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Methodenartikel

Analyse der Epididymal Protein-Synthese und Sekretion

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DOI:

10.3791/58308

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25. August 2018

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1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier berichten wir über die Immunfluoreszenz-Lokalisierung von Dynamin, die Protokolle für den Nachweis von Proteinen in Paraffin-eingebetteten Maus epididymal Abschnitten und derjenigen einer epididymal immortalisierte Zelllinie (mECap18) zu illustrieren. Wir beschreiben auch die Protokolle für die Isolierung von sekretorischen Proteine aus epididymal Flüssigkeit und konditionierten Zelle Medien.

Zusammenfassung

Der Säugetier-Nebenhoden erzeugt eines der komplexesten Intraluminal Flüssigkeiten endokrine Drüse um die Post-Hoden Reifung und Lagerung von Spermien zu unterstützen. Diese Komplexität entsteht aufgrund der kombinierten sekretorischen und absorptive Aktivität der epithelialen Zellen Futter. Hier beschreiben wir die Techniken für die Analyse der epididymal Protein-Synthese und Sekretion durch die Konzentration auf die Modell-Protein-Familie von Dynamin (DNM) Mechanoenzymes; großen GTPasen, die das Potenzial haben, Bi-direktionale Membran Menschenhandel Veranstaltungen zu regulieren. Für die Untersuchung von Protein-Expression in epididymal Gewebe beschreiben wir robuste Methodik für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Zielproteinen in Paraffin-eingebetteten Abschnitten und die spätere Erkennung der räumlichen Verteilung dieser Proteine über Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Wir beschreiben auch optimierte Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von exosom wie Bläschen, bekannt als Epididymosomes, die in der epididymal Lumen zur Teilnahme an interzelluläre Kommunikation mit Reifen Spermien abgegeben werden. Als einen komplementären Ansatz beschreiben wir auch die Immunfluoreszenz-Erkennung von Zielproteinen in einer Zelllinie SV40 verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18). Darüber hinaus diskutieren wir den Nutzen der mECap18 Zelle als geeignete in-vitro- Modell mit, um die Regulierung der epididymal sekretorischen Aktivität zu erkunden. Zu diesem Zweck beschreiben wir die Kultivierung Anforderungen für die Aufrechterhaltung der mECap18-Zell-Linie und der Einsatz von selektiven pharmakologische Hemmung Regimen, die ihre sekretorischen Protein Profil zu beeinflussen können. Letztere werden bewertet ohne weiteres über die Ernte der konditionierten Kulturmedium, Konzentration der sekretierten Proteine über Trichloressigsäure Säure/Aceton Niederschlag und ihre anschließende Analyse über die SDS-PAGE und Immunoblotting. Wir behaupten, dass diese kombinierte Methoden für die Analyse von alternativen epididymal Protein-Targets als Auftakt zur Bestimmung ihrer funktionalen Rolle in spermienreifung und/oder Lagerung eignen.

Einleitung

Die Spermien von allen Säugetierarten erwerben das Potenzial um vorwärts progressive Motilität anzuzeigen und eine Eizelle befruchten während ihrer längeren Abstieg durch die Nebenhoden, eine hoch spezialisierte Region des männlichen extra Hoden Kanalsystems, die 7-14 Tage (abhängig von der Sorte) navigieren1. Durch die extreme Kondensation des Chromatins väterlicherseits und das Ablösen von der Mehrheit der Zytoplasma, die die Cytodifferentiation der Spermien im Hoden begleitet, wird ihre nachfolgenden funktionellen Reifung ausschließlich durch ihre Interaktion angetrieben. mit der epididymal Mikroumgebung. Dieses Milieu entsteht wiederum durch die sekretorischen und absorptive Aktivität der Auskleidung epididymal Soma und zeigt ein außergewöhnliches Maß an Segment-Segment Variante1. So sind die meisten aktiven Segmente in Bezug auf die Protein-Synthese und Sekretion im proximalen Teil des Nebenhodens (nämlich die Caput und Korpus)2. Diese Tätigkeit spiegelt das funktionale Profil von Spermien, mit dem Zellen ersten anzuzeigenden Markenzeichen der fachliche Kompetenz (i.e., progressive Motilität und die Fähigkeit zur Bindung an Säure solubilisiert Zona Glykoproteine) folgende ihre Durchgang durch das Caput Nebenhoden3. Diese funktionelle Attribute weiter ausbauen vor dem optimalen Niveau zu erreichen, wie das Sperma der distalen epididymal Segment (Cauda), erreichen wobei sie im Ruhezustand in Bereitschaft zur Ejakulation gespeichert sind. Bildung und Erhaltung von diesem Sperma-Lagerung-Reservoir ist auch eng mit der Auskleidung Epithel, die in der Cauda dominiert wird von starken absorptive Aktivität4,5verbunden. Anatomische Unterschiede gemeldeten6,7,8gewesen, scheint solche regionalisierte Arbeitsteilung ein Merkmal des Nebenhodens zu sein, die bei der Mehrheit der Säugetierarten geteilt wird studierte bis Datum, einschließlich unserer eigenen9,10. In der Tat aus klinischer Sicht ist es bekannt, dass epididymal Dysfunktion leistet einen wichtigen Beitrag zur Ätiologie von männlicher Faktor Unfruchtbarkeit11, also Hervorhebung der Bedeutung die Verordnung dieses spezialisierte Gewebe zu verstehen.

Es ist daher bedauerlich, dass unser Verständnis der epididymal Physiologie und die Mechanismen, die die aufeinander folgenden Phasen der spermienreifung und Lagerung in diesem Gewebe zu regulieren nicht vollständig gelöst werden. Unter den beitragenden Faktoren sind limitierende Fortschritte in der epididymal Forschung der Komplexität dieses Gewebes und Wissen über die Mechanismen, die regulatorischen Kontrolle über seine luminalen Mikroumgebung ausüben. Anatomisch, wissen wir, dass über die Unterscheidung von Caput, Korpus und Cauda Segmente, die Nebenhoden kann weiter unterteilt werden in mehrere Zonen (Abbildung 1A), die jeweils getrennt durch Septen12 und zeichnet sich durch diskrete profile gen/Protein Ausdruck13,14,15,16,17,18. In der Tat, wurden auf der Grundlage von detaillierten transkriptionelle Profilierung der segmentalen Genexpression in den Nebenhoden, weniger als 6 und 9 verschiedene epididymal Zonen in der Maus und Ratte Modelle, bzw.19,20gemeldet. Diese Komplexität spiegelt vermutlich die Zusammensetzung der epididymal Soma, eine pseudostratified Epithel, bestehend aus zahlreichen verschiedenen Zelltypen; Jede abweichende in Bezug auf ihre Fülle, Verteilung und sekretorischen/absorptive Aktivitäten entlang der Länge des Traktes. Wichtigsten Zellen sind also bei weitem die am häufigsten vorkommende epididymal Zelle Art bilden mehr als 80 % aller epithelialen Zellen. Dementsprechend sind die wichtigsten Zellen verantwortlich für den Großteil der epididymal Protein Biosynthese und Sekretion5. Im Gegensatz dazu sind die klare Zellpopulation, die Rang als die zweithäufigste Zelltyp innerhalb der epididymal Soma in erster Linie selektive Absorption der luminalen Komponenten und die Versauerung der Mikroumgebung5beteiligt. Hinzufügen einer anderen Ebene der Komplexität, üben Androgene und andere Lumicrine Faktoren der Hoden Herkunft differenzielle Kontrolle über jedes dieser epididymal Zelltypen abhängig von ihrer Positionierung entlang den Trakt.

Trotz der Beschränkungen durch diese Komplexität auch weiterhin bedeutende Überfälle in die mechanistische Grundlage der epididymal Funktion zu lösen. Ein Schlüssel zu diesen Studien wurde die Anwendung der erweiterten Massenspektrometrie Strategien auf breiter Ebene Vorräte des epididymal Proteome im Tandem mit detaillierten Analysen der einzelnen Proteine ausgewählt aus dieser ersten Umfragen zu etablieren. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist unsere jüngste Charakterisierung der DNM-Familie der Mechanoenzymes in der Maus Modell21. Unsere anfängliche Interesse an DNM wurde durch seine doppelte Wirkung in der Kupplung von Exo- und endocytotic Prozessen angetrieben. Aufbauend auf diesen Beobachtungen, konnten wir beweisen, dass die drei kanonischen Isoformen von DNM (DNM1 - DNM3) sind hoch in der Maus Nebenhoden ausgedrückt und entsprechend positioniert, um regulatorische Rollen in Protein Sekretion und Absorption21 . Darüber hinaus konnten wir deutlich unterscheiden jedes DNM Isoform auf der Grundlage ihrer zellulären und subzellulären Lokalisation hindeutet, dass sie einander ergänzen, im Gegensatz zu redundanten, Aktivität innerhalb der epididymal Epithel21besitzen.

Hier beschreiben wir die experimentelle Methodik beschäftigt für die Untersuchung von DNM Ausdruck in der Maus Nebenhoden mit der Hoffnung, dass diese Informationen wird in der Charakterisierung der alternative epididymal Proteine breitere Anwendung zu finden und tragen so zu unserer Verständnis der Funktion dieses wichtige Element der männlichen Fortpflanzungsorgane. Im einzelnen beschreiben wir die Entwicklung von robusten Methodik für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Zielproteinen in Paraffin-eingebetteten epididymal Abschnitten und die spätere Erkennung der räumlichen Verteilung dieser Proteine über Immunfluoreszenz Mikroskopie. Weiter dokumentieren wir unsere kürzlich optimierte Protokolle22 für die Isolierung und Charakterisierung von Epididymosomes; kleinen exosom-wie Bläschen, die Schlüsselelemente des epididymal sekretorischen Profils und eine herausragende Rolle bei der Förderung der Spermien Reifung23zu halten scheinen. Als einen komplementären Ansatz beschreiben wir auch die Immunfluoreszenz-Erkennung von Zielproteinen in einer Zelllinie verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18) und der Umgang mit dieser Ressource als ein Modell mit, um die Regulierung der epididymal zu erkunden sekretorischen Aktivität in Vitro.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren, die Sammlung von tierischem Gewebe wurden von der University of Newcastle Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt.

(1) Immunfluoreszenz Färbung der Paraffin-eingebetteten Epididymal Abschnitte (Abbildungen 1 und 2)

  1. Unmittelbar nach der Euthanasie Erwachsener Mäuse durch CO2 Einatmen (Schweizer Mäuse, über 8 Wochen alt) sorgfältig sezieren die Nebenhoden (durch chirurgische Scheren und Pinzetten) der darüber liegenden Bindegewebe und Fett befreien und Tauchen in Bouins Fixiermittel Lösung (> 10 mal Volumen/Gewebe Gewicht) für Übernachtung Fixierung.
  2. Waschen Sie das Gewebe mit 70 % Ethanol mit 2 × täglich für 2 Tage und dann Austrocknen durch abgestufte Ethanol (70 %, 95 % und 100 %) in Vorbereitung auf Infiltration und Einbettung in ein paraffinblock.
  3. Abschnitt der Paraffin-Blöcke bei einer Dicke von 4 bis 6 µm und Halterung auf den Folien in Vorbereitung auf die Immunfluoreszenz-Färbung.
  4. In einer Dampfhaube Wachsentfernung epididymal Paraffin-Abschnitte durch die Folie Glas komplett eintauchen Abschnitt Gewebe (3 × 5 min jedes Mal) eine ausreichende Menge an Xylol hinzufügen.
  5. Die Gewebeschnitte durch das Eintauchen in abgestuften Ethanol Lösungen verdünnt in gereinigten H2O rehydrieren (100 % Ethanol 5 min, 100 % igem Ethanol 5 min, 90 % Ethanol 1 min, 80 % Ethanol 1 min, 70 % igem Ethanol 1 min und 50 % Ethanol 1 min).
  6. Waschen Sie die Abschnitte in einer Folie Glas einmal für 5 min mit ausreichend Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) den gesamte Gewebe Abschnitt komplett Eintauchen (befolgen Sie diese Anweisungen für alle nachfolgenden Wäschen).
  7. Dekantieren entsprechende Antigen-Retrieval-Lösung (zB., 10 Mmol/L Natriumcitrat, 50 Mmol/L Tris pH 10,5 oder alternative Antigen Abruf Lösung(en), je nach dem Antigen erkannt werden) in eine Folie Rack und eine Mikrowelle zum Kochen bringen. Tauchen Sie die Folien in dieser Lösung und die Gewebeschnitte nach Wärme-induzierte Antigen Abruf Bedingungen optimiert für einzelne Antikörper (siehe Tabelle 1).
    Achtung: Sicherstellen Sie, dass die Folien in Antigen-Retrieval-Lösung während des Antigen-Retrieval-Prozesses vollständig eingetaucht sind.
  8. Entfernen des Folie-Containers aus der Mikrowelle und kühl auf Raumtemperatur.
  9. Spülen Sie die Folien mit PBS und verwenden Sie einer flüssigkeitsabweisenden Folie Filzstift zu verfolgen, um die Gewebe-Abschnitt.
  10. Legen Sie die Folien in eine befeuchtete Behälter (erstellt von einem feuchten Gewebe an der Unterseite des Behälters), und wenden Sie blockierende Lösung (3 % BSA/PBS, zuvor gefiltert durch einen 0,45 µm-Filter) für 1 h bei 37 ° C.
  11. Spülen Sie die Folien einmal mit PBS.
  12. Inkubieren Sie die Abschnitte mit entsprechenden Primärantikörper verdünnt, um eine experimentell optimierten Konzentration in gefilterten 1 % BSA/PBS bei 4 ° C über Nacht (1: 60 für Anti-DNM1, DNM2 und DNM3 Antikörper; 1: 100 für Antikörper Anti-ATP6V1B1, siehe Tabelle der Materialien Antikörper Einzelheiten).
    Hinweis: um zu unterscheiden bestimmte unspezifische Antikörper gebunden, es ist notwendig, strenge Negative (i.e., Sekundärantikörper nur, primäre Antikörper preabsorbed gegen Immunisierung von Peptid) und Positivkontrollen24.
  13. Abgekühlter Folien indem man bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
  14. Waschen Sie die Folien 3 × mit PBS auf einer schütteln Plattform (60 u/min) für 10 Minuten.
  15. Inkubieren Sie die Abschnitte mit entsprechenden Sekundärantikörper verdünnt in 1 % BSA/PBS (gefiltert durch einen 0,45 µm-Filter) bei 37 ° C für 1 h (1: 400 Verdünnung für alle Sekundärantikörper, siehe Tabelle der Materialien Antikörper).
    Achtung: Halten Sie die Folie Behälter im Dunkeln von diesem Schritt ab. Für die doppelte Beschriftung, wählen Sie eine kompatible Kombination der Sekundärantikörper (i.e., Sekundärantikörper müssen erhöht werden können, in verschiedenen Arten).
  16. Waschen Sie die Folien 3 × mit PBS auf einer schütteln Plattform (60 u/min) für 10 Minuten.
  17. Counterstain in den Abschnitten mit Propidium Jodid (PI, 7,48 μmol/L) oder 4΄, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 4,37 μmol/L) für 2 min bei Raumtemperatur um den Zellkern zu beschriften.
  18. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS auf einer schütteln Plattform (60 u/min) für 5 min.
  19. Montieren Sie die Abschnitte mit 10 % Mowiol 4-88 in einer Lösung von 30 % Glycerin in 0,2 Mol/L Tris (pH 8,5 zubereitet) und 2,5 % 1, 4 - Diazabicyclo-(2.2.2)-Oktan.
  20. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack und speichern Sie die Folien bei 4 ° C für zukünftige Beobachtung.
    Achtung: Es wird empfohlen, führen Sie die Bildgebung der Folien so bald wie möglich nach der Zubereitung übermäßigen Verlust der Fluoreszenz zu vermeiden.

2 Isolation des Epididymosomes von der Maus Caput Nebenhoden (Abbildung 3)

  1. Unmittelbar nach der Euthanasie Erwachsener Mäuse durch CO2 Einatmen (Schweizer Mäuse über 8 Wochen alt) durchspülen Sie ihrer Gefäßsystem mit PBS (vorgewärmt auf 37 ° C) um die Blut-Kontamination von epididymal Gewebe zu minimieren.
    Vorsicht: Blutplasma enthält verschiedene Populationen von exosomen, die von ähnlicher Größe wie Epididymosomes25sind. Die Wirksamkeit von Blut Abstand epididymal Gewebe ist erreichbar über die Prüfung des ersten Segments befindet sich ein stark vaskularisierte epididymal Segment proximal zum Segment Caput (i.e., zone 1 in Abbildung 1A)
  2. Sezieren Sie sorgfältig die Nebenhoden frei von darüberliegenden Fett- und Bindegewebe und Spülen mit modifizierten Biggers Whitten und Whittingham Medium (BWW; pH 7,4, Osmolalität von 300 Mmol/kg Wasser26,27) um mögliche Oberfläche zu verringern Blut-Kontamination.
  3. Tupfen Sie das epididymal Gewebe zu entfernen überschüssige Medien, sezieren Caput Nebenhoden (dh., Zonen 2-5 in Abbildung 1A) und Übertragung auf eine neue Petrischale (35 × 10 mm) mit BWW Medium. Stellen Sie sicher, dass die Menge des Mediums für die endgültige Erholung ausreicht.
    Hinweis: Für 6 Caput Nebenhoden empfiehlt es 1,1 mL des Mediums verwenden, um eine Erholung von ~ 900 µL ermöglichen, was wird dann gleichmäßig aufgeteilt und auf 2 vorbereitete Gradienten (siehe Schritt 2,9) angewendet.
  4. Machen Sie einige kleine Einschnitte in das Caput Gewebe mit einer Rasierklinge. Zerkleinere das Gewebe nicht und somit Vermeidung einer Kontamination der Probe mit übermäßigen cytosolischen Inhalt. Inkubieren Sie die Platte mit der Gewebe mit milden Agitation bei 37 ° C für 30 min, der luminalen Inhalt freizugeben.
  5. Filtern Sie die resultierende Aussetzung durch 70 µm Membranen, die zelltrümmer zu entfernen.
  6. Das Filtrat zu sammeln und unterliegen diese Schritte aufeinander folgenden Zentrifugation bei 4 ° C mit zunehmender Geschwindigkeit um zelltrümmer zu beseitigen (i.e., 500 × g, 2 000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min; 17.000 × g für 20 min, und schließlich 17.000 × g für eine zusätzliche 10 Minuten oder bis keine Pellets nach Zentrifugation gebildet wird).
    Achtung: Es ist wichtig zu beurteilen, die Farbe der Pellets nach den ersten 500 × g Zentrifugieren Schritt um sicherzustellen, dass minimal Blut vorhanden ist. Entsorgen Sie keine Proben, in denen diese Pellets rosa Färbung zeigt.
  7. Bereiten Sie diskontinuierliche Iodixanol Gradienten (bestehend aus 40 %, 20 %, 10 %, 5 % Schichten vor) durch Verdünnung ein Dichte-Gradienten-Medium (bestehend aus 60 % (w/V) wässrige Iodixanol) mit einer Lösung von 0,25 Mol/L Saccharose und 10 Mmol/L Tris (pH 7,5).
  8. Bereiten Sie die Steigung in einem Ultrazentrifugen Rohr (11 × 35 mm), mit jedem Bruchteil von 450 µL (Abbildung 3). Überprüfen Sie die Steigung nach der Anwendung der einzelnen Fraktionen um sicherzustellen, dass die Schnittstellen zwischen jeder Schicht vor dem Laden der epididymal Fluid-Probe erfolgreich gebildet werden. Jede Steigung frisch zubereiten, am Tag der Nutzung, jedoch, die epididymal luminalen Fluid-Probe kann bei 4 ° C für bis zu 2 Stunden vor der Verladung bewahrt werden.
  9. Fügen Sie sorgfältig 450 µL epididymal luminalen flüssige Suspension (entsprechend Material gesammelt von Caput 3 Nebenhoden) Spitze eines einzigen Gradienten.
  10. Ultrazentrifugen Steigungen bei 160.000 × g bei 4 ° C für 18 h.
    Achtung: Da diese Zentrifugation mit sehr hoher Geschwindigkeit ausgeführt wird, alle Ultrazentrifugen Rohre müssen gepaart und genau ausgeglichen. Überprüfen Sie die Schläuche um sicherzustellen, dass sie frei von Schäden sichtbar sind, die ihre Integrität gefährden könnten.
  11. Entfernen Sie vorsichtig die 12 gleichen Fraktionen (jeweils bestehend aus 185 µL) ausgehend von der obersten Schicht und im unteren Bereich des Farbverlaufs voran. Bündeln Sie die gleichwertige Brüche erholte sich von jeder Verlauf ggf. (bis zu zwei Steigungen).
    Hinweis: Maus Epididymosomes höchst angereichert werden, in Sekundenbruchteilen 9-11-22, siehe Abbildung 4 und Diskussion.
  12. Nach der Erholung und Bündelung von 9 – 11, Brüche in 2 mL PBS und Ultrazentrifugen verdünnen Sie die Proben bei 100.000 × g bei 4 ° C für 3 Stunden (13 × 56 mm Rohr) zu den Epididymosomes Pellets.
    Achtung: Da Epididymosome Pellet schwer zu erkennen sein kann, sicherzustellen Sie, dass die Ausrichtung der Röhren vermerkt ist, wie sie in den Rotor platziert werden und markieren Sie das Rohr um die werdende Position des Pellet-Epididymosome anzugeben. Sicherstellen, dass jedes Röhrchen ein ausreichendes Volumen enthält (i.e., mehr als 50 % der Gesamtkapazität) um das Risiko des Zusammenbruchs der Röhre auszuschließen.
  13. Sorgfältig abzusaugen und entsorgen des Überstands ohne störende Epididymosome Pellet.
  14. Beurteilen Sie die Epididymosome Reinheit (Abbildung 4).
  15. Epididymosome Pellet in gewünschten Medium nach der nachgeschalteten Anwendung(en) aufzuwirbeln. BWW-Medium wird beispielsweise in der Regel für die Experimente mit Co Inkubation mit Spermien oder alternativ eine entsprechende Lyse-Puffer in der Vorbereitung für die Auflösung des epididymal Proteome per SDS-PAGE verwendet.

(3) Immunfluoreszenz-Färbung von mECap18 Zellen

  1. Vorbereitung der sterilen Deckgläsern (in einer Zelle Kultur Haube durchgeführt werden)
    1. Deckgläsern (12 × 12 mm) in 70 % igem Ethanol für 10 Minuten einweichen und desinfizieren durch Trocknen bei hohen Temperaturen über eine Ethanol-Lampe.
    2. Cool das Deckglas für 10 s vor der Übertragung an einen 12-well-Platte.
    3. Wenden Sie sterile Poly-L-Lysin-Lösung um das Deckglas abdecken und für 10 min bei Raumtemperatur zu begleichen.
    4. Entsorgen Sie die Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie das Deckglas mit sterilen H2O oder geeigneten Medium.
  2. Vorbereitung mECap18 Zellen
    1. Die Passage der Aliquote von 2 × 105 mECap18 Zellen in jede Vertiefung der 12 well-Platte mit den Deckgläsern.
    2. Kultur der Zellen mit mECap18 Zelle mittlere (DMEM ergänzt mit 1 % L-Glutamin, 1 % Natrium Pyruvat, 1 % Penicillin/Streptomycin und 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN) mit 10 % fetalen Kälberserum (FBS) in einem Inkubator 37 ° C unter einer Atmosphäre 5 % CO2 über Nacht.
    3. Sobald die Zellen das Deckglas anhaften, entsorgen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
    4. Fügen Sie eine ausreichende Menge an 4 % Paraformaldehyd (PFA) verdünnt in PBS Tauchen die gesamte Deckglas und die Zellen bei Raumtemperatur 15 Minuten beheben.
    5. Entsorgen Sie die PFA-Lösung und spülen Sie die Deckgläsern zweimal mit PBS-Puffer.
  3. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Permeabilize mECap18 Zellen durch Eintauchen in 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für 10 Minuten.
    2. Spülen Sie die Deckgläsern mit PBS.
    3. Blockieren Sie mECap18 Zellen mit 3 % BSA zu, und fahren Sie mit Immunolabeling von Zellen, die entsprechenden Protokolle für epididymal Gewebeschnitte beschriebenen Verwendung.

4. Isolierung von Proteinen aus konditionierten Zellkulturmedium

  1. Sammlung von konditionierten Zellkulturmedium
    1. Durchgang Aliquote von 4 × 105 mECap18 Zellen in jedem Bohrloch 6 Platte gut mit mECap18 Zelle Medium ergänzt mit 10 % FBS für 24 h.
    2. MECap18 Zellen dreimal mit mECap18 Zelle Medium (ohne FBS vorbereitet) waschen, um verbleibende FBS und alle zugeordneten entfernen Protein Verunreinigungen.
    3. Jedes gut 1,5 mL mECap18 Zelle Medium (ohne FBS vorbereitet) hinzu und inkubieren Sie mit mECap18 Zellen für 12 h in einem Inkubator 37° C weniger als 5 % CO2.
      Hinweis: mECap18 Zellen bei diesem Schritt können für unterschiedliche Zielgruppen Antigene nach experimentellen Designs beurteilt werden.
    4. Nach 12 h Inkubation sammeln Sie die Zelle Medium und Zentrifuge bei 2.000 × g für 10 min, alle zelltrümmer zu entfernen.
      Hinweis: Die Dauer der Inkubation ist in der Lage, nach experimentellen Design/Endpunkt Bewertung und unter Berücksichtigung der Zelle Toleranz gegenüber angewandte Behandlung(en) verändert werden. Es empfiehlt sich, passen das Timing der Inkubation basierend auf bestimmten experimentellen Therapien, um sicherzustellen, dass optimale Ergebnisse erzielt werden.
    5. MECap18 Zellviabilität über die Anwendung von einem standard Trypan blau Ausgrenzung Assay28zu beurteilen. Entsorgen Sie alles Material in dem Zellviabilität unter 90 % Vorspannung eingeführt durch Proteine aus Toten oder sterbenden Zellen entlassen zu beseitigen zurückgegangen ist.
    6. Isolieren Sie Proteine aus Zelle Medium wie folgt zu oder zu konservieren Sie Medium bei-80 ° C.
  2. Protein-Isolierung (, die in einem Abzug durchgeführt werden)
    1. 80 % Volumen von konditionierten Zelle Mittel-und überstürzen sich die Proteine aus den kultivierten mECap18 Zellen freigegeben fügen Sie 20 % Volumen von gekühltem 100 % Trichloressigsäure Säure hinzu. Inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit dem Konstanten mischen.
    2. Nach der Inkubation pellet ausgefälltes Eiweiß durch Zentrifugieren (17 000 × g, 4 ° C für 10 min).
      Hinweis: Aufgrund der begrenzten Zahl des Proteins, die voraussichtlich in das Medium ausgeschieden werden, ist es möglich, dass die Pellets nicht leicht nach der Zentrifugierung visualisiert werden. Es ist daher zwingend notwendig, um richtig orientieren das Rohr vor der Zentrifugation und kümmern sich nicht um die werdende Pellet-Lage bei der Entnahme des Überstands stören.
    3. Den überstand verwerfen und waschen das Pellet zweimal mit gekühlten Aceton vor der erneute Zentrifugation (17 000 × g, 4 ° C für 10 min).
    4. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands vor jede verbleibende Aceton in einer Dampfhaube Lufttrocknung.
    5. Aufschwemmen der Protein-Pellets in einer entsprechenden Extraktionspuffer Vorbereitung Endpunktanalyse, komplettes sekretorischen Protein Profile und/oder einzelne Zielproteine zu erkennen (zB., SDS-PAGE, Immunoblotting).

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Ergebnisse

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen repräsentative Ergebnisse Immunfluoreszenz Lokalisierung von DNM in der Maus Caput Nebenhoden. Jede der drei DNM Isoformen untersucht Anzeigeprofile eindeutige Lokalisierung. So zeichnet sich DNM1 durch relativ bescheidenen diffuse Kennzeichnung der epididymal Zellen während der ersten Segment und Caput Nebenhoden (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu d...

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Diskussion

Diese Studien integriert den Einsatz von Bouins festen epididymal Gewebe, das Paraffin einbetten und strukturierendes Standardprotokolle unterzogen hatte. Bouins Fixativ Lösung besteht aus einer Mischung von Formaldehyd, Pikrinsäure und Essigsäure, bei jeder Komponente mit einer spezifischen und ergänzende Funktion. So Formaldehyd reagiert mit primären Aminen Protein Querverbindungen zu bilden, Pikrinsäure langsam durchdringt das Gewebe Salze bilden und somit Koagulation von grundlegenden Proteine und umgekehrt, Essigsäu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten die nationale Gesundheit und medizinische Forschung Rat von Australien Project Grant APP1103176 für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dynamin 1 AntikörperAbcamab108458Wirtsspezies: Kaninchen, Isotyp: IgG, Class: polyklonaler
Dynamin 2 AntikörperSanta Cruzsc-6400Wirtsspezies: Ziege, Isotyp: IgG, Class: polyklonaler
Dynamin 3 AntikörperProteintech14737-1-APstrong>Wirtsspezies: Kaninchen, Isotyp: IgG, Class: polyklonaler
ATP6V1B1 AntikörperSanta Cruzsc-21206Wirtsspezies: Ziege, Isotyp: IgG, Class: polyklonaler
CD9 AntikörperBD Pharmingen553758Wirtsspezies: Ratte, Isotyp: IgG, Class: monoklonaler
Flotillin-1 AntikörperSigmaF1180Wirtsspezies: Kaninchen, Isotyp: IgG, Class: polyklonaler
ALOX15-AntikörperAbcamab80221Wirtsspezies: Kaninchen, Isotyp: IgG, Class: polyklonaler
TUBB-AntikörperSanta Cruzsc-5274Wirtsspezies: Maus, Isotyp: IgG, Class: monoklonaler
PSMD7-AntikörperAbcamab11436Wirtsspezies: Kaninchen, Isotyp: IgG, Class: polyklonales
Anti Rabbit Alexa Fluor 488ThermoA11008Wirtsspezies: Ziege, Isotyp: IgG, Class: polyklonale
Anti Goat Alexa Fluor 488ThermoA11055Wirtsspezies: Esel, Isotyp: IgG, Class: polyklonale
Anti Goat Alexa Fluor 594ThermoA11058Wirtsspezies: Esel, Isotyp: IgG, Class: polyklonales
Anti Rabbit Alexa Fluor 594ThermoA11007Wirtsspezies: Ziege, Isotyp: IgG, Class: polyklonales
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LWirtsspezies: Ziege, Isotyp: IgG, Class: polyklonales
Anti Rat HRPMilliporeDC01LWirtsspezies: Ziege, Isotyp: IgG, Class: polyklonales
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Wirtsspezies: Ziege, Isotyp: IgG, Class: polyklonales
4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)SigmaD9564
propidiumiodid (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA7906
fötales Rinderserum (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-GlutaminThermo25030-081
Penicillin/StreptomycinThermo15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
NatriumpyruvatThermo11360-070
Trypsin-ethylendiamintetraessigsäure Säure (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyd (PFA)EMS15710
XylolVWR Chemikalien1330-20-7
EthanolVWR Chemikalien64-17-5
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)SigmaP4417
NatriumcitratSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycerolSigmaG5516
1, 4-Diazabicyclo-(2.2.2)-octanSigmaD2522
Poly-L-gysinSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
TrypanblauSigmaT6146
TrichloressigsäureSigmaT9159
AcetonAjaxFinechem A6-2.5 L GL
SaccharoseSigmaS0389
Poly (Vinylalkohol)SigmaP8136
D-GlukoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
FluoreszenzmikroskopieZeissZeiss Axio Imager A1
UltrazentrifugeBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MikrozentrifugenEppendorf5424R
InkubatorHeracell150
Large Orbital ShakerRatekOM7
MikrowelleLGMS3840SR /00
Labor pH MeterMessgerätLaborPHM220
Flüssigkeitsabweisender ObjektträgermarkerDaido SangyoMini
DeckglasThermo586
6-Well-PlatteCELLSTAR657160
12-Well-PlatteCELLSTAR665180
SlideMikro-GlassSF41296PLMK
0,45 & Mikro; m FilterMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustfree PaperKIMTECH34155
Ultrazentrifugenröhrchen (2,2 ml, 11 > 35 mm)BECKMAN COULTER347356
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Küvettensieb 70 & micro; m NylonFALCON352350
Petrischale 35&fach 10 mm mit NockenSARSTED82.1135.500
ObjektträgerglasTRAJAN#23 319 00
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Referenzen

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