit dem rauen, Milchglas Edge von zwei Glas-Objektträger, sanft zu homogenisieren (in RPMI) die Milz-Stücke bis weißen Gewebe zwischen den Folien übrig bleibt. Ändern Sie Folien zwischen den Gruppen.
    5. Übertragen Sie Zelle Homogenat von Petrischale durch ein 70 µm Zelle Sieb montiert auf einem 50 mL konische Rohr. Übergeben Sie die Fragmente der Milz durch das Sieb mit einem Kolben aus eine 1 mL Spritze. Spülen Sie das Sieb mit 5 mL RPMI Zelle Erholung zu maximieren. Filtrat Polystyrol 15 mL konische Rohr zu Zentrifuge (450 X g, 10 min, RT) zu übertragen.
    6. Aspirieren Sie überstand und fügen Sie Aufschwemmen Zelle Pellet in 2 mL roten Blutzelle Lysis Puffer (0,83 % Ammoniumchlorid in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,2). Mischen und 2 – 3 min. Fügen Sie 10 mL PBS - 2 % FBS und Zentrifuge bei 300 X g für 7 min bei RT bei RT inkubieren
    7. Waschen Sie die Zellen wieder mit 12 mL PBS - 2 % FBS komplett entfernen alle verbleibenden Ammoniumchlorid und Zentrifugieren bei 300 X g für 7 min bei RT erneut aussetzen Zelle pellet in 2 mL RPMI 1640 Medium. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer oder automatischen Hämatologie-Analysegerät.
  2. Mit einem 27 G 5/8-Zoll-Nadel auf eine 1 mL Insulin Spritze, intravenös injizieren, 15 x 106 allergische oder naiv Splenocyten extrahiert, wie oben beschrieben (in 200 µL) über das Heck Vene in naiv (unbeschichtete) Mäuse.

(9) Injektion von Mäusen mit Ara h 2 Antigenen Liposomen

  1. Bereiten Sie Ah2 Liposomen mit 0,1 % Ah2 auf 2,5 mM Lipid vor. Für die Berechnung der Proteinkonzentration, ist vom Aussterben bedroht-Koeffizient der Ah2 15.000 M-1. Verdünnen Sie Liposomen bis 300 µM in sterilen PBS.
  2. Eines Tages nach Adoptiveltern Übertragung (Tag 31) der allergischen oder naiv Splenocyten, intravenös injizieren 200 µL PBS oder Ah2 Antigenen Liposomen (300 µM) mit insgesamt 1,38 µg Ah2 über die Rute Vene von Mäusen BALB/cJ, die die Splenocyten in Schritt erhalten 8.2.

10. Boost und Herausforderung von Mäusen mit Ara h 2

  1. Zwei Wochen nach der Injektion mit Ah2 Liposomen, am Tag 45, verwenden eine tierischen Lanzette von 4 mm, um 50-200 µL Blut aus der mandibulären Kreuzung von der Maus zu sammeln. Blut in einem Serum-Separator-Rohr ohne Heparin zu sammeln; separate das Serum durch Zentrifugieren bei 6.000 X g für 15 min. verwenden die gesammelten Serum später nach Maß Antigen-spezifische Antikörper.
  2. Am Tag 46, zwei Wochen nach der Injektion von Mäusen mit Liposomen (Schritt 9.2) steigern Sie Mäuse durch eine i.p.-Injektion von 200 µL PBS oder 200 µg von löslichen Ah2 (gereinigt wie zuvor beschrieben16).
  3. Am Tag 60 sammeln Sie 50-200 µL Blut aus der mandibulären Kreuzung von der Maus zu, und verarbeiten Sie Blut zu, wie zuvor beschrieben.
  4. Am 61. Tag Herausforderung jeder Gruppe von Mäusen mit einer i.p.-Injektion von 200 µL von 300 µg lösliche Ah2. Gemessen Sie alle 15 min wie in Abschnitt 7 Körpertemperaturen mit rektale Sonde.

11. die Quantifizierung der Ara h 2-spezifischen IgE und IgG1 von ELISA

  1. Mantel einen 96-Well Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)-kompatible Platte mit 100 µL HSA-DNP (2,4-Dinitrophenyl-Hapten-konjugierte zu menschlichen Serum-Albumin, 20 µg/mL) für die Standardkurve oder Ah2 (5 µg/mL) für Serumproben in Schritten 10.1 und 10.3, gesammelt in verdünnt Beschichtung-Puffer (50 mM-Karbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6) bei 4 ° C über Nacht oder 37 ° C für > 1 h.
  2. Waschen dreimal mit 200 µL PBS-T (PBS mit 0,05 % Tween-20) und blockieren Brunnen mit 200 µL PBS-T mit 2 % BSA bei 37 ° C für > 2 h.
  3. Für Ah2-spezifischen IgE ELISA hinzufügen 50 µL IgE-Anti-DNP Standard (2 – 0,002 µg/mL, hergestellt aus 1:2 serielle Verdünnungen) oder Maus Serumproben (01:20 Verdünnung) und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Für Ah2-spezifische IgG1 ELISA hinzufügen 100 µL gereinigt IgG1-Anti-DNP Normen (2 – 0,002 µg/mL, hergestellt aus 1:2 serielle Verdünnungen) oder Maus Serumproben (Verdünnung 1: 500) und über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei 37 ° c inkubieren
  4. Waschen dreimal mit 200 µL PBS-T. Für Ah2-spezifischen IgE ELISA hinzufügen 100 µL Schafe Anti-Maus IgE (0,5 µg/mL) und Inkubation bei 37 ° C für 1 h. Für Ah2-spezifische IgG1 ELISA hinzufügen 100 µL HRP Goat Anti-Maus IgG1 (verdünnt 1:40,000 in PBS-T - 2 % BSA). Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
  5. Waschen dreimal mit 200 µL PBS-T. Für Ah2-spezifischen IgE ELISA, fügen 100 µL biotinylierte Esel Anti-IgG (0,5 µg/mL) Schafeund Inkubation bei 37 ° C für 45 Minuten. Ah2-spezifische IgG1 ELISA fahren Sie mit Schritt 11.7.
  6. Waschen dreimal mit 200 µL PBS-T. Ah2-spezifischen IgE ELISA fügen Sie hinzu, dass 100 µL neutral Avidin-Meerrettich-Peroxidase (z. B.NeutrAvidin-HRP 0,3 µg/mL) aufgeladen und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
  7. Fügen Sie 100 µL 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Substrat hinzu, inkubieren Sie 10-15 min oder bis Proben dunkelblau färben, dann fügen Sie 100 µL TMB-Stop-Lösung. Lesen Sie die Platte bei 450 nm.

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Ergebnisse

Konjugation des Proteins des Interesses mit DSPE-PEG(2000) nachgewiesen werden kann, indem man eine Verringerung mit einem Anstieg im Vergleich zu dem unconjugated Protein Molekulargewicht. Abbildung 1A zeigt eine repräsentativen Gel Anti-Maus IgM F(ab) Fragment Konjugation, PEG-DSPE, die eine 2 – 3-kDa-Bandshift für das denaturierte Protein zeigt. Beachten Sie, dass ca. 50 % des Proteins angezeigt wird geändert werden, das dürfte angesichts der Tatsache, das...

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Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden sind ein allgemeines Protokoll für die Konjugation eines Proteins, ein Lipid ermöglicht die Anzeige des Proteins auf liposomalen Nanopartikel. Für sehr große Multi-Untereinheit Proteine kann dieses Protokoll Dienstprogramm begrenzt. Die ideale Methode wäre die Einführung eines Site-spezifische Tags, mit dem ein Biorthogonal chemische Verknüpfungsstrategie verwendet werden können. Wenn das Protein rekombinant zum Ausdruck zu bringen, ist dies möglich mit verfügbaren standortspezifische Stra...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 und W81XWH-16-1-0303).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Modell 2110 FraktionssammlerBioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma Klasse 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimidAvanti 880126
ExtruderAvanti6100001 mL Spritze mit Halter/Heizblock
Filter 0,1 & Mikro; mAvanti610005
Filter 0,8 &Mikro; mAvanti610009
10 mm FilterhalterungenAvanti6100014
Glas RundkolbenSigmaZ100633
WendestopfenThermo Fisher ScientificP-301398
SchlauchThermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Sephadex G50 PerlenGE Life Sciences17004201
Sephadex G100 PerlenGE Life Sciences17006001
Hitzeinaktiviertes fötales KälberserumThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
1x Erythrozyten-LysepufferThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112ohne Calcium und Magnesium
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab Anti-MausIgM Jackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 Anti-MausIgM Jackson ImmunoResearch115-006-020
ErdnussmehlGolden Peanut Co.52127112% Fett hell geröstet, 50% Eiweiß
FütterungsnadelnCadence Science792022g x 1.5", 1.25 mm - gerade
Mikrosonde ThermometerPhysitempBAT-12
Rektumsonde für MäusePhysitempRet-3
Choleratoxin, von Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.100BAzidfreies
BCA-Protein-Assay-KitPierce23225
Karbonat-Bicarbonat-PufferSigmaC3041
TMB StopplösungKPL50-85-06
SureBlue TMB Mikrotiter-Peroxidase-SubstratKPL5120-0077
96-Well-Immulon 4HBX-PlatteThermo Scientific3855
Aufgereinigtes lösliches Ara h 2N/AN/Agereinigt wie in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Maus IgE anti-DNPGenaue ChemikalieBYA60251
Schaf anti-Maus IgEDie BindungsstellePC284
Biotinylierter Esel Anti-SchafIgG Genaue chemische JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRPThermoFisher Scientific31001
Maus IgG1 Anti-DNPGenaue chemischeMADNP105
HRP Ziege Anti-Maus IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL InsulinspritzenBD329412U-100 Insulin, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")
Superfrost ObjektträgerFisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1,0 mm
ACK Lysing Buffergibco by Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 mL
ZellsiebCorning35235070 μ m Nylon, weiß, steril, einzeln verpackt
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GeleInvitrogenNP0322BOX10 Gele
NuPAGE LDS Puffer, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 Vorgefärbt StandardInvitrogenLC5925500 & micro; L
NuPAGE MES/SDS Laufpuffer, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL

Referenzen

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