Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.

Abstract

Fluoreszenz-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug biologische Moleküle in Situ zu erkennen und ihre Dynamik und Interaktionen in Echtzeit zu überwachen. Neben konventionellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie wurden verschiedene bildgebende Verfahren entwickelt, um spezifische experimentelle Ziele zu erreichen. Einige der weit verbreiteten Techniken umfassen Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (SmFRET), die Konformationsänderungen und molekulare Interaktionen mit Ångström Auflösung und Einzelmolekül-Erkennung-basierten berichten können Super-Resolution (SR) bildgebende Verfahren, die die räumliche Auflösung etwa zehn zu Lampentyp im Vergleich zur Beugung begrenzte Mikroskopie erhöhen kann. Hier präsentieren wir Ihnen ein Kunde entwickelt integriertes System, das mehrere bildgebende Verfahren in einem Gerät, einschließlich der konventionellen Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich SmFRET Bildgebung. Verschiedene bildgebende Verfahren können durch optische Schaltelemente leicht und reproduzierbar erreicht werden. Dieses Set-up ist einfach, von jedem Forschungslabor in den biologischen Wissenschaften mit einem Bedürfnis nach Routine und diverse bildgebenden Experimenten zu einem reduzierten Preis und Platz im Vergleich zu separaten Mikroskope für individuelle Zwecke bauen erlassen.

Introduction

Fluoreszenz Mikroskope sind wichtige Werkzeuge für die moderne biologische Forschung und Fluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Biologie Labors routinemäßig durchgeführt. Durch tagging Biomoleküle mit Fluorophore, können wir direkt unter dem Mikroskop zu visualisieren und erfassen die zeitabhängige Änderungen in Lokalisierung, Konformation, Interaktion, und Montage Zustand in Vivo oder in Vitro. Herkömmlichen Fluoreszenz Mikroskope haben eine Beugung begrenzte Ortsauflösung, die ~ 200-300 nm in seitlicher Richtung und ca. 500-700 nm in axialer Richtung^1,2, und sind daher beschränkt auf Bildgebu....

Protocol

(1) Mikroskop Konstruktion und Montage

1. Erregung Weg
   Hinweis: Der Erregung-Pfad enthält, Laser, differential Interferenz Kontrast (DIC) Komponenten, die Mikroskop-Körper und seine Beleuchtung Arm.
   1. Bereiten Sie einen Vibration isoliert optischen Tisch. Beispielsweise bietet eine strukturelle Dämpfung Tabelle mit 48 x 96 x 12'' genügend Platz für alle Komponenten.
      Hinweis: Erstellen Sie das Setup in einem Raum mit Temperaturregelung (z. B.21,4 ± 0,55 ° C). Temperaturstabilität ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der optischen Achse.
   2. Installieren Sie einen Mikroskop-Körper, der ausgestattet ist mit Beleu....

Results

Dieses Mikroskop ermöglicht flexible und reproduzierbare Umschalten zwischen verschiedenen bildgebenden Verfahren. Hier zeigen wir Beispielbilder mit jedem imaging Modul gesammelt.

Abbildung 5 zeigt die PSF des Moleküls blinken auf während der SR-Übernahme. Tausende solcher Bilder sind rekonstruiert worden, um das endgültige Bild SR (Abb. 5E) zu generieren.

Discussion

Dieses Mikroskop Hybridsystem entfällt die Notwendigkeit, mehrere Mikroskope zu kaufen. Die Gesamtkosten für alle Teile, einschließlich der optischen Tisch, Tisch Einbau Arbeit, Software und Workstation, ist ungefähr $230.000. Benutzerdefinierte bearbeitet Teile, einschließlich der Mag Objektiv und 3-d-Objektiv kostet ca. $700 (der Preis hängt von der tatsächlichen Gebühren an verschiedenen Instituten). Typische kommerziell verfügbare integrierte Systeme für Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskopie mehr als 300.00.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E Mikroskopstativ	Nikon	Ti-E
Objektiv	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Mikroskopie-Bildgebungssoftware	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC enthält das Modul "JOBS", das programmierte Erfassungsmodul, das für die SR-Bildgebung verwendet wird.
Der Beleuchtungsarm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorisierte Beleuchtungseinheit M	Dieser Arm hat einen Schlitz für ein Vergrößerungsobjektiv Analyseblock
	Nikon	Ti-A	Dieser wird im Filterrevolver installiert.
Z-Drift-Korrektursystem	Nikon	PFS	Dieses System besteht aus dem Schrittmotor am Objektivrevolver, der IR-LED und einem Detektor
Optische Tischplatte	TMC	783-655-02R
Optische Tischsockel	TMC	14-426-35
647 nm Laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulierte Laser Diode 647nm 120mW inkl. Laserkopf, CDRH-Steuerbox, USB-Kabel und PSU (Power Supply Unit)
561 nm Laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm Laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulierte Laserdiode 488nm 60mW inkl. Laserkopf, CDRH-Steuerbox, USB-Kabel und Netzteil (Power Supply Unit)
405 nm Laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Rund, M2 < 1.3, rauscharm, CW, TTL bis zu 20 MHz. 2 BNC-Anschlüsse für TTL & Analog einstellen
Kühlkörper	Cobolt	11658 (HS-03)	Zwei Einheiten, Kühlkörper ohne Lüfter HS-03, Kühlkörper für 647 nm und 488 nm Laser
Kühlkörper	Coherent	1193289	Obis Kühlkörper mit Lüfter, 165 x 50 x 50 mm für den 561 nm Laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Zwei Einheiten, Kommunikationskabel für 647 nm und 488 nm Laser
Aluminium zur Höhenverstellung	McMaster-Carr	9146T35	Mehrzweck 6061 Aluminium, rechteckige Stange, 4 mm x 40 mm, 1' lang zum Anheben von 561 nm Laseraluminium
zur Höhenverstellung	McMaster-Carr	8975K248	Mehrzweck 6061 Aluminium, 1-1/4" dick x 3" Breite x 1' Länge zum Anheben von 405 nm Laser
BNC-Kabel	L-com	CC58C-6	RG58C Koaxialkabel, BNC Stecker / Stecker, 6,0 ft
BNC Adapter	L-com	BA1087	Koaxialadapter, BNC-Schott, geerdeter
SMA-auf-BNC-Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD-Laser verfügen über eine SMA-Schnittstelle, daher wird dieser Adapter für den BNC-Anschluss verwendet.
SMB-auf-BNC-Adapter	Fairview Mikrowelle	FMC1638316-12	SMB-Stecker auf BNC-Buchse Schottkabel RG316 Koaxialkabel in 12 Zoll für kohärente Obis-Laser
Datenerfassungskarte	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Kanäle, 800 kS/s Analoges Ausgabegerät zur Steuerung von Lasern, DIC-LED usw
Barrierefilter Radregler	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optischer Filterwechsler
Emissionsteiler	Cairn	OptoSplit III
Dichroitischer Strahlteiler	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroitischer Strahlteiler, der rote Emission von grüner Emission in OptoSplit III
Dichroitischer Strahlteiler	Chroma	T565LPXR-UF2	dichroitischer Strahlteiler, der grüne und rote Emission von blauer Emission in OptoSplit III
trennt Emissionsfilter	Chroma	ET700/75M	Zwei Einheiten, Emissionsfilter für rote Emission (wie Alexa Fluor 647) in OptoSplit III sowie im Barriere-Filterrad
Emissionsfilter	Chroma	ET595/50M	Zwei Einheiten, Emissionsfilter für gelbe/grüne Emission (wie Cy3B) in OptoSplit III sowie im Barriere-Filterrad
Emissionsfilter	Chroma	ET525/50M	Zwei Einheiten, Emissionsfilter für blaue Emission (wie Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III sowie im Barriere-Filterrad
Emissionsfilter	Semrock	FF02-447/60-25	Emissionsfilter für violette Emission (wie DAPI/Alexa Fluor 405), eingebaut in das Barriere-Filterrad
Dichroitischer Strahlteiler	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Dichromoider Multiband-Strahlteiler für 647-, 561-, 488- und 405-nm-Laseranregungen im Mikroskopkörper
DAPI-Filterset	Chroma	49000	eingebaut im Mikroskopgehäuse
Nikon Laser/TIRF-Filtercube		Chroma 91032
590 Langpassfilter	Chroma	T590LPXR-UF1	zur Kombination von 647 nm Laser und 561 nm Laser
525 Langpassfilter	Chroma	T525LPXR-UF1	zur Kombination von bereits kombinierten 647 nm und 561 nm Lasern mit 488 nm Laser
470 Langpassfilter	Chroma	T470LPXR-UF1	zur Kombination von bereits kombinierten 647 nm, 561 nm und 488 nm Lasern mit 405 nm Laser
Reinigungsfilter (647)	Chroma	zet640/20x	zur Reinigung anderer Wellenlängen aus dem 647 nm Laser
Laser Clean up Filter (488)	Semrock	LL01-488-25	zur Reinigung anderer Wellenlängen von der 488 nm
Laser-LED-Lichtquelle	Excelitas	X-Cite120LED	wird nur für DAPI-Bildgebung verwendet
Spiegelhalterung	Newport	SU100-F3K
Optische Stifte	Newport	PS-2
Leistungsmesser	Newport	PMKIT	Zur Messung der Laserleistung
Dichroitische Beamcombiner-Halterung	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematische Halterung, zum Halten dichroitischer Beamcombiner in der Laseranregungsbaugruppe
Sicherungsring	Thorlabs	CMRR	für dichroitische Beamcombiner-Halterungen
Faseradapterplatte	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Faseradapterplatte mit externem SM1 (1.035"-40) Gewinde
Z-Achse translatorische Halterung	Thorlabs	SM1Z	Z-Achsen-Translationshalterung, 30 mm Käfig-kompatibel
Achromatisches Doublet-Objektiv	Thorlabs	AC050-008-A-ML	und Oslash; 5 mm, gefasste achromatische Dubletten, AR beschichtet: 400 - 700 nm
Käfigplatte	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Käfigplatte mit M9 x 0,5 Innengewinde, 8-32 Gewindebohrer-Montagestange
	Thorlabs	ER4	Käfig-Montagestab, 4" lang, Ø 6 mm
Käfighalterung	Thorlabs	CP02B	30 mm Käfighalterung
Singlemode-Glasfaser	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patchkabel, PM, FC/PC auf FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multimode-Glasfaser	Thorlabs	M42L01	& Oslash; 50 & Mikro; m, 0,22 NA, FC/PC-FC/PC Glasfaser-Patchkabel, 1 m
achromatische Doublet-Linse (Mag-Linse)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25,0 mm, Ø 1/2" Achromatisches Doublet, ARC: 400-700 nm, eine konkave Linse in der "Mag-Linse"
Achromatische Doublet-Linse (Mag-Linse)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø 1/2" Achromatisches Doublet, ARC: 400-700 nm, eine konvexe Linse in der "Mag-Linse"
Sicherungsring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Kunststoff-Sicherungsring für Ø 1/2" Objektivtuben und Halterungen, für "Mag-Objektiv"
Nylon-bestückte Schraube	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0,5 Nylon-bestückte Stellschraube, 6 mm lang, zum Halten von "3D-Objektiv
3D-Objektiv	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rechteckige zylindrische Linse
EMCCD-Kamera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm Mehrkanalperlen	Thermo	T7279, TetraSpeck Mikrosphären roter
Farbstoff	Thermo	Alexa Fluor 647
gelbgrüner Farbstoff	GE Healthcare	Cy3
grüner Farbstoff	GE Healthcare	Cy3B
blauer Farbstoff	Thermo	Alexa Fluor 488