Vorrichtung zur Ernte Gewebe Microcolumns

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Ernte Nadeln, die verwendet werden, um voll-dicke Hautgewebe zu sammeln, ohne dass Spender Website Narbenbildung. Die Nadeln kombinierbar mit einer einfachen Sammelsystem Großserien-Ernte zu erreichen.

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt den Produktionsprozess für ein Laborgeräte, hergestellt aus Standardkomponenten, die verwendet werden, um Microcolumns von voll-dicke Hautgewebe zu sammeln. Die geringe Größe der Microcolumns kann die Spender Standorte schnell heilen ohne Entnahmestelle Narbenbildung, bei der Ernte voll dicke Gewebe ermöglicht die Einbeziehung aller zellulären und extrazellulären Komponenten von Hautgewebe, einschließlich verbunden mit tiefer dermalen Regionen und die Adnexe Hautstrukturen müssen die noch mit konventionellen Tissue engineering-Techniken erfolgreich wiedergegeben werden. Die Microcolumns kann direkt in Hautwunden erweitern Heilung angewendet werden, oder sie können als autologe Zellen/Gewebe-Quelle für andere Gewebe-engineering-Ansätze verwendet werden. Die Ernten Nadeln erfolgt durch Ändern der standard Kanülen, und sie allein für die Ernte von kleinen Mengen von Gewebe verwendet werden können oder gepaart mit einem einfachen Saug-basierte Auflistung System (auch aus handelsüblichen Laborbedarf hergestellt) für Großserien-Ernte um Studien in großen Tiermodellen zu erleichtern.

Einleitung

Autologe Hauttransplantationen ist die Hauptstütze der Wunde Reparatur, aber es ist begrenzt durch Spender Website Knappheit und Morbidität, führt zu gemeinsamen Anstrengungen in den letzten Jahrzehnten entwickeln neue Therapieoptionen zu ersetzen konventionelle Hauttransplantationen^1,2 . Wir vor kurzem entwickelt eine alternative Methode zur Ernte Haut um die Vorteile der voll-dicke Hauttransplantationen zu nutzen, bei gleichzeitiger Minimierung der Spender Website Morbidität. Durch das Sammeln von voll-dicke Haut in Form von kleinen (~0.5 mm Durchmesser) "Microcolumns", Spender Websites sind in der Lage, schnell und ohne Narben unter normalen Umständen zu heilen (für mögliche Ausnahmen siehe Abschnitt Diskussion)³. Microcolumns können direkt in die Wunde Betten Wundverschluss zu beschleunigen, reduzieren Kontraktion³angewendet werden, und wiederherstellen den unterschiedlichsten epidermalen und dermalen Zelltypen und Adnexe Funktionsstrukturen⁴, von denen viele in fehlen konventionelle Split-Dicke Hauttransplantation oder aktuelle biotechnologisch Haut Ersatz⁵. Die Fähigkeit der Microcolumns um Heilung zu erweitern und ihre Spender Websites ohne Narbenbildung heilen wurden beide unabhängig validiert durch weitere Forschung Gruppen^6,7.

Zuvor haben wir ein Labor Erntesystem um die Sammlung von Microcolumns bei Skala⁸zu ermöglichen; Allerdings besteht dieses System aus vielen kundenspezifischen Komponenten, die nicht allgemein verfügbar sind. Hier beschreiben wir im Detail den Prozess für die Herstellung von Nadeln sowie einfache Sammelsysteme, die Ernte von meist handelsübliche Komponenten gebildet, die verwendet werden, um Volumen-Ernte zu erreichen. Der Apparat beschrieben in diesem Manuskript ist geeignet für in-vitro- und tierische Arbeit, aber nicht für den Einsatz beim Menschen. Eine klinische Gerät mit FDA-Zulassung für die Anwendung dieser Technik in den Menschen ist im Handel erhältlich, aber nicht hier im Detail besprochen werden.

Protokoll

Alle Arbeiten mit lebenden Tieren und tierischen Gewebeproben vom Massachusetts General Hospital institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden.

(1) Produktion der Ernte Nadeln

1. Setup der Produktionsphase
   1. Sichern Sie einen weiblichen Luer Lock Anschluss auf einen Beitrag zu, und montieren Sie die Post auf einem Drehtisch, so dass die Luer-Lock in der Mitte der Bühne (Abb. 1A) ist.
   2. Diese erste Rotationstisch senkrecht, und montieren Sie ihn senkrecht auf eine zweite, horizontale Drehung Bühne (Abbildung 1B).
   3. Montieren Sie die horizontale Drehung Bühne auf einem zweiachsigen Verschiebetisch (Abbildung 1B).
   4. Befestigen Sie die Kombination auf eine stabile Unterlage, z. B. eine optische Steckbrett.
   5. Montieren Sie separat ein rotierendes Werkzeug auf dem gleichen Steckbrett mit dem Werkzeug parallel mit dem Steckbrett und in etwa die gleiche Höhe wie der Luer Lock Anschluss auf die Kombination Rotation/Verschiebetisch (Abbildung 1C) positioniert.
   6. Installieren Sie zwei Trennscheiben konzentrisch auf das Drehwerkzeug (ein kleiner, niedriger Körnung Diamant Trennscheibe über eine größere, höhere Körnung Stein Trennscheibe) (Abbildung 1D).
      Hinweis: Über eine 9 mm ist Unterschied zwischen den Durchmessern der beiden Räder in der Regel ausreichend.
   7. Stellung ein Overhead-Licht Quelle mit einem verstellbaren Arm über das Drehwerkzeug mit dem Licht, die darauf abzielen, die Schneidräder.
   8. Zur Verbesserung der Visualisierung positionieren Sie eines sezierenden Mikroskop über die Produktionseinrichtung so, dass das Okular auf die Schneidscheiben (Abbildung 1C) ausgerichtet ist.
      Hinweis: Alternativ können Benutzer vergrößernde Brillen tragen.
2. Neugestaltung der Nadelspitze
   1. Tragen Sie Schutzbrillen und einen Mundschutz zu verhindern, dass feine Metallteilchen in die Augen oder Atemwege.
   2. Wählen Sie Injektionsnadeln der entsprechenden Größe, basierend auf experimentellen Anforderungen messen.
   3. Markieren Sie die gewünschte Länge auf jede Ernte Nadel.
      Hinweis: Für die Ernte von Schweinen Haut, sind 8 mm Nadeln in der Regel ausreichend; Obwohl die Länge variieren basierend auf experimentellen Anforderungen (zB., Dicke der Haut Zielgewebe, Gauge Nadel). Im Allgemeinen eignet sich eine 19-Gauge-Nadel für Schweine Haut.
   4. Niedriger markiert die Nadel senkrecht zur Drehwerkzeugs unter Spannung, mit der Kante der äußeren Trennscheibe, schneiden Sie die überschüssige Länge der Nadel an der Stelle im Schritt 1.2.3.
   5. Verbinden Sie die verkürzte, stumpfe Nadel mit dem weiblichen Luer Lock Anschluss auf die Produktionsphase.
   6. Einstellen Sie die horizontale Drehung Bühne so, dass die Nadel in einem 12° Winkel parallel zur Schneidscheiben auf das Drehwerkzeug ist (Änderung des Winkels den Kraftaufwand zum Einführen der Nadel auswirkt).
   7. Schalten Sie den Overhead-Licht und stellen Sie seine Position unter Beachtung der Nadel unter Vergrößerung, bis das Licht der Mittellinie (längs) der Nadel reflektiert wird.
   8. Schalten Sie das Drehwerkzeug, dann benutze die Verschiebetisch, die Nadel nach innen (Diamant) schneiden Scheibe (Abb. 2A) zu gelangen.
   9. Halten Sie die Nadel langsam gegen die Trennscheibe voran, bis die Trennscheibe etwa die Mittellinie der Nadel (als visualisierte durch das Deckenlicht Reflexion entlang der Mittellinie) erreicht.
   10. Bewegen Sie langsam die geschnittenen Nadel-Oberfläche aus der inneren Diamantscheibe auf Stein Außenrad auf den Schnitt Nadel Oberfläche mit einer feineren Politur (Abbildung 2B).
   11. Ziehen Sie die Nadel von der Trennscheibe.
   12. Mit der vertikalen Rotationstisch, drehen Sie die Nadel 180°.
   13. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.9-1.2.10 um die andere Seite der Nadel umzuformen.
       Hinweis: Die Nadel müsste nun zwei Schneidspitzen etwa gleichlang (Abbildung 2 und 2D).
   14. Entfernen Sie die Nadel aus der Produktionsphase.
   15. Saubere Bohrung innen mit einem Metallgitter, die etwas kleiner als die Nadel Innendurchmesser.
   16. Mit einem scharfen Holzstab (zB., vom Ende des kleinen Holzstab auf einem Baumwolle Spitze Applikator Abknicken), entfernen Sie Grate, die noch an den Rändern der neu geformten Nadel angebracht werden können.
       Hinweis: Ernte Nadeln können elektropoliert und von Autoklaven sterilisiert werden, falls erforderlich.

2. Haut Gewebe Ernte

1. Verwenden Sie die Ernten Nadeln Haut Microcolumns von ex-Vivo -Gewebe oder lebende Tiere zu sammeln.
2. Für ex-Vivo Haut Gewebe, das ist dünn (vor allem aus Proben, wo das subkutane Fett fehlt oder getrimmt wurde entfernt), halten das Zielgewebe über die Öffnung eine 50 mL Zentrifugenröhrchen, oder Stapeln zwei Stücke des Gewebes übereinander, um eine Beschädigung der n Eedle Tipps von schlagen sie gegen die harten Oberflächen.
   Hinweis: Für die in Vivo Ernte von lebenden Tieren, wird empfohlen, dass lokale Lidocain und Epinephrin durch intradermale Injektion für Analgesie und Blutungen zu verringern verabreicht werden.
3. Montieren Sie die Ernte Apparat nach der Höhe des Microcolumns benötigt, wie unten beschrieben.
4. Niedrige mittlere Volumen Option:
   1. Um kleine bis mittlere Mengen von Microcolumns zu ernten, füllen Sie einfach eine standard-Spritze (10-20 mL Spritzen in der Regel gut funktionieren) mit normalen Kochsalzlösung und verbinden Sie es mit einer Ernte Nadel.
   2. Vollständig Ernte Nadel in die Haut der Spenderin, dann es zurückziehen.
   3. Drücken Sie den Kolben der Spritze zu spülen Kochsalzlösung durch die Ernte Nadel und vertreiben die Microcolumn, die in der Nadel Bohrung eingereicht wird.
   4. Um die Ernte zu beschleunigen, wiederholen Sie Schritt 2.4.2 3-bis 5-Mal vor der Vertreibung der Microcolumns im Schritt 2.4.3.
      Hinweis: Es ist in der Regel bequem zu vertreiben die Microcolumns in eine Standardzelle Sieb um die anschließende Sammlung von Microcolumns zu erleichtern.
   5. Wenn Nadeln verstopft werden, erhöhen Sie den Druck auf den Kolben stecken Gewebe zu vertreiben und die Verstopfung entfernen. Wenn einfach Druck nicht ausreicht, Bohrung einfügen ein Metalldraht durch die Nadel Spitze Öffnung, die Verstopfung in der Nadel zu löschen.
   6. Halten Sie die Microcolumns eingetaucht Kochsalzlösung oder mittlere bis um Austrocknung zu verhindern.
      Hinweis: Mit einem erfahrenen Betreiber die oben beschriebene Methode lässt sich Microcolumns mit einer Rate von ungefähr 1 Microcolumn pro Sekunde zu ernten.
5. Hohes Volumen Option:
   1. Erstellen Sie eine einfache Saug-gestützte Vorrichtung, die konstruiert werden kann, um die Sammlung von großen Mengen an Microcolumns zu erleichtern.
      Hinweis: Das Gerät besteht aus einer Ernte Nadel, 20 mL-Spritze mit Luer Lock Düse, Saug-Adapter in der Regel verwendet für Fettabsaugung(Abbildung 3)und sterile Absaugkanister.
   2. Entfernen Sie den Kolben aus der 20 mL Spritze.
   3. Legen Sie die Spritze auf einen Saugnapf-Adapter.
   4. Vervollständigen Sie die Versammlung durch das Anbringen einer ernten Nadel der Spritze (Abbildung 3B).
   5. Verwenden Sie ein Stück steril Saug Schlauch zum sterilen Absaugkanister saugen-Adapter herstellen. Stellen Sie sicher, dass die Ernte Apparat mit einem Kanister-Eingang verbunden ist, die Flüssigkeit in den Behälter ungehindert fließen (die Verbindung mit einem Kanister-Port, die für Abfluss anstatt Zufluss gekennzeichnet ist erfordern) ermöglicht.
   6. Schließen Sie das Gerät an eine Unterdruck-Quelle.
      Hinweis: Der erforderlichen Druck hängt Nadel Durchmesser und Länge, wie zuvor beschrieben⁸. Für das Gerät in diesem Manuskript beschrieben ist die Absaugung in typischen OP-Säle gefunden in der Regel ausreichend.
   7. Verbinden Sie eine Ernte Nadel der Spritze.
   8. Ernten Sie die Microcolumns durch die Ernte Nadel in die Haut.
      Hinweis: Die Microcolumns wird in die Spritze abgesaugt und dann in den Absaugkanister gespült.
   9. Zeitweise Tauchen Sie die Ernte Nadel in einen Behälter mit steriler Kochsalzlösung während der Ernteverfahren, das System zu spülen.
      Hinweis: Diese saline Flush erleichtert Transport von der Microcolumn und stellt sicher, dass sie bleiben hydratisiert. Alternativ kann ein MFR Luer-Adapter mit dem Luer-Lock der Spritze und durch eine Verbindung Schlauch, auch zu einem hängenden saline Tropf Beutel angeschlossen werden.
   10. Halten Sie einerseits einen Metalldraht oder Messen Sie kleinere Nadel, das ist etwas kleiner als die Ernte Nadel Innendurchmesser. Wenn die Nadel verstopft, kann es durch Einfügen der Metalldraht in die Nadel Bohrung gelöscht werden.
   11. Wenn die gewünschte Menge an Microcolumns in dem Behälter angesammelt haben, trennen Sie das Gerät von Saug-, dann gießen Sie den Inhalt des Absaugkanister, durch einen Filter, um die Microcolumns zu sammeln.
6. Gelten Sie nach der Ernte eine topische Antibiotika Salbe über die Spender-Websites.
   Hinweis: Weitere Verbände sind in der Regel nicht erforderlich für Spender Websites.

Ergebnisse

Die Ernten Nadeln sollen Microcolumns von voll-dicke Hautgewebe mit ca. 80-90 % Erfolgsrate zu sammeln, und jedes Microcolumn sollte enthalten, Epidermis, Dermis und einige Fettpölsterchen (Abbildung 4). Wenn die Erfolgsquote bei der Ernte niedrig ist, oder wenn es schwierig wird, legen eine Nadel in das Gewebe, wird eine neue Nadel wahrscheinlich benötigt. Wenn die Erfolgsrate für die Ernte konstant niedrig, sogar mit neuen Nadeln ist, sind die Nadeln wahrsc...

Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden sollen die Sammlung von Gewebe Microcolumns in ausreichenden Mengen für in Vivo große tierexperimentellen Studien mit Werkzeugen aus handelsüblichen Laborbedarf zu ermöglichen. Dieses Gerät hat früher bei der Ernte Gewebe aus ausgeschnittenen Menschenhaut^4,9 , sowie live Schweine Haut³. Die einzelnen Parameter beschrieben sind diejenigen, die am besten geeignet für den Einsatz bei Schweinen zu finde...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Diamantscheibe	Dremel	545
Injektionsnadel (19G)	Fisher Scientific	14-840-98	Andere Nadelgrößen können verwendet werden, je nach experimentellem Bedarf
Steinrad	Dremel	540
Spritze (20mL mit Luer-Lock)	Fisher Scientific	22-124-967
Absaugadapter	Tulip Medical	PA20BD	Optional, für die Ernte großer Mengen
Saugkanister	Fisher Scientific	19-898-212	Optional, für die Ernte in großen Mengen. Vor Gebrauch sterilisieren.
Saugschlauch	Medline	DYND50216H	Optional, für die Ernte großer Mengen