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Methodenartikel

Nachweis und Isolierung von apoptotischen stellen hohe Reinheit

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DOI:

10.3791/58317

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12. August 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Genetics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Zusammenfassung

Apoptotic Bodies (ApoBDs), Microvesicles und exosomen gehören die extrazelluläre Vesikel-Familie, mit ApoBDs als eines der größten Art aus. Es wurde vorgeschlagen, dass ApoBDs Zelle sowie interzellulären Kommunikation durch Menschenhandel Biomolekülen unterstützen kann. Herkömmliche Ansätze zur Identifizierung und Isolierung von ApoBDs sind häufig durch das Fehlen der genaue Quantifizierung und niedrigen Probe Reinheit beschränkt. Hier beschreiben wir einen Workflow zur bestätigen die Induktion der Apoptose, ApoBD Bildung zu überprüfen und ApoBDs zu hoher Reinheit zu isolieren. Wir werden auch zu skizzieren und vergleichen Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und Differentielle Zentrifugation basierte Ansätze, ApoBDs zu isolieren. Darüber hinaus wird die Reinheit der isolierten ApoBDs bestätigt werden, mit einer zuvor Flow Cytometry-basierte Färbung und analytische Methode zu etablieren. Zusammengenommen mit dem beschriebenen Ansatz wurde THP-1 Monocyte Apoptose und apoptotische Zelle Demontage induzierte validiert und ApoBD generiert aus Monozyten THP-1 wurden isoliert zu einer Reinheit von 97-99 %.

Einleitung

Apoptose, eine gut untersuchte Form des programmierten Zelltods, ist erforderlich, um die physiologischen Homöostase aufrechtzuerhalten und potenziell schädliche Zellen im menschlichen Körper1zu entfernen. Nach der Induktion der Apoptose können apoptotische Zellen (ApoCells) durchlaufen eine Reihe von morphologischen Veränderungen und Zerlegen in kleinen Membrane-springen Vesikel bezeichnet ApoBDs. Insgesamt ist dieser Prozess ist bekannt als apoptotische Zelle Demontage und kann in 3 verschiedene Schritte anhand der Morphologie2,3geteilt werden. Schritt 1 (Plasmamembran Blebbing) zeichnet sich durch die Bildung von Ballon-ähnliche Strukturen auf der Zelloberfläche, bekannt als Blebs4,5. Schritt 2 (Apoptotic Vorsprung Bildung) umfasst die Bildung von langen Membran Vorsprünge z. B. Apoptopodia, Perlen-Apoptopodia und Mikrotubuli Spitzen6,7,8. Schritt 3 (ApoBD Bildung) umfasst schließlich die Fragmentierung des apoptotischen Vorsprünge und/oder ApoCells ApoBDs6,9erzeugen. Bisherigen Erkenntnisse haben eine Rolle von ApoBDs in Beihilfe apoptotische Zelle Abstand und Vermittlung interzelluläre Kommunikation vorgeschlagen. Zum Beispiel wird vorgeschlagen, dass die Zersplitterung der ein ApoCell in ApoBDs kleine "mundgerechte" Stücke generieren kann, die durch Phagozyten2,10,11Umgebung leicht entfernt werden konnte. Darüber hinaus können ApoBDs beherbergen eine Reihe von Biomoleküle wie DNA, RNA und Proteine, die zu den umliegenden Zellen Zellezelle Kommunikation12,13,14zu erleichtern gehandelt werden können. Um diese Prozesse funktional zu untersuchen, ist es wichtig, die drei wichtigsten Parameter einschließlich (i) Validierung der Apoptose-Induktion und ApoBD Bildung, (Ii) Isolierung von ApoBDs und (Iii) die Bestätigung der ApoBD Reinheit zu bestätigen.

Bisher wurden eine Reihe von Methoden, einschließlich der Durchflusszytometrie und Elektronenmikroskopie zur Apoptose und ApoBDs15,16,17,18zu studieren. Allerdings sind ApoBD Erkennung und Quantifizierung oft schwierig oder übersehen. Zum Beispiel routinemäßig verwendet Flow Cytometry-basierte Apoptose assay beschäftigt annexin V (A5, ein Protein, das die externalisierte bindet "Essen-mich" Signal Phosphatidylserin (PtdSer)) und Nukleinsäure Flecken Propidium Jodid (PI)19. Jedoch mithilfe dieses universelle Fleck Kombination Analyse setzt voraus, dass es nur drei Arten der Zelle Teilmengen (lebensfähige Zellen, ApoCells und nekrotische Zellen) in der Probe gibt. Darüber hinaus obwohl von vielen Forschern für die Apoptose als "Goldstandard" betrachtet, Durchflusszytometrie assays und anschließende Datenanalyse schließt oft ApoBDs durch gating zunächst FSC/SSCZwischenprodukt hoher Ereignisse auswählen. Also, vor kurzem haben wir einen neuartige Flow Cytometry Assay mit A5 und TO-PRO-3, ein weiteres Nuclein-Fleck, der selektiv durch Caspase 3/7-aktivierte Pannexin 1 (PANX1) aufgenommen werden kann Kanäle7,20. Wie Caspase 3-induzierte PANX1 Aktivierung PtdSer Exposition in der Frühphase der Apoptose vorausgeht, Flecken TO-PRO-3 differentiell apoptotische und nekrotischen Zellen. Darüber hinaus enthält dieser Ansatz kombiniert mit unserem Roman Anspritzung Strategie alle erworbenen Ereignisse während der Datenanalyse und infolgedessen sechs Zelle/Partikel Teilmengen werden identifiziert, einschließlich: (i) lebensfähige Zellen (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5niedrig , TO-PRO-3niedrige), (Ii) A5– frühe ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5niedrig, TO-PRO-3Mittelstufe), (Iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5hoch , TO-PRO-3Mittelstufe), (iv) nekrotische Zellen oder späten ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5hoch, TO-PRO-3hohe), (V) ApoBDs (FSC/SSCniedrig, A5zwischen-, TO-PRO-3niedrig / Fortgeschrittene), und (vi) Schutt (FSC/SSCniedrig, A5niedrig, TO-PRO-3niedrige)20. Unser Ansatz betont die Bedeutung der Analyse alle Zellen/Partikel Teilmengen und noch wichtiger ist, die Trennung der ApoBDs von Zellen und Schutt20. So zeigt dieser Ansatz eine effiziente Technik um die Induktion der Apoptose und ApoBD Bildung gleichzeitig zu überprüfen.

ApoBDs traditionell durch eine Vielzahl von Ansätzen Differentielle Zentrifugation isoliert wobei ApoBDs von Zellen oder anderen extrazellulären Vesikel anhand der Dichte getrennt werden können. Allerdings sind solche Zentrifugation Methoden oft durch niedrige ApoBD Reinheit, Mangel an eine Quantifizierung Schritt zur Probe Reinheit und/oder Unfähigkeit, Zelle typspezifischen ApoBDs17,21,22trennen bestätigen begrenzt. Daher entwickelten wir vor kurzem zwei Ansätze, ein FACS-basierten und einen neuen Differentielle Zentrifugation basierenden Ansatz, welche mit unserer vorher festgelegten Flow-zytometrie-Methode, die Induktion der Apoptose und Probe Reinheit23validieren gekoppelt werden kann. ApoBD Isolierung über unsere FACS basierenden Ansatz kann ApoBDs bis zu 99 % Reinheit bereichern und koppelbar mit einer Vielzahl von Zelle-spezifischen Antikörper gegen ApoBDs von gemischten Zellpopulationen, Gewebeproben und Körperflüssigkeiten23zu isolieren. Darüber hinaus zeigt unsere überarbeitete Differentielle Zentrifugation Ansatz eine effiziente Methode, um ApoBDs zu isolieren > 90 % Reinheit23.

In diesem Papier beschreiben wir ausführlich unsere Versuchsanordnung um Apoptose-Induktion, zu validieren und zu erkennen und ApoBD Bildung zu quantifizieren. Auch die ApoBD Isolierung Workflows mit FACS-basierte und Differentielle Zentrifugation basierenden Methoden ausgearbeitet und im Vergleich. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die beschriebene Methodik ein effektives modernstes Werkzeug für zukünftige ApoBD Studien bietet.

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Protokoll

1. Induktion der Apoptose

  1. Zentrifuge Zellprobe bei 300 X g für 5 min und verwerfen überstand, alle bereits bestehenden Zelle Ablagerungen zu entfernen.
    Hinweis: Bei der Verwendung von adhärenten Zellen Zellen im Voraus Samen und Waschen mit 1 x Phosphat-gepufferte Lösung (PBS) vor der Apoptose-Induktion.
  2. Bestimmen Sie Anzahl von Zellen und sammeln Sie Zellen zu.
    Hinweis: Je nach Test Post-Isolierung empfehlen wir eine Zelle Anfangszahl von mindestens 1 x 107 Zellen.
  3. Aufschwemmen Sie in komplette Medien (jeweils 10 % (Vol/Vol) fetalen Kälberserum, 50 IU/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin Mischung-haltigem Medium) für eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL.
  4. Aliquoten ~ 2 x 106 Zellen pro Bohrloch eine 6-well-Platte.
  5. Um Apoptose induzieren, die Platte Deckel abnehmen und Zellen bei 150 mJ/cm2 mit einem UV-Strahler zu bestrahlen. Dies dauert ca. 30-60 s.
    Hinweis: Vor der Bestrahlung, sicherzustellen Sie, dass ~0.5 X 106 Zellen für die "Unbehandelt" zellkontrolle aufbewahrt werden.
    Hinweis: Apoptose kann auch über andere Methoden wie Anti-Fas oder Serum Hunger6induziert werden.
  6. Inkubation bei 37° C, 5 % CO2 für 2 bis 8 Stunden, abhängig von der Zell-Linie.
  7. Mit einem Bench Top Lichtmikroskop, visualisieren Sie Zellen, um das Vorhandensein des apoptotischen Morphologien, z. B. Blebbing Apoptopodia Bildung und ApoBD Bildung zu bestätigen.
    Hinweis: 40 X Vergrößerung ist ausreichend
  8. Mit einer Pipette P1000, pipette und Apoptotic Proben sammeln.
  9. Waschen Sie die Platte mit 1 X PBS und kombinieren Sie mit restlichen Probe um maximalen Ertrag zu gewährleisten.
  10. Sammle ~1/10th für die "gesamte Apoptotic Probe" (WAS) steuern.
  11. Die "Unbehandelte" Probe zu sammeln.
  12. Zentrifugieren Sie die WS und unbehandelt Proben bei 3.000 x g für 6 min.
  13. In 1 mL 1 X PBS aufschwemmen und beiseite auf Eis.
  14. ApoBD Isolierung weiterhin entweder Schritt 2 oder 3 mit der restlichen Apoptotic Probe.

2. ApoBD Isolation über FACS

  1. Zentrifugieren Sie die gesamte Probe bei 3.000 x g für 6 min.
  2. Entfernen Sie den Großteil der Überstand ohne Unterbrechung das Pellet.
  3. In einer Färbelösung enthält 1 mL 1 x A5 Bindung Puffer, 75 µL A5-FITC und 2 µL des TO-PRO-3 pro 1 x 107 Zellen aufzuwirbeln.
  4. Inkubieren Sie Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min.
  5. Fügen Sie 1-2 mL 1 x A5 Bindung Puffer und Zentrifugieren Sie Probe bei 3.000 x g für 6 min um überschüssige Fleck zu entfernen.
    Hinweis: Für gemischte Zellpopulationen oder Gewebeproben, führen Sie einen Antikörper Färbung Schritt mit einer Kombination aus Zelle Typ-spezifische Marker in 1 x A5 Bindung Puffer und inkubieren Sie auf Eis für 20 min (oder entsprechend des Herstellers Protokoll) vor Zentrifugation bei 3.000 x g für 6 Min.
  6. Aufschwemmen Probe Pellet in 3 mL FACS-Puffer (1 X PBS, 1 x A5 Bindung Puffer, 10 % FSC, 2 mM EDTA) pro 1 x 107 Zellen.
  7. In einem Rundboden, Polypropylen (Durchflusszytometrie) Rohr durch ein 70 µm Zelle Sieb Filtern und Proben auf Eis und im Dunkeln halten.
  8. FACS Maschine schalten Sie ein und durchführen Sie Standardsatz mit einer Düse 100 µm, führen Sie die Drop-Verzögerung und gewährleisten Sie einen stabilen Strom.
  9. Laden Sie die Probe und Geschwindigkeit auf ~ 1000 Ereignisse/s festgelegt.
  10. Einstellen Sie FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) und FITC (A5) Spannungen und positionieren Sie Ereignisse innerhalb der FACS Plots, um sicherzustellen, dass Populationen klar getrennt werden können.
  11. 20.000 Ereignisse aufzeichnen.
  12. Richten Sie eine gating Strategie wie in Teil 4.
  13. Fügen Sie in der Art-Layout das letzte ApoBD Tor als die gewünschte Sortierung Bevölkerung hinzu.
  14. Beginnen Sie Erwerb der Probenmaterials und führen Sie eine Test-Art durch das Sammeln von 5.000-10.000 ApoBDs in einen neuen Schlauch, ~ 250 µL FACS Puffer enthält.
  15. Führen Sie ein System wieder bündig und laden Sie sortierte ApoBDs zu.
  16. Erwerben Sie und notieren Sie Test-Art ApoBDs.
  17. Überprüfen Sie, ob die ApoBD Reinheit ~ 99 % ist durch Vergleich FSC (y-Achse) Vs A5 (x-Achse Veranstaltungen).
    Hinweis: A5 Färbung kann leicht reduzieren bei der Analyse der Proben durch Laser-bleaching wieder.
  18. Hoher Reinheit erreicht, Originalmuster zu laden und weiter sortieren, bis die gewünschte Anzahl an ApoBDs gewonnen wurde.
    Hinweis: Falls erforderlich, kann doppelte Sortierung durchgeführt werden um ApoCells und ApoBDs gleichzeitig zu isolieren.
    Hinweis: Beim Sortieren über einen langen Zeitraum hinweg empfehlen wir dem Sammelrohr bei 4 ° c inkubieren
  19. Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, sammeln Sie einen kleinen Teil des Post-Art ApoBDs, Post-sortieren Sie ApoCells, unbehandelt und WAS Apoptose zu überprüfen und bestätigen nach Art Reinheit.
    Hinweis: Obwohl die Test-Sortierung und Post-Art Reinheit nicht erheblich abweichen sollte, basiert diese auf die Stream-Einstellungen und Stabilität.

3. ApoBD Isolation über Differentielle Zentrifugation

  1. Zentrifugieren Sie die restlichen Apoptotic Probe bei 300 X g für 10 min.
  2. Erfassen des Überstands, ~ 500 µL um nicht zu stören das Pellet Zelle zu verlassen und in ein neues 15 mL konische Röhrchen hinzufügen.
  3. Entfernen Sie die restlichen 500 µL und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL 1 X PBS (Dies entspricht die ApoCell angereicherte Fraktion.
  4. Zentrifugieren Sie die gesammelten überstand für 20 min bei 3.000 g.
  5. Überprüfen Sie, ob ein Pellet und entfernen Sie vorsichtig den überstand (Überstand kann kleine extrazelluläre Vesikel einschließlich Microvesicles und exosomen enthalten).
  6. Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL 1 X PBS (Dies entspricht den 'ApoBD-angereichert' Bruch)
  7. Sammeln Sie 100 µL der einzelnen lebensfähig, WS, ApoCell bereichert, und ApoBD angereicherte Proben in einer neuen Rundboden, Polystyrol (Durchflusszytometrie) Rohr.
  8. Hinzufügen von 100 µL der Fleck mit 2 x A5-Bindung Puffer, 1: 100 A5-FITC und 1:1,000 TO-PRO-3
  9. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min in der Dunkelheit.
  10. Analysieren Sie Proben von Durchflusszytometrie, mit der gating-Strategie wie oben beschrieben, um die erfolgreiche Induktion der Apoptose und Reinheit der ApoBD angereicherte Fraktion zu validieren.

4. die Durchflusszytometrie Anspritzung Strategie

  1. Plot-TO-PRO-3 (y-Achse) gegen FSC (x-Achse), nekrotische Zellen (TO-PRO-3hoch) von allen anderen nicht-permeabilized Veranstaltungen (TO-PRO-3Low/Mittelstufe) zu trennen.
  2. Wählen Sie alle nicht-permeabilized Ereignisse und plot-SSC gegen A5. Tor, zwei Populationen einschließlich Bevölkerung 1 (P1), SSCmittleren/hohen,niedrigen/mittleren Zellen A5 und 2 (P2), alle anderen Ereignisse.
  3. P2 plot TO-PRO-3 gegen A5 und wählen Sie A5mittleren/hohen Veranstaltungen alle zellenrückstand auszuschließen.
  4. Wählen Sie alle A5 positive Ereignisse und Plotten Sie FSC gegen A5. ApoCells (FSCMittelstufe/hohe) ApoBDs (FSCniedrig) trennen.
    Hinweis: Bei ApoBDs für ApoBD Isolierung über der FACS basierenden Ansatz gating, empfehlen wir einen endgültigen Schritt durch ApoBDs und TO-PRO-3 bis A5 vergleichen und auswählen alle Ereignisse. Dies sorgt dafür, dass die endgültige sortierschleuse Fluoreszenz anstelle von FSC/SSC-Parameter verwendet.
  5. Wählen Sie P1 für tragfähige Zellanalyse und führen Sie einen der beiden gating Strategien. Plotten Sie für allgemeine tragfähige Zellanalyse FSC gegen A5 und markieren Sie alle FSCmittleren/hohen Zellen, daher entfernen verbleibenden zellenrückstand. Alternativ für eingehende Analyse, lebensfähige Zellen trennbar von A5– frühen ApoCells von TO-PRO-3 gegen FSC Plotten. Wählen Sie TO-PRO-3niedrige, FSCmittleren/hohen lebensfähige Zellen und TO-PRO-3intermediate, FSCmittleren/hohen A5– frühe ApoCells.

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Ergebnisse

Hier beschriebene Verfahren verwenden, THP-1 Monocyte Apoptose induziert wurde und ApoBDs wurden erkannt und isoliert entweder über eine FACS-basierte oder eine Differentielle Zentrifugation Ansatz (Abbildung 1). Erstens Apoptose induziert wurde durch UV-Bestrahlung und Proben wurden nach 2-3 h Inkubation gesammelt, wenn Zellen Apoptose Morphologien, einschließlich Blebbing, apoptotischen Membran Vorsprung Bildung und die Generation der ApoBDs

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Diskussion

Seit seiner frühen Beschreibung in den 1950er Jahren avancierte das Feld der Apoptose deutlich, immer ein prominenter Forschungsgebiet. Trotz der breiten Interesse und umfangreiche Bemühungen sind bestimmte Aspekte der Apoptose, insbesondere die Bildung von ApoBDs, aufgrund des Fehlens geeigneter Methoden nicht gut untersucht worden. Dazu gehören vor allem die Einschränkung bei der Verfolgung von Apoptose Progression und ApoBD Bildung gleichzeitig mit der traditionellen Durchflusszytometrie A5/PI-Analyse und die Verunrei...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Das funktionierte wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health und Medical Research Council (GNT1125033 und GNT1140187) und Australian Research Council (DP170103790), I.K.H.P.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellen z.B. kultivierte humane THP-1-Monozyten (Klonnummer: TIB-202)ATCC-RPMI
1640 MediumLife Technologies22400-089
Penicillin-Streptomycin-GemischLife Technologies15140122
FSCGibco10099-141
1x PBS--
Annexin V FITCBD
iodidLife TechnologiesT3605TO-PRO-3 kann Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen. Vermeiden Sie direkten Kontakt.
10x Annexin V BindungspufferBD Bioscience556454
EDTASigma-Aldrich1001710526
Zentrifugenröhrchen (15 mL)Cellstar188271
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)Sarstedt72.690.001
Gewebekultur-Inkubator (37 &Grad; C, 5% CO2)--
ZentrifugeBeckman Coulter392932
FACS ARIA III Durchflusszytometer, konfiguriert mit zwei Lasern für die FITC- und APC-DetektionBD Bioscience-FACS
Canto II Durchflusszytometer, konfiguriert mit zwei Lasern für FITC- und APC-DetektionBD Bioscience-FACS
Diva 6.1.1 SoftwareBD Bioscience-
FlowJo 8.8.6 Software--
  UV Stratalinker 1800Stratagene-
Bioscience-TO-PRO-3

Referenzen

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