Quantifizierung der Intermembran Strecken mit seriellen Bild Dilatationen

Summary

Dieser Algorithmus soll kontinuierlich Messen Sie den Abstand zwischen zwei 2-dimensionale Kanten mit seriellen Bild Streckungen und Wegfindung. Dieser Algorithmus kann auf eine Vielzahl von Bereichen wie kardiale Strukturbiologie, vaskuläre Biologie und Tiefbau angewendet werden.

Abstract

Kürzlich beschrieben extrazelluläre Nanodomain, genannt Perinexus, hat in Ephaptic Kupplung, verwickelt, was ist ein alternativer Mechanismus für die elektrische Leitfähigkeit zwischen Kardiomyozyten. Die aktuelle Methode zur Quantifizierung dieses Raumes durch manuelle Segmentierung ist langsam und hat geringe räumlichen Auflösung. Wir einen Algorithmus entwickelt, der serielle Bild Streckungen einer binären Gliederung verwendet, um die Anzahl der Pixel zwischen zwei gegenüberliegenden 2 dimensionale Kanten. Dieser Algorithmus erfordert weniger Arbeitsstunden und hat eine höhere räumliche Auflösung als die manuelle Methode unter Beibehaltung der Reproduzierbarkeit des manuellen Prozesses. In der Tat erlebt und Anfänger Ermittler konnten die Ergebnisse einer früheren Studie mit diesem neuen Algorithmus zu rekapitulieren. Der Algorithmus wird durch menschliches Zutun erforderlich, um die Perinexus manuell zu skizzieren und Rechenleistung vor allem belastet durch eine vorbestehende Pathfinding-Algorithmus begrenzt. Allerdings machen des Algorithmus Hochdurchsatz-Fähigkeiten, hohe räumliche Auflösung und Reproduzierbarkeit es vielseitig und robust Messinstrument für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, bei denen die Messung des Abstandes zwischen jeder 2-dimensionale (2D ) Kanten.

Introduction

Der folgende Algorithmus wurde entwickelt, um der intermembran Abstand zwischen zwei strukturell gekoppelt Kardiomyozyten an dem Punkt zu messen, die sie voneinander, am Rande einer Lücke Kreuzung Plakette in eine Nanodomain trennen, genannt der Perinexus¹, die hat in Ephaptic^2,3,4,5Kupplung in Verbindung gebracht. Bei der Analyse von Hunderten von Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Perinexi mit einer manuellen Segmentierung Methode in einer früheren Studie⁶, wurde die Notwendigkeit für einen höheren Durchsatz-Methode identifiziert, die Perinexal Breite in höher abgetastet räumliche Auflösung unter Beibehaltung der Genauigkeit des früheren manuellen Segmentierungsprozesses während manueller Segmentierung, sind Linien in 15 nm Abständen etwa senkrecht zur Mittellinie, um Perinexal Breite zu messen. Der neue Algorithmus nimmt einen ein Pixel Dicke binäre Überblick über zwei parallele Linien und serielle Bild Streckungen verwendet, um die Anzahl der Pixel zwischen den beiden Membranen. Während Bild Streckungen häufig in einer Vielzahl von Bild-Verarbeitungsanwendungen eingesetzt wurden, verwendet einschließlich der Kontur oder Edge Detection^7,8, dieser Algorithmus Streckungen als ein Zählwerk. Die Mittellinie ist dann isoliert mit einer Pfadfindung Algorithmus⁹ und Perinexal Breite mit einer Auflösung entlang der Länge des Perinexus entspricht die Auflösung des Bildes dann gemessen wird. Der Unterschied in der Auflösung ist in diesem Fall 1 Messung pro 15 nm für manuelle Segmentierung und 1 Messung pro 0,34 nm mit dem neuen Algorithmus, eine 44-fold Zunahme der räumlichen Sampling-Frequenz. Darüber hinaus wird diese erhöhte Abtastfrequenz in etwa 1/5^th den Zeitaufwand für manuelle Segmentierung erreicht.

Dieser Algorithmus wird in seiner jetzigen Form verwendet werden, um Perinexal Breite bei der konventionellen 0-150 Messen nm von der Kante eines Gap Junction Plakette⁵ (GJ) sowie innerhalb einer bestimmten Region von Interesse, wo die Perinexus zwischen 30 und 105 nm^{2 Hochebenen , 3 , 10}. erhöhte Abtastfrequenz reduziert die Variabilität der einzelnen Perinexus Messungen im Vergleich zu manuellen Segmentierung und deutlich verkürzt Analyse, so dass für die effiziente Verarbeitung großer Datenmengen. Dieses Programm ist jedoch nicht beschränkt auf nanoskaligen TEM Bilder von kardialen eingefügten Festplatten. Der gleiche Ansatz könnte verwendet werden, um vaskuläre Durchmesser, linksventrikulären Auswurffraktion oder sogar nicht-biologischen Phänomene wie Flusserosion oder Überschwemmungen zu quantifizieren. Dieser Algorithmus eignet sich für die Quantifizierung des Abstand zwischen zwei quasi-parallelen Kanten.

Protocol

Hinweis: Erforderlich sind ImageJ (oder ähnliche Bild bearbeiten Software), Software und Matlab R2015. Der Benutzer unter Umständen Kompatibilitätsprobleme mit anderen Versionen von Matlab.

1. Pre-Processing Bilder

1. Für jede Graustufenbild gewährleisten die maximale Intensitätswert bestimmten Pixels ist < 255. Dies geschieht in der Regel durch Subtraktion der Wert 1 aus dem Bild in das benutzerdefinierte Matlab-Programm "ImageSub.m", in zusätzliche Datei S1 enthalten.

2. Gliederung der Perinexus

1. Skizzieren Sie die Perinexus in ImageJ oder einer anderen Bildverarbeitungs-Software.
2. Sicherstellen Sie, dass der Umriss ein Pixel dick ist und auf den höchsten Intensitätswert in einem Bild (255 in ein Graustufenbild von 0 bis 255) festgelegt ist.
3. Identifizieren Sie der GJ durch seine Pentalaminar Struktur^11,12, und definieren Sie den Beginn der Perinexus als der Punkt, an dem die beiden gegenüberliegenden Zellmembran Bilayer divergieren, wie in Abbildung 1Agezeigt. BEGIN ~ 200 nm von der Kante des GJ, Rückverfolgbarkeit entlang der inneren Membran der ersten Zelle und zurück entlang der inneren Membran der zweiten Zelle. Lassen Sie in ImageJ den Stift um den Umriss automatisch zu schließen. Diese künstliche schließen wird später ausgeschnitten werden.
   Hinweis: Es ist entscheidend für die Perinexus mit großer Sorgfalt an so hoch skizzieren eine Vergrößerung wie möglich, da auch kleine MIS Anwendungen der Gliederung in mehrere Nanometern der Fehler bei der letzten Messung führen können.

3. Einrichten der Algorithmus und Perinexus von Interesse auswählen

Hinweis: Der Pathfinding-Algorithmus erfordert Autogramm, Edge, Graph, Knoten und Pathfinding Funktionen⁹ im selben Verzeichnis wie die MembraneSepDist m-Datei sein. Alle Dateien finden in zusätzliche Datei S1.

1. Wählen Sie speichern Speicherorte für Daten und Zahlen. Diese sind derzeit hart codiert in der m-Datei.
   Hinweis: Die erste Zeile des Programms ist eine Funktion, um alle Variablen zu löschen, schließen Sie alle Fenster und deaktivieren Sie das Befehlsfenster. Speichern Sie alle gewünschten Variablen oder Zahlen vor dem Ausführen der m-Datei.
   Hinweis: Software-Screenshots sind in zusätzliche Datei S2 für alle hartcodierte Werte enthalten.
2. Führen Sie das Programm "MembraneSepDist.m".
3. Eingestellten Parameter.
   Hinweis: Eine GUI mit Standardparametern für gradient Schwelle, Skala, Region von Interesse und manueller Start öffnet sich. Die Standardwerte in der m-Datei geändert werden können, oder sie können für jedes einzelne Bild geändert werden.
   1. Räumliche Derivative gradient Schwelle.
      Hinweis: Höhere Werte führen zu mehr Punkte Mittellinie isoliert ausgewählt. Werte, die zu hoch oder zu niedrig (außerhalb einer Reihe von ca. 3,0-7,9) führen rechnerische Ineffizienz oder eine ungenaue Punktauswahl Mittellinie nachgeben ungenau Mittellinie Isolierung (siehe Abbildung 2A-C).
   2. Festlegen Sie Skala in Pixel/Skala Einheiten.
   3. Legen Sie die räumlichen unteren und oberen Grenzen für die Region von Interesse.
      Hinweis: Durch unser Labor Übereinkommen ist die definierte Region von Interesse zwischen 30 und 105 nm von der Kante des GJ^2,3,10.
   4. Automatischer/manueller Start festgelegt. In den meisten Fällen erkennt der Algorithmus genau den Ausgangspunkt, wo die Lücke Kreuzung endet und Perinexus beginnt. Allerdings muss in einigen Fällen von unregelmäßig geformten Perinexi, der Benutzer den Startpunkt manuell identifizieren. Legen Sie diesen Wert auf 0 für Automatik, 1 für manuelle.
4. Wählen Sie das gewünschte Bild.
   Hinweis: Die Datei wählen Sie Ordner kann in der m-Datei geändert werden.
5. Beschneiden Sie das Bild wählen Sie die Perinexus von Interesse.
   1. Wenn das Bild kommt, ändert der Cursor automatisch in ein Fadenkreuz. Beschneiden Sie das Bild durch ziehen einen Rahmen um die Perinexus von Interesse (siehe Abbildung 3). Der Crop-Box kann eingestellt werden, mit den Quadraten an den Ecken und Seiten machen es größer oder kleiner.
   2. Beim Zuschneiden, sorgen die "offene" Ende der Perinexus (am weitesten von der GJ, siehe Abbildung 3) wird abgeschnitten, so dass die Umrisse der beiden Membran den Rand des zugeschnittenen Bildes erreichen.
      Hinweis: Es wird empfohlen, das Bild im Vollbildmodus leichter zu sehen, die Perinexus von Interesse und entsprechend zuschneiden zu machen.
6. Wählen Sie die letzte Ernte per Doppelklick mit dem Cursor zwischen den gegenüberliegenden Kanten gemessen werden.
   Hinweis: Es ist wichtig, dass der Doppelklick innerhalb der Perinexus durchgeführt werden. Wenn das Programm nicht um eine Mittellinie zu identifizieren, starten Sie das Programm und stellen Sie sicher, dass der Klick innerhalb der Perinexus erfolgt.
7. Beobachten der abschließenden Mittellinie nach allen Streckungen und Erosionen Pop-up für einen Endnutzer-Bewertung der Wirksamkeit des Programms.
   Hinweis: Ein Dialogfeld angezeigt wird auf dem Bildschirm angezeigt, während das Programm ausgeführt wird, um dem Benutzer darauf hin, dass Matlab kann nicht in der Lage, jede zusätzliche Befehle zu verarbeiten, bis das Programm beendet ist. Wie lange dieser Prozess dauert, hängt davon ab, (Bild) Arraygröße und Rechenleistung.
8. Bei aktivierter manueller Startpunkt beobachten Sie das Bild der Mittellinie pop-up über das ursprüngliche anatomische Bild, zusammen mit einem Fadenkreuz Cursor (siehe Abbildung 2E). Wählen Sie einen Punkt außerhalb der Perinexus in der Nähe der gewünschten Startpunkt.
   Hinweis: Das Programm der Mittellinie Punkt am nächsten an das ausgewählte Pixel zu finden und verwenden, die als Startpunkt.
9. Daten aufzeichnen.
   Hinweis: Wenn das Programm beendet ist, das Programm kehrt eine zugeordnete Mittellinie Grundstück von Perinexal Breite als Funktion des Abstandes von der Kante von der GJ. Darüber hinaus wird das Programm zurück die durchschnittliche Perinexal Breite bis zu 150 nm von der Kante der GJ sowie den Durchschnitt innerhalb der definierten Region von Interesse in der Matlab-Befehlszeile. W-_p -Werte und Entfernungen von der GJ in der Variablen "WpList" gespeichert sind, oder der Benutzer kann manuell getrennt aufzeichnen.

(4) Algorithmus zur Fehlerbehebung

1. Wenn die Mittellinie nicht richtig identifiziert (Abb. 2A), öffnen Sie die Figur "Gmag" und verwenden Sie den Index, um eine geeignete Gradienten Schwelle (Abbildung 2C) zu identifizieren.
2. Wenn der Startpunkt nicht richtig erkannt wird, den Startpunkt manuell eingestellt (siehe Protokoll 3.8).

Results

Statistische Methoden: Vergleiche wurden zwischen experimentellen Gruppen mit Student t-Tests vorgenommen. Ein p-Wert < 0,05 gilt als bedeutende und alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.

Manueller Segmentierung. Die Quantifizierung der GJ-neben Perinexus Nanodomain Breite (W-_p) wird in der Regel durch manuelle Segmentierung erreicht. Diese manuelle Segmentierungsprozesses ist in Abbildung 1A gezeigt und war zuvor⁶beschrieben. Der Beobachter kennzeichnet den Rand des GJ (Abbildung 1, roter Punkt), 5nm entlang der Mittellinie der Perinexus misst und misst den Abstand zwischen den Membranen zu diesem Zeitpunkt. Der Prozess wird wiederholt auf 10, 15, 30 und alle 15 nm bis zu 150 nm. Diese Technik beim effektiven, hat Begrenzungen von Zeit und räumlichen unter Probenahme entlang der Länge der Perinexus.

Meine W_p Messungen aus früheren Studien können variieren von ca. 10 bis 20^2,3,10und 3 nm scheint die mittlere Differenz benötigt, um die statistische Signifikanz zu erkennen, die deutlich über die räumliche Nyquist-Frequenz von 0,7 nm pro Messung basiert eine interpixel Auflösung von 0,34 nm. Während manueller Segmentierung zeitaufwändig ist, ist die Methode daher ausreichen, um Unterschiede in W_p verbunden mit einem Eingriff oder Krankheit Zustand messen.

Serielle Bild Streckungen. Um die Perinexus schneller, reproduzierbare Weise mit entsprechenden räumlichen Auflösung zu messen, haben wir eine Programm basierend auf serielle Bild Streckungen der Pixel zwischen zwei manuell verfolgt Membranen, zählen die in Abbildung 1B gesehen werden kann .

Die serielle Dilatation-Prozess ist in Abbildung 4dargestellt. Als binäre Bild geweitet ist (Abbildung 4A-4D), dass Dilatation ist dann invertiert und eine Bild - nicht-binären Form der ursprünglichen Gliederung (Abbildung 4E-4 H) hinzugefügt. Der Prozess wird wiederholt, bis die Gliederung (Abbildung 4D) vollständig gefüllt ist. An dieser Stelle ist das fertige Arbeit Bild (Abbildung 4H) eine Zählung der Anzahl der vorkommen, die ein bestimmtes Pixels UN dilatative geblieben ist. Als solche sind die Werte in der Nähe der Umriss der Zellmembranen sehr niedrig, während die Werte in der Mitte am höchsten sind. Durch zählen der Anzahl von Streckungen auf den Bereich an jedem Punkt zu füllen, kann der Abstand zwischen dem Rand der Membran berechnet werden. Die nächste Herausforderung ist es, identifizieren und isolieren die Mittellinie um Perinexal Breite als Funktion des Abstandes von der GJ zu quantifizieren die erfolgt durch die erste Anwendung eine räumliche Ableitung auf das Ergebnisbild arbeiten (Abbildung 2-letzte Bild und Abbildung 5 A). Ein zweites Beispiel für eine unregelmäßig geformte Perinexus finden in zusätzliche Datei S3.

Mittellinie Identifikation. Die Steigung des fertigen Bildes arbeiten kann durch eine räumliche Ableitung als Dilatation Graf quantifiziert werden, Werte von Kante zu Kante von hoch zu niedrig zu hoch wieder ändern (Abbildung 5A von links nach rechts). Betrachtet man nur das Ausmaß der räumlichen Ableitung (Abb. 5B) sind die Umrisse und Mittellinie, mit weißen Pfeilen markiert sofort erkennbar als Bereiche der Diskontinuität. An diesen Standorten ändert sich die Steigung Richtung erhöhen, verringern oder umgekehrt. Anwendung einen Schwellenwert (Abbildung 5C) produziert ein binäres Abbild der Mittellinie und Umriss, und subtrahieren die ursprüngliche Gliederung die isolierte Mittellinie (Abbildung 5D) ergibt. Während diese Methode zur Isolierung der Mittellinie rechnerisch effizient ist, schafft den Mindestbetrag der räumlichen Ableitung Lücken in der daraus resultierenden Mittellinie. Diese Lücken (Abbildung 5D, insert) müssen ausgefüllt werden, um eine genaue Messung des Abstandes von der GJ zu bieten und um sicherzustellen, dass die Perinexus in seiner Gesamtheit gemessen wird. Erstens ist die Mittellinie zum Ausfüllen von Lücken (Abbildung 5E), gefolgt von einer Erosion (Abbildung 5F) und eine "Bwmorph"-Funktion erweitert (Betrieb = Skel n = inf) um so viele Punkte wie möglich zu beseitigen, wobei eine kontinuierliche Mittellinie, wodurch die rechnerische Effizienz eines nachfolgenden Pathfinding-Algorithmus von Wasit Limprasert entwickelte und auf MATLAB Central⁹zur Verfügung. Diese Dilatation-Erosion-Funktion erzeugt die abgeschlossene Mittellinie, die mit dem abschließenden Arbeiten Bild (Abbildung 5G) kombiniert wird. Jedoch diese Mittellinie ist oft mehr als ein Pixel dick und ist daher keine genaue Trennung der Mittellinie.

Wasit Limprasert Pathfinding Algorithmus dient zur Bestimmung der Perinexus Mittellinie. Der Pathfinding-Algorithmus ist in der Lage, die höchsten Werte - in diesem Fall die Werte am nächsten an der Mitte verfolgen die blieb UN dilatative durch die Iterationen entlang der Mittellinie (Abbildung 5G, einfügen). Das Ergebnis ist eine automatische Spur der Mittellinie, wie in Abbildung 6dargestellt. Durch die Isolierung der Mittellinie, kann Perinexal Breite präsentiert werden, als Funktion des Abstandes vom Ende des GJ, wie in Abbildung 6B (oben) dargestellt oder als die durchschnittliche Breite einer bestimmten Region von Interesse.

Kernel Analyse. Es ist wichtig zu beachten, dass digitalisierte Bilder auf quadratischen Arrays basieren und Dilatation Kernel ebenfalls auf Quadrat Matrizen basieren. Dies bedeutet, dass Dilatation Abstand über eine Diagonale größer als orthogonal ist. Daher wollten wir als nächstes zu bestimmen, ob der Kernel das Ergebnis des Algorithmus beeinflusst. Um Kernel-spezifische Variabilität zu quantifizieren, wurden fünf verschiedene Kernel Formen analysiert: "Plus" (die Form in den genannten Analysen verwendet), "X", "Box" und "Linie", wie in Abbildung 7Abeschrieben. Der Kernel wird an jedem nicht-NULL-Punkt des ein binäres Bild angewendet. Die Star in jeder Kernel von Abbildung 7A stellt das Zentrum, wo weiß ist ein Wert von 1 und schwarz ist der Wert 0 für die Dilatation-Kernel dar.

Jeder Kernel Einfluss auf die mittlere W-_p -Messung von einem ungefähr horizontal Perinexal Bild (Abbildung 7B, oben), von einem erfahrenen Benutzer quantifiziert, wurde durch Drehen des Bildes mit Matlab "Imrotate" Befehl bestimmt und Computing W_p in Schritten von 10°. Die W-_p -Messwerte (Abb. 7B, unten) schwanken mit Ausrichtung in eine gleichgerichtete sinusförmigen Mode mit einem Plus Kernel geformt. Die niedrigsten Werte auftreten, wenn eine relativ gerade Perinexus vertikal oder horizontal ausgerichtet ist. X, Box, weder die Linie Kerne zur Verfügung gestellt keine Vorteile gegenüber der Plus-förmigen Kern. Die X und Box Kerne produziert identische Ergebnisse, aber die Werte bedeuten W_p aus der Phase mit th_e Plus Kernel um 45° waren. Der Zeile Kernel nicht vollständig das Bild in einem bestimmten Winkel zu dehnen, wie durch das Fehlen von Daten in der grünen Spur für Bilder gedreht von weniger als 30 oder mehr als 145 ° gesehen werden kann. So überschätzt der orthogonale Plus Dilatation Kernel Membran Trennung bei der Dilatation einer Perinexus mit einer Achse zum Beispiel bei etwa 45 ° diagonal orientiert, und die X und Box Kerne unterschätzt bedeuten W_p wenn die Längsachse des Perinexus war auch bei 45°. Basierend auf dieser Analyse, entwickelten wir einen Korrekturfaktor angewendet auf die Werte von Dilatation mit dem Plus-förmigen Kernel generiert. Um die Überschätzung der Membran Trennung zugeordnete Bildausrichtung, dieser Korrekturfaktor multipliziert mit dem Breitenwert der gemessenen je nach Ausrichtung des Bildes (Gleichung 1) zu berücksichtigen.

Wenn θ < 45°
     W_{p korrigiert} geographische(θ) = * W_{p gemessen}
Wenn θ ≥45 °
     W_{p korrigiert} geographische(θ) = * W_{p gemessen} (Gleichung 1)

In dieser Gleichung ist W_p gemessen, der ursprüngliche W-_p -Wert generiert durch die oben genannten Algorithmus und θ ist der berechnete Winkel von der horizontalen in Grad. Θ wird berechnet, indem die umgekehrte Tangente die totale Veränderung in horizontaler Richtung durch die totale Veränderung in vertikaler Richtung der Perinexal Mittellinie geteilt. Die oben genannten Korrektur nähert sich den durchschnittliche Winkel relativ zur horizontalen, von der Perinexus (Abb. 8A, links oben) und führt zu einer Messung, als ob eine horizontale Perinexus entnommen (Abb. 8A, Links unten). Die Logik hinter dieser Gleichung kommt von der Tatsache, dass der Plus-förmigen Kern (Abb. 7A) im Wesentlichen zwei linienförmigen Kerne orthogonal zueinander angeordnet ist. Als solche unter 45° (näher zur horizontalen), die Dilatationen vertikal auftreten und daher mit der Kosinus des Winkels multipliziert gibt die korrekte Messung. Im Gegensatz dazu für Winkel über 45° (näher an vertikalen), Streckungen auftreten horizontal und der Sinus wird verwendet, um die korrekte Messung zu bestimmen. Bei exakt 45° sind die Sinus und Kosinus gleich. Zusätzliche Datei S4 bietet eine Darstellung dieses Konzepts. Beachten Sie, dass diese Korrektur auf der durchschnittlichen Winkel basiert und Vorsicht verwendet werden, sollte Wenn Sie im Wesentlichen nicht-lineare Formen zu analysieren. Dieser Vorgang wiederholte sich auf 20 zufällig ausgewählte Perinexi und die korrigierte Messungen korreliert stark mit Messungen durch manuell drehen und erneut analysiert die Bilder (Abbildung 8A, rechts). Um die genaue Korrektur für Bildausrichtung zu bestätigen, wurden zwei Gruppen von phantom Kanten erzeugt (Abb. 8B, Links) und 180 ° gedreht. Mit der trigonometrischen Korrektur kehrte der Algorithmus genau den richtigen Wert in jeder Ausrichtung unabhängig von räumlicher Auflösung und Bildgröße (Abbildung 8B, rechts).

Analytische Applikation und Reproduzierbarkeit mit Richtungskorrektur. Eingedenk dessen, dass frühere Studien mit manueller Segmentierung Bericht statistisch signifikante W_p größer Unterschiede oder gleich 3 nm, war es wichtig, festzustellen, ob der Algorithmus verwendet werden, um die bisherigen Erkenntnisse mit rekapitulieren ein komplette Dataset. Der neue Algorithmus, zwei Beobachter - erfahrenen und unerfahrenen mit Perinexal Analyse (obs. 1 und obs. 2, beziehungsweise)-analysiert die gleichen Bilder von einer früheren Studie⁶ , die 12 Patienten eingeschlossen, die mit Vorhofflimmern diagnostiziert wurden Vorhofflimmern (AF) vor dem Gewebe Sammlung und 29 Patienten, die keine bereits vorhandenen AF (No-AF). Der erfahrene Anwender fand, dass W_p deutlich breiter ist bei Patienten mit AF als ohne AF (21.9±2.5 und 18.4±2.0 nm bzw. Abbildung 9A). Diese Werte mit dem Korrekturfaktor angewendet sind ähnlich wie die gemeldeten vorher (24.4±2.2 nm und 20.7±2.4 nm, beziehungsweise)⁶. Wichtig ist, der unerfahrene Benutzer fanden die gleichen signifikanten Unterschied (22.1±2.8 nm und 20.1±2.6 nm, beziehungsweise) zwischen Krankheitszuständen mit dem automatisierten Programm. Darüber hinaus ändern die Standardabweichung der W-_p -Werte nicht mit der Korrekturfaktor, darauf hinweist, dass die Standardabweichung von 2-3 nm ist kein Artefakt des Algorithmus, sondern die Struktur selbst und Gewebe Verarbeitung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorgeschlagene automatisierte Methode zusammenfassend die Ergebnisse früherer Studien kann.

Wichtig ist, die Perinexus ist eine vor kurzem definiert Struktur und kein Konsens erreicht wurde, auf den Bereich der absoluten Werte der Membran Trennung neben der GJ-^2,-³. Da-Membran-zu-äußeren-Außenmembran GJ Breite bereits bei 20 nm¹³geschätzt wurde, suchten wir den Algorithmus Wirksamkeit durch Messung auch GJ Breite zu bestimmen. Beide Beobachter fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen Kreuzung Spaltweiten (GJW) von Patienten mit oder ohne vorbestehende AF (Abbildung 9B). Absolute GJW Werte für AF und nicht-AF-Patienten waren 20,5 ± 2,5 nm und 20,3 ± 1,9 nm, für den erfahrenen Beobachter und 21,0 nm ± 3,1 und 20,0 ± 2,2 nm für unerfahrene Beobachter, ähnlich wie zuvor berichtet.

Um festzustellen, ob der automatisierten Algorithmus weniger Zeit benötigt für die Datenanalyse als manuelle Segmentierung, erfasst sowohl der erfahrene und unerfahrene Benutzer die Zeit, ein Bild 10-Training zu quantifizieren (ergänzende Datei S5) set benötigt. Tabelle 1 zeigt, dass der erfahrene und unerfahrene Benutzer Analysenzeit von 4,7 - und 8.3 - fache bzw. mit dem automatisierten Algorithmus im Vergleich zu der manuellen Segmentierung-Ansatz mit ca. 43-fold Zunahme der räumlichen abgenommen Auflösung entlang der Perinexus.

Algorithmus zur Fehlerbehebung. Der häufigste Fehler beim Ausführen des Algorithmus tritt auf, wenn die letzte Mittellinie nicht an den Rand des Bildes endet. In solchen Fällen wurden nicht genügend Punkte von der räumliche Derivative Map, verursacht das Programm fehlschlägt und eine Fehlermeldung, die den Benutzer wählen eine größere Anbaufläche oder erhöhen den räumlichen derivativen Schwellenwert Beratung ausgewählt. Zeichnung eine größere Ernte Box verbessert die Zuverlässigkeit des Programms in einigen Fällen als die räumliche derivativen Änderungen drastisch am Rand der Figur, die die Pfadfindung oder Kante Erkennungsalgorithmen stören können.

Es ist auch möglich, dass der Pathfinding-Algorithmus nicht zu die Mittellinie richtig identifizieren, auch wenn die Mittellinie der Rand des Bildes erreicht, insbesondere dann, wenn der gradient Schwellenwert ist zu niedrig (Abb. 2A). Wenn die Steigung Schwelle zu hoch eingestellt ist, werden weitere unnötige Punkte eingearbeitet der Pathfinding-Algorithmus (Abbildung 2B), abnehmender rechnerische Effizienz. Wenn der Benutzer einen entsprechende Schwellenwert, das Bild Array bestimmen kann "GMag" (Abbildung 2C), die entsteht durch das Programm und finden Sie im Arbeitsbereich kann Hilfe der Benutzer bestimmen die Schwelle. Finden Sie Punkte entlang der Mittellinie zu und setzen Sie den Schwellenwert leicht über ihre Index-Wert, um sicherzustellen, dass diese Punkte ausgewählt sind. In diesem Beispiel wäre eine geeignete Schwelle über ~5.1 (Abbildung 2C, einfügen).

Der Startpunkt kann auch fehlschlagen, Beginn des Perinexus (Abb. 2D) zu erreichen. In diesem Fall führen Sie das Programm erneut aus, und Handbuch Startwert auf 1 gesetzt. Nach die Mittellinie isoliert wurde, der Benutzer wählt einen Punkt außerhalb der Perinexus und der Mittellinie Punkt am nächsten an das ausgewählte Pixel (Abbildung 2E, rotes Quadrat) wird als Startpunkt festgelegt werden. Das Ergebnis ist die gesamte Mittellinie (Abbildung 2F).

Abbildung 1 : TEM-Bilder mit Quantifizierung Prozesse. Die manuelle Segmentierungsprozesses (A) muss der Benutzer 12 intermembran Einzelmessungen durchführen, während die Schätzung der Mittellinie. Der automatische Prozess (B) erfordert eine manuelle, kontinuierliche Spur der Gliederung der Perinexus. Der rote Punkt in jedem Bild steht der Benutzer identifiziert Ende des GJ und Anfang der Perinexus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Abbildung 2 : Mittellinie Fehlerbehebung. Zwei primäre Modi des Scheiterns für die Mittellinie Identifikation und deren Lösungen: jedes Bild ist mit dem Array-Namen in Matlab gekennzeichnet. Ist die gradient Schwelle zu niedrig (A, Schwelle 0,2) der Mittellinie Algorithmus kann fehlschlagen. Einstellung die Schwelle zu hoch (B, Schwelle 70) reduzieren die rechnerische Effizienz des Pathfinding-Algorithmus. Eine entsprechende Gradienten Schwelle ermittelt werden, aus dem Array GMag (C, einfügen). Unterlässt die Mittellinie den Anfang-Rand des Perinexus (D) erreichen, kann der Benutzer entscheiden, manuell den Startpunkt auszuwählen. Nach der "Start Point" Option 1 in der Eröffnung GUI, der Benutzer soll dann wählt einen Punkt außerhalb der Perinexus des Interesses (E). Das Endergebnis sollte eine Mittellinie, die die Gesamtheit der Perinexus (F) genau schildert. Alle Beschriftungen in Zitaten (A-F) entsprechen den Variablennamen in Matlab. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Auswahl der Perinexus. Zum Zuschneiden der Perinexus, Klick-und-halten, ziehen einen Auswahlrahmen um es (das Freistellen-Werkzeug wird automatisch ausgewählt) wie gezeigt durch den blauen Pfeil. Dieses Feld kann eingestellt werden, mithilfe der Quadrate an den Seiten und Ecken es größer oder kleiner machen. Der grüne Pfeil stellt das Ende des Perinexus, wobei der Nutzer gewährleistet sein sollte bleibt "offen." Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Serielle Bild Streckungen. Binäre Umriss ist wiederholt in 1-Pixel-Schritten (A-D) aufgedehnt und hinzugefügt, um das Bild (nicht-binären Form des Bildes, E-H) nach jeder Dilatation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Mittellinie Isolation und Wegfindung. Eine räumliche Ableitung errechnet sich aus dem fertigen Bild arbeiten (A) und das Ausmaß der die räumliche Ableitung (B) wird verwendet, um die Gliederung und die Mittellinie (weisse Pfeile) zu isolieren. Eine Benutzer-definierte Schwelle identifiziert den Umriss und Mittellinie und den ursprünglichen Umriss Subtraktion ergibt die Mittellinie (D). Jedoch Lücken in der Mittellinie durch den Schwellenwert (D - einfügen). Um eine kontinuierliche Mittellinie zu produzieren, wird eine sekundäre Dilatation auf der isolierten Mittellinie (E), gefolgt von einer sekundären Erosion, die rechnerische Effizienz eines nachfolgenden Pathfinding-Algorithmus durchgeführt. Dieses erodierte Bild (F) wird dann mit das Ergebnisbild zu arbeiten, ermöglicht die Identifizierung von eine kontinuierliche, ein Pixel Dicke Mittellinie kombiniert (G - einfügen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Letzte Datenpräsentation. Das Programm gibt den endgültigen Umriss auf das Originalbild TEM (A). Die Linie ist farbcodiert, grün für 0-150 nm, blau für die benutzerdefinierte Region von Interesse und rot für den Bereich über 150 nm. Darüber hinaus gibt das Programm ein ähnlich farbcodierte Diagramm vertreten W_p als Funktion des Abstandes von Anfang an von den Perinexus und für die Region von Interesse (B), sowie die durchschnittliche W_p (Einschub im jeweiligen Diagramm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 : Dilatation Kernel Form Analyse. Formen für Dilatation Kernel (A): der Stern in der Mitte symbolisiert die dilatative Pixel. Weiße Felder sind Pixel Dilatation, in Form von ein Plus, X, Box oder Zeile betroffen. Eine etwa horizontale Perinexus (B, oben, mit einer roten Linie auf 0°) gedreht wurde im Uhrzeigersinn von 0 bis 180° in Schritten von 10° und wiederholt dilatative mit unterschiedlichen Kernel-Formen (B, unten). Plus und linienförmigen Kerne produzieren ähnliche Ergebnisse, obwohl die Kernel Zeile an bestimmte Ausrichtungen fehlschlägt, während die kastenförmige und X-Kerne um 45° phasenverschoben sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8 : Bild Richtungskorrektur. Um korrekt für die Ausrichtung des Bildes, der durchschnittlichen Winkel von der Perinexus die Positionen von der Start - und end - points (A, Links, Beginn und Ende der schwarzen Linie) errechnet sich aus. Die umgekehrte Tangente der Veränderung in y-Richtung (A, linke, grüne Linie) geteilt durch die Änderung in der X-Richtung (A, Links, rote Linie) ergibt den Korrekturwinkel θ (A, Links, gelb). Ziel ist es, W_p den Durchschnittswert den Mindestabstand zwischen den Kanten geben dann zu korrigieren, als ob die Perinexus etwa horizontal abgebildet worden war (A, Links unten). Die Anwendung der Korrekturfaktor von Gleichung 1 beschrieben wurde gegenüber der berechneten θ vor der Analyse manuell drehen alle 15 zufällig ausgewählte Bilder. Die korrigierten Werte stark korreliert mit der gedreht-Image-Werte (R² = 0.991, A, rechts), Angabe der Gleichung 1 ist eine gültige Korrekturfaktor für Bildausrichtung. Um zu bestätigen, dass der Korrekturfaktor angemessen ist, wurden zwei Phantome perfekt parallele Kanten mit einem bekannten Abstand zwischen ihnen (B, Links) erzeugt. Phantom 1 und Phantom 2 haben räumliche Auflösungen von 2,833 Pixel / mm. und 71,6 Pixel/Zoll, beziehungsweise. Wie gezeigt durch die blauen Diamanten und roten Quadraten in B berechnet der Algorithmus in Ordnung, genau ihre breiten über 180° Bilddrehung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 9 : Algorithmus Reproduzierbarkeit. Mit den automatischen Ablauf mit Ausrichtung Bildkorrektur, beide erfahrener und unerfahrener Beobachter gefunden signifikante Unterschiede zwischen AF und No-AF Gruppen (A), mit einer früheren Studie erkennen eine minimale Differenz von 2,6 nm. Darüber hinaus fanden weder Beobachter einen signifikanten Unterschied im GJW (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

	Manuell	Automatisch
Zeit - obs. 1 (s)	205±11	44±14
Zeit - obs. 2 (s)	248±18	30±5
Räumliche Auflösung (Messungen/nm)	0,08	3.45

Tabelle 1: Vergleich der manuellen und automatischen Prozesse. Beide Beobachter benötigt weniger Zeit pro Bild die Gliederung als zu führen die manuelle Segmentierungsprozesses für ein Bild 10 Trainingssatz zu verfolgen. Darüber hinaus hat der automatische Prozess eine höhere Abtastfrequenz, Aufnahme 3,45 Messungen pro nm, verglichen mit einem Durchschnitt von 1 Messung jedes 12,5 nm für den manuellen Prozess. Die Ausbildung eingestellten Bilder in ergänzende Datei S5 zusammen mit Konturen und Messungen finden Sie wie ein erfahrener Benutzer durchgeführt.

Discussion

Der Algorithmus verwendet serielle Bild Dilatationen um die Anzahl der Pixel zwischen zwei gegenüberliegenden 2D Kanten in einem binären Bild, die in diesem Fall die Trennung zwischen Membran des Perinexus^{2,3,14 ist}. Eine räumliche Ableitung und einen Pathfinding-Algorithmus werden dann zur Isolieren der Mittellinie, gefolgt von einer sekundären Dilatation und Erosion Sequenz Lücken in der Mittellinie, ähnlich wie was, bevor Sie^{15 getan wurde}. Die Mittellinie wird dann mit dem endgültigen Dilatation-Graf Bild darzustellen Perinexal Breite als Funktion des Abstandes vom Anfang des Rand-Trennung, in diesem Fall Ende des GJ und Beginn der Perinexus¹⁶kombiniert.

Vier primäre Parameter sind frei definierbar in einem GUI zu Beginn des Programms:

1. Gradient Schwelle
2. Skala
3. Region von Interesse-Sortiment
4. Start-Punkt Auswahlmethode (automatisch oder manuell)

Die am häufigsten verwendete Mechanismus des Scheiterns für den Algorithmus ist das Versagen der Mittellinie, der Rand des Bildes, zu erreichen, die ist, wie der Endpunkt für die Wegfindung-Algorithmus bestimmt wird. Um solch ein Problem zu beheben, kann der Benutzer erhöhen den Farbverlauf Schwellenwert im Schritt 3.3.1, wodurch das Programm mehr Punkte aus dem räumlichen Derivative Bild auswählen, die die Rechenzeit gemäß der Pathfinding-Algorithmus zu erhöhen, wird beschrieben. Dieser Algorithmus erfordert daher einen Kompromiss zwischen Geschwindigkeit und Mittellinie Integrität Berechnung. Es ist wichtig zu beachten, dass, solange alle Punkte der Mittellinie von der räumlichen Ableitung, zusammen mit einem geeigneten Startpunkt identifiziert werden die räumlichen Derivative Schwelle wird keine Auswirkungen auf die Kante-Trennung-Messung.

Bildausrichtung scheint Dilatation Werte beeinflussen, weil der Kernel in 90 Grad Schritten, die Fehlermeldung einführen können weitet, wenn der Großteil der Region von Interesse in einem Winkel von 45° zu den Achsen der Dilatation Matrizen ist. Daher möglicherweise die Anzahl der Dilatation nicht immer eine genaue Darstellung des Raums zwischen den Rändern. Diese Einschränkung ist durch einen trigonometrischen Korrekturfaktor angesprochen worden, aber möglicherweise ignoriert werden konnte, wenn alle Bilder in einem Dataset in der gleichen Richtung ausgerichtet sind. Darüber hinaus sollte mit Vorsicht erfolgen bei der Interpretation der Ergebnisse, wie es möglich ist, dass Schnittebenen nicht perfekt senkrecht zu den beiden Membranen sind. In Abbildung 9Bverwenden wir GJW darauf hin, dass unsere Perinexus Bilder in der Ebene wurden. Dennoch ist es zwingend notwendig, dass Stichprobengrößen ausreichend dimensioniert um Stationspunkte Abweichungen zwischen den Bildern zu berücksichtigen sein. Darüber hinaus sollten unsere Perinexal Breite Messungen nicht interpretiert werden, angepasst in Vivo Räumen, aber dieser Ansatz wird verwendet, um durchschnittliche Unterschiede in der Perinexal Breite im Verhältnis zu einigen Intervention oder Krankheit Zustand messen.

Der aktuelle Algorithmus erfordert auch eine manuell verfolgt Gliederung der Kanten als Eingabe. Es ist wichtig zu beachten, dass, solange die Waage richtig eingestellt ist, räumlicher Auflösung keinen Einfluss auf den Algorithmus Messungen hat, wie die unterschiedlichen Auflösungen der Bilder in Abbildung 6 und ein zusätzliches Bild mit niedriger Auflösung in ergänzenden belegen S6-Datei. Der nächste Schritt bei der Verbesserung des Algorithmus ist menschliches Eingreifen vom Umriss Generation zusammen mit einem Tool entfernen, die den gewünschten Bereich auswählen können. Diese Funktionen würden wahrscheinlich erhöhen die Genauigkeit der Messung und Benutzer Vorspannung reduzieren.

Diese rechnerisch effiziente Algorithmus bietet eine schnellere Methode, erfordert ungefähr ein Fünftel der Arbeitsstunden zur Quantifizierung der Perinexus ohne nachweisbare Strafe auf Reproduzierbarkeit im Vergleich zu den manuellen Segmentierungsprozesses. Darüber hinaus nutzt die manuelle Segmentierung-Prozess eine Messung alle 15 Nanometer Quantifizierung Perinexal Breite, was zu unter Probenahme führen kann, da die Membran-Trennung von der Perinexus innerhalb dieser 15 nm-Bereich erheblich ändern kann. Im Gegensatz dazu hat das automatisierte Programm eine Ortsauflösung entspricht derjenigen der bildgebenden Modalität, in diesem Fall 2,9 Pixel pro Nanometer entlang der Länge des Perinexus, daher liefert einen feiner aufgelöst Durchschnitt der Perinexal Breite.

Während die Anwendungen im Bereich der kardialen Strukturbiologie vielversprechend sind und aufregend, dieser Algorithmus verwendet sich nicht auf TEM Bilder beschränken. Jeder Bereich erfordert eine präzise, hochauflösende Messung zweier quasi parallel 2D Kanten machen kann dieses Algorithmus verwenden. Der Algorithmus kann verwendet werden, etwas vom Flussufer Erosion und Hochwasser Muster aus Satellitenbildern zu vaskulären Entwicklung mit Hellfeld oder fluoreszierende Mikroskopie verfolgen. Eines der vielversprechendsten möglichen Anwendungen ist im Bereich der Kardiologie und Messung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (EF) mit Point-of-Care kardiale Echokardiographie. Derzeit ist die Standardtechnik der Doppeldecker-Methode von Festplatten¹⁷, wenn ein neuer Algorithmus, AutoEF, derzeit Schneide EF-Quantifizierung Methode^{18,19 werden}. Für Doppeldecker-Methode von Datenträgern die betreffende Kammer manuell verfolgt und quantifiziert mit einer modifizierten Simpson Methode, wobei die Gesamtlautstärke durch die Summierung der gestapelten elliptischen Scheiben automatisch berechnet wird. Die Haupteinschränkung bei dieser Methode ist, dass es nur die totale Querschnittsfläche der gewünschte Kammer, mit keine Lösung gelangen für bestimmte Regionen von Interesse, zu identifizieren und auch erhebliche menschliches Zutun und Know-how erfordert. Die neuere Methode, AutoEF, identifiziert und beschreibt den Rand des Ventrikels mit Hilfe eines 2D speckling Algorithmus und berechnet dann die ventrikuläre Querschnittsfläche. Dieser Prozess hat während präzise und effizient zur Messung der linksventrikulären Bruttofläche, auch eine ähnliche inhärente Einschränkung nur totale Querschnittsfläche zu messen. Diese primäre Nachteil begrenzt Kliniker diagnostischen und therapeutischen Fähigkeiten. Im Gegensatz dazu der Algorithmus präsentiert in dieser Handschrift erkennen eine Mittellinie und hat eine Auflösung entspricht die Auflösung der bildgebenden Modalität zu bestimmte Regionen des Interesses zu lokalisieren. Dies ist wichtig, da Ultraschall-Scanner mit einer räumlichen Auflösung Mikrometer handelsübliche^{20,21 sind}, was bedeutet, dass dieser Algorithmus könnte lokalisierte Wand Bewegung Anomalien bei der Auflösung von Mikrometern zu erkennen statt Zentimeter. Während dieser Anwendung experimentell überprüft werden muss, ist es eine der unmittelbarsten vielversprechenden Anwendungen dieses Algorithmus. In der Tat, es könnte leicht kombinierbar mit der Speckle tracking-Funktionen von AutoEF oder die manuelle Spuren in manuellen Planimetrie, höherer Auflösung Informationen parallel zu herkömmlichen EF-Daten verwendet.

So vielseitig und anwendbar, da der aktuelle Algorithmus ist, wurde es für 2D Bilder entwickelt. Jedoch, wie imaging-Technologien zu verbessern weiter, gibt es eine steigende Nachfrage für 3- und 4-D-Quantifizierung-Technologien. Daher ist die nächste Iteration des Algorithmus, den gleichen Ansatz, seriell Dilatation ein binäres Bild auf ein 3-dimensionales Objekt, wo automatisch definieren eine Mittellinie derzeit über die Möglichkeiten der aktuellen imaging-Programme ist anzupassen. Solcher Algorithmus hätte breite Anwendungen klinisch und experimentell im kardiologischen Bereich allein, auch 3D kardiale Echokardiogramm^22,23, 3D Elektronenmikroskopie^{24,25, 26}und 3D Magnetresonanz-Tomographie^27,28,29.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Touchscreen-Monitor	Dell	S2240T	Benötigt einen Stift mit weicher Spitze
Desktop	Dell	Precision T1650	8 GB RAM
Betriebssystem	Microsoft	Windows 7 Enterprise	64-Bit-Betriebssystem
Programmplattform	Mathworks	Matlab R2015b	Programm ist möglicherweise nicht kompatibel mit neueren/älteren Versionen von Matlab