Methodenartikel

Herstellung von anisotropen Polymeren künstliche antigenpräsentierende Zellen für CD8 + T-Zell-Aktivierung

DOI:

10.3791/58332

⸱

12. Oktober 2018

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll, um schnell und reproduzierbar generieren biologisch inspirierten, biologisch abbaubaren künstlichen antigenpräsentierende Zellen (aAPC) mit einstellbaren Größe, Form und Oberfläche Protein Präsentation für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder in-vivo .

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPC) sind eine vielversprechende Plattform für Immunmodulation durch ihre starke Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Azelluläre Substrate bieten wichtige Vorteile gegenüber zellbasierte aAPC, einschließlich präzise Steuerung der Präsentation Signalparameter und physikalische Eigenschaften der Oberfläche aAPC zu modulieren, die Interaktion mit T-Zellen. aAPC konstruiert aus anisotropen Partikel besonders Ellipsoid Partikel haben gezeigt, dass effektiver als kugelförmige Gegenstücke an anregenden T-Zellen durch erhöhte Bindung und größere Fläche zur T-Zell, sowie kontaktieren als unspezifische Aufnahme und verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften reduziert. Trotz gestiegenen Interesse an anisotropen Partikel akzeptiert auch weithin Methoden zur Generierung der anisotropen Partikel wie Dünnschicht-Dehnung schwierig sein kann, zu implementieren und verwenden Sie reproduzierbar.

Zu diesem Zweck wir beschreiben ein Protokoll für die schnelle, standardisierte Herstellung von biologisch abbaubaren anisotropen partikelbasierte aAPC mit einstellbaren Größe, Form und Präsentation für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder in Vivozusammen mit Methoden, um zu signalisieren Ihre Größe, Morphologie und Oberfläche Eiweißgehalt zu charakterisieren und ihre Funktionalität zu bewerten. Dieser Ansatz zur Herstellung von anisotropen aAPC ist skalierbar und reproduzierbar, ideal für die Erzeugung von aAPC für "handelsübliche" Immuntherapien.

Einleitung

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Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPC) haben als immunmodulatorische Mittel Versprechen gezeigt, weil sie eine robuste antigenspezifischen T-Zell-Antwort generieren können. Wesentlich für diese Plattformen sind ihre Fähigkeit, entscheidende Signale für die T-Zellaktivierung effizient zu präsentieren. Azelluläre aAPC sind eine attraktive Alternative zur Zell-basierte aAPC, weil sie sind einfacher und kostengünstiger herzustellen, weniger Herausforderungen während der Scale-Up und Übersetzung und Risiken im Zusammenhang mit zellbasierten Therapien zu lindern. Azelluläre aAPC ermöglichen auch ein hohes Maß an Kontrolle über die Präsentation Signalparameter und physikalische Eigenschaften der Oberfläche, die mit T-Zellen-1-Schnittstelle wird.

aAPC muss ein Minimum von zwei Signalen für T-Zellaktivierung rekapitulieren. Signal 1 sorgt für Antigen-Erkennung und tritt auf, wenn die T-Zell-Rezeptor (TCR) erkennt und setzt sich mit einem MHC-Klasse I oder II trägt seine cognate Antigen ihren Höhepunkt bei der Signalisierung durch die TCR Komplex. Um die Antigen-Spezifität-Anforderung umgehen, tragen aAPC Systeme oft einen agonistischen monoklonale Antikörper gegen CD3-Rezeptor, der nonspecifically den TCR-Komplex stimuliert. Rekombinante Formen der MHC, besonders MHC Multimere wurden auch auf der Oberfläche des aAPC zur Antigen-Spezifität2,3liefern. Signal 2 ist ein costimulatory Signal, das T-Zell-Aktivität leitet. Um die Costimulation für die T-Zell-Aktivierung notwendig zu gewährleisten, wird der CD28-Rezeptor in der Regel mit einem agonistische Antikörper auf der Oberfläche aAPC präsentiert angeregt, obwohl andere costimulatory Rezeptoren wie 4-1BB erfolgreich gezielte4gewesen. Signalproteinen 1 und 2 sind in der Regel auf der Oberfläche der festen Partikel aAPC synthetisieren immobilisiert. In der Vergangenheit wurden aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich Polystyrol4,5 und Eisen Dextran6aAPC hergestellt. Bei neueren Systemen nutzen, biologisch abbaubaren Polymeren wie Poly (Milchsäure-co-glykolische Säure) (PLGA) aAPC zu generieren, die können einfach gekoppelt werden, um Proteine zu signalisieren, eignen sich für direkte Verwaltung in Vivound verzögerter Freisetzung von erleichtern kann gekapselt, Zytokine oder lösliche Faktoren, die T-Zell-Aktivierung7,8ergänzen.

Neben der Präsenz von signalproteinen notwendig unbedingt Rezeptor Engagement über eine ausreichend große Fläche während der aAPC/T Zelle Interaktion T-Zell-Aktivierung. So physikalischen Parameter der aAPC wie Größe und Form drastisch verändern ihre verfügbaren Kontaktfläche und Einfluss auf ihre Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Mikron mittelständische aAPC haben nachweislich effektiver auf anregende T-Zellen als ihre nanoskaligen Pendants9,10. Nano-aAPC haben jedoch überlegene Bioverteilung und bessere Entwässerung in die Lymphknoten, die ihre Leistung in Vivo über Mikro-aAPC11verbessern kann. Form ist eine weitere Variable des Interesses an partikelbasierte aAPC Systeme. Anisotrope aAPC vor kurzem nachweislich wirksamer als isotrop Partikel an anregenden T-Zellen, vor allem durch verbesserte Interaktion mit Zielzellen gepaart mit reduzierten unspezifische Zelle Aufnahme. Zellen bevorzugt an der Längsachse der Ellipsoid Partikel binden, und der größere Radius der Krümmung und flacher Oberfläche ermöglichen mehr Kontakt zwischen den aAPC und T-Zell-12. Die Längsachse der Ellipsoid Partikel schreckt auch Phagozytose, wodurch erhöhte Zirkulation Zeit im Vergleich zu sphärischen Partikel folgen in Vivo Verwaltung12,13. Aufgrund dieser Vorteile vermitteln Ellipsoid Teilchen größere Expansion der antigenspezifischen T Zellen in Vitro und in Vivo im Vergleich zu sphärischen Partikel, ein Effekt zu beobachten, bei der Mikro- und Nanoscales12, 13. Es gibt verschiedene Strategien, anisotrope Partikel zu fabrizieren, aber Dünnschicht-stretching ist eine einfache, allgemein anerkannten Methode verwendet, um eine Reihe von unterschiedlichen Teilchen Formen14zu generieren. Nach Synthese Partikel sind warfen in Filme und in einer oder zwei Dimensionen auf einer Temperatur oberhalb der Glasübergangstemperatur der partikelmaterial gestreckt. Der Film wird dann aufgelöst, um die Partikel abzurufen. Trotz wachsendem Interesse an anisotropen Partikel, aktuelle Ansätze zur Herstellung partikelbasierte aAPC beschränken sich meist auf isotrope Systeme und Methoden ändern, Kornform kann schwierig zu implementieren, nicht kompatibel mit bestimmten aAPC-Synthese Strategien und Mangel an Präzision und Reproduzierbarkeit15. Unsere Dünnschicht-Technik kann manuell durchgeführt werden oder in einer automatisierten Weise schnell anisotropen Partikel, die aus einer Vielzahl von biologisch abbaubaren Polymeren synthetisiert erzeugt, gestreckt, um eine gewünschte Seitenverhältnis in ein oder zwei Dimensionen15.

Basierend auf unserer bisherigen Arbeit, entwickelten wir einen biologisch abbaubaren Teilchen basierender Ansatz kombiniert mit skalierbaren Dünnschicht-stretching Technik rasch aAPC mit einstellbaren Größe und Form in einer standardisierten Weise für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder erzeugen in Vivo. Unsere Protein Konjugation Strategie lässt sich jede benutzt von Interesse an Carboxylgruppen an der Partikeloberfläche in einer gewünschten Dichte geben diesem aAPC-System ein hohes Maß an Flexibilität zu koppeln. Wir beschreiben auch Methoden zur Größe, Morphologie und Oberfläche Eiweißgehalt von aAPC zu charakterisieren und ihre Funktionalität in Vitrozu bewerten. Dieses Protokoll kann immunen Zellen ex Vivo oder in Vivo für eine Vielzahl von immuntherapeutischen Anwendungen erweitern leicht angepasst werden.

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Protokoll

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Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt.

1. Herstellung von sphärischen PLGA Partikel einstellbaren Größe

  1. Vorbereitung der Materialien für Partikelsynthese
    1. 5 % w/w Polyvinylalkohol (PVA) Lösung ansetzen.
      1. Ein Erlenmeyerkolben mit magnetischen Stir Bar 500 mL entionisiertem Wasser (DI) hinzu, und legen Sie auf Heizplatte Rührer bei 500 u/min und Monitor Temperatur mit Thermometer. Decken Sie mit Alufolie um Verdunstung zu verhindern.
      2. Wassertemperatur ca. 70 ° C erreicht, fügen Sie 25 g insgesamt PVA in kleinen Chargen im Laufe der Zeit PVA auflösen bevor Sie hinzufügen mehr warten.
      3. Wenn alle PVA (in der Regel 30-60 min) aufgelöst ist, lassen Sie Lösung kühl und steril Filter. Bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
    2. Film-Casting-Lösung von 10 % w/w PVA und 2 % w/w Glycerin vorbereiten.
      1. Ein Erlenmeyerkolben mit magnetischen Stir Bar 500 mL DI Wasser hinzufügen. 8 mL Glycerin durch Verreibung bei Raumtemperatur und Mischung hinzugeben.
      2. Stellen Sie Kolben auf Heizplatte Rührer bei 500 u/min und Monitor Temperatur mit Thermometer. Decken Sie mit Alufolie um Verdunstung zu verhindern.
      3. Lösung Temperatur ca. 70 ° C erreicht, fügen Sie 50 g insgesamt PVA in kleinen Chargen im Laufe der Zeit PVA auflösen bevor Sie hinzufügen mehr warten.
      4. Wenn alle PVA (in der Regel 60 min) aufgelöst ist, lassen Sie Lösung kühl und steril Filter mit einem Flaschenverschluss Vakuum Filtersystem mit einer Porengröße von 0,22 μm. Bei Raumtemperatur für eine spätere Verwendung zu speichern.
    3. Bereiten Sie eine 50 mL 1 % w/w PVA Lösung. Ein 100-150 mL-Becherglas fügen Sie 40 mL VE-Wasser und 10 mL 5 % PVA-Lösung (hergestellt in 1.1.1 hinzu).
    4. Bereiten Sie eine 100 mL 0,5 % w/w PVA Lösung. Ein 150-250 mL-Becherglas 90 mL VE-Wasser und 10 mL 5 % PVA Lösung hinzufügen.
    5. 0,5 % PVA Lösung und Ort in einem chemischen Haube auf einem Teller rühren bei Raumtemperatur bei 500 u/min eine magnetische Stir Bar hinzufügen.
  2. Mikropartikel Synthese
    1. 100 mg Poly (Milchsäure-co-Glykol Säure) abwiegen (PLGA) in ein Funkeln Fläschchen und lösen sich im 5 mL Dichlormethan (DCM). Wirbel um die PLGA aufzulösen.
    2. Stellen Sie Homogenisator in 50 mL 1 % PVA Lösung, so dass der Homogenisator so nah an den Boden des Bechers wie möglich ist, ohne es zu berühren. Homogenisator einschalten und auf gewünschte Geschwindigkeit einstellen – 3.200 u/min für 5 μm Durchmesser Partikel, 5.000 u/min für 3 μm, 15.000 u/min für 1 μm (zunehmende Homogenisierung Geschwindigkeit sinkt Partikelgröße). Einmal mit der gewünschten Geschwindigkeit, den Becher der PLGA-Lösung hinzu und 1 Minute lang homogenisiert.
    3. Nach der Homogenisierung, Gießen Sie die 1 % PVA, PLGA-Mikropartikel-Lösung in 100 mL 0,5 % PVA Lösung auf einen rühren Teller geben und unter Rühren für mindestens 4 Stunden für Lösungsmittel verdampfen in einer chemischen Kapuze.
    4. Die Partikel 3 Mal in VE-Wasser zu waschen.
      1. Gießen Sie die Partikel-Lösung in 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 3000 X g für 5 Minuten. Gießen Sie überstand und fügen Sie ca. 20 mL VE-Wasser.
      2. Aufschwemmen Sie Partikel durch aufschütteln. Sobald durch, füllen Sie konische Rohre bis 50 mL mit VE-Wasser.
      3. Waschen Sie wieder den gleichen Weg zweimal.
  3. Nanopartikel-Synthese
    1. 200 mg von PLGA in ein Funkeln Fläschchen abwiegen und in 5 mL von DCM auflösen. Wirbel um die PLGA aufzulösen.
    2. Ein Becherglas mit 50 mL 1 % PVA Lösung in Behälter mit Eis gefüllt. Legen Sie die sonikator Sonde im Becher so nah an der Unterseite wie möglich ohne Sie zu berühren. Beginnen Sie Beschallung zu und sofort fügen Sie PLGA-Lösung in das Becherglas hinzu. Beschallen mit einer Leistung von 12 W für 2 Minuten zu generieren-Nanopartikel mit einem ungefähren Durchmesser von 200 nm.
    3. Nach Beschallung, Gießen Sie die 1 % PVA, PLGA-Nanopartikel-Lösung in ein 100 mL 0,5 % PVA Lösung auf einen rühren Teller und rühren für mindestens 4 Stunden für Lösungsmittel verdampfen in einer chemischen Kapuze.
    4. Gießen Sie die Partikel-Lösung in 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 Minuten, um Mikropartikel entfernen. Entfernen Sie überstand und Gießen Sie in high-Speed-Zentrifuge-Röhren.
    5. Die Partikel 3 Mal mit VE-Wasser zu waschen. Für 15 Minuten bei 40.000 x g zentrifugieren. Gießen Sie überstand und in VE-Wasser durch Vortexen aufzuwirbeln. Waschen Sie wieder den gleichen Weg zweimal.

2. Herstellung von Polymeren Partikel abstimmbaren Form

  1. Nach dem Waschen PLGA Aufschwemmen Partikel dreimal, die Partikel in etwa 1 mL VE-Wasser. Partikel für endgültige Partikelkonzentration von 2,5 mg/mL Teilchen die Film-Casting-Lösung hinzufügen.
  2. Pipette Partikel Suspension in 10 mL Aliquots in 75 x 50 mm rechteckig Petrischalen für eindimensionale Dehnung oder in 15 mL Aliquots in 100 x 100 mm quadratische Petrischalen für zweidimensionale stretching. Entfernen Sie Bubbles von entweder Pipette oder drängen Luftblasen an der Seite zu und lassen Sie Filme über Nacht trocknen in einem chemischen Haube.
  3. Sobald Filme getrocknet haben, Filme von Kunststoffgeschirr mit Pinzette entfernen und Kanten von Filmen mit einer Schere abgeschnitten. Speichern Sie Kanten in einem 50 mL konische Röhrchen als sphärische Partikel verwendet werden.
    1. Laden Sie einen Film auf die automatisierte Dünnschicht streckvorrichtung durch die Montage eines Films auf Aluminium Blöcke. Film auf Aluminium Blöcke von einer Achse der Bahre (Abbildung 2) Halterung für 1D dehnen, indem man zwei kurze Kanten des Films zwischen zwei Stücke von neoprengummi. Mit einem Inbusschlüssel Schraube greift das Metall auf Kautschuk, den Film festzuhalten. Montieren Sie für 2D stretching alle vier Kanten auf vier Aluminium-Blöcke, auf beide Achsen (Abbildung 2) zu dehnen.
    2. Messung und Aufzeichnung der Länge des Films zwischen Aluminium-Blöcken auf einer Achse für 1D stretching oder beide Achsen für 2D Dehnung. Berechnen Sie den Abstand erforderlich, um den Film in ein oder zwei Richtungen basierend auf gewünschte Fach-Strecke zu dehnen.
    3. Legen Sie den Film geladen ausdehnende Vorrichtung in einem Ofen bei 90 ° C und bringen Sie den Film über 10 Minuten auf Temperatur zu. Legen Sie einen großen Becher in den Ofen mit einer kleinen Menge Wasser.
    4. Stretchfolie.
    5. Nach Abschluss dehnen Dehnung Gerät aus dem Ofen nehmen und 20 Minuten den Film auf Zimmertemperatur abkühlen lassen.
    6. Für 1D stretching, schneiden Sie die Folie aus der ausdehnende Vorrichtung an den Rändern. Schneiden Sie für 2D stretching und Speichern der Mitte des Films, die gleichmäßig gedehnt wird Platz auf beide Achsen. Filme in konischen Rohren mit 2 Filme pro Röhre legen und den Rest des Films verwerfen.
    7. Hinzu kommen etwa 25 mL VE-Wasser jede konischem Rohr und Wirbel bis die Filme aufgelöst haben.
    8. Wenn die Filme aufgelöst sind, waschen Sie Teilchen 3 Mal mit VE-Wasser.
      1. Für Mikropartikel konische Rohre, 50 mL und Zentrifuge bei 3000 X g für 5 Minuten füllen Sie, überstand Gießen Sie aus, fügen Sie ca. 20 mL VE-Wasser und Wirbel um Partikel aufzuwirbeln.
      2. Für Nanopartikel, Transfer Partikel, high-Speed-Zentrifuge-Röhren und Zentrifuge bei 40.000 x g für 15 Minuten, Gießen Sie heraus überstand, ca. 20 mL VE-Wasser und Wirbel um Partikel Aufschwemmen.
    9. Aufschwemmen Sie nach der dritten Wäsche Partikel in etwa 1 mL VE-Wasser. Nehmen Sie das Gewicht der Microcentrifuge Schlauch und das Rohr fügen Sie Partikel hinzu. Partikel in einem-80 ° C Gefrierschrank für 1 Stunde oder Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff einfrieren. Einmal gefroren, lyophilize Partikel über Nacht.
    10. Sobald lyophilisiert, wiegen Sie Partikel im Microcentrifuge Schlauch und subtrahieren Sie gespeicherte Gewicht im Leerrohr zur Ermittlung des Gewichts von gefriergetrockneten Partikeln.

3. Oberfläche Protein Konjugation künstliche antigenpräsentierende Zellen erstellen

  1. Bereiten Sie 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) Puffer. Eine 0,1 M Lösung von MES in Wasser und Anpassen des pH-Werts 6,0 durch Titration mit 1M Natronlauge (NaOH).
  2. Aufschwemmen Sie lyophilisierter PLGA/PBAE Mikro/Nanopartikel 20 μg/ml in MES Puffer durch aufschütteln. Einen Polypropylen Microcentrifuge Schlauch mit 900 μl des MES-Puffer zu füllen und das Rohr 100 μL der Partikel-Lösung hinzufügen.
  3. EDC/NHS-Lösung ansetzen. 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC) und 48 mg N-Hydroxysulfoxuccinimide (NHS) in 1 mL MES Puffer aufzulösen.
  4. Die Partikel und Vortex mischen fügen Sie 100 μL EDC/NHS-Lösung hinzu.
  5. 30 Minuten inkubieren Sie das Rohr auf einen Wechselrichter bei Raumtemperatur.
  6. Spin-down Mikropartikel bei 5.000 x g für 5 Minuten oder Nanopartikeln bei 17.000 x g für 5 Minuten. Den überstand verwerfen und erneut in 1 mL PBS durch Vortexen (Mikropartikel) oder beschallen bei 2-3 W für 5 Sekunden (Nanopartikel).
  7. Fügen Sie 8 μg das gewünschte Signal 1 Protein und 10 μg Anti-Maus CD28 (Klon 37,51 hinzu) Mikropartikel die Partikel. Fügen Sie für Nanopartikel 16 μg Signal 1 und 20 μg Anti-Maus CD28. Fügen Sie hinzu, um die Lautstärke in der Röhre zu 1,1 mL PBS.
  8. Über Nacht inkubieren Sie das Rohr auf einen Wechselrichter bei 4 ° C.
  9. Waschen Sie am nächsten Tag die Partikel. Spin-down Mikropartikel bei 5.000 x g für 5 Minuten oder Nanopartikeln bei 17.000 x g für 5 Minuten. Verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie Teilchen in 1 mL sterile PBS durch Vortexen (Mikropartikel) oder Beschallung bei 2-3 W für 5 Sekunden (Nanopartikel). Zweimal wiederholen.
  10. Aufschwemmen der Partikel in der gewünschten Konzentration in Kulturmedium für den sofortigen Einsatz. Aufschwemmen Sie für die langfristige Lagerung Partikel bei 10 mg/mL in einen 100 mM Saccharoselösung. Einfrieren, lyophilize, und speichern Sie die Partikel bei-80 ° C.

4. Charakterisierung und Bewertung von aAPC

  1. Charakterisierung von aAPC Größe und Form (Abbildung 3)
    1. Mikropartikel Größe und Form von bildgebenden Teilchen mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zu charakterisieren. Für SEM eingehalten Bildgebung, verbreitete lyophilisierter Partikel auf Kohlenstoff Band ein Aluminium tack und sputter-Mantel mit Gold-Palladium.
    2. Analysieren Sie Größe und Seitenverhältnis von Teilchen mit Bildanalyse-Software.
    3. Ermitteln, Partikelgröße, Skala mit Maßstabsleiste und Partikeldurchmesser zu messen. Wiederholen Sie für ca. 100 Teilchen zu bestimmen, die durchschnittlichen Partikeldurchmesser und erzeugen ein Histogramm der Partikelgrößen.
    4. Seitenverhältnis zu bestimmen, Messen Sie den Abstand in der Längsachse und die kurze Achse von Partikeln oder Längsachse durch kurze Achse aufzuteilen. Wiederholen Sie für etwa 50 Partikel der einzelnen Formen zu bestimmen, die durchschnittliche Partikelgröße Seitenverhältnis für jede Form und Histogramme zu generieren.
    5. Nanopartikelgröße und Form von imaging-Teilchen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) zu charakterisieren. Analysieren Sie Größe und Seitenverhältnis von Nanopartikeln mit Bildanalyse-Software wie unter 5.1.2. Alternativ Messen Sie sphärische nanopartikelgröße mit dynamische Lichtstreuung (DLS) oder Nanopartikel tracking-Analyse (NTA).
  2. Protein-Konjugation-Effizienz
    1. Bereiten Sie aAPC nach Methoden 1 bis 3, aber in Schritt 3,7 eindringmittel beschrifteten Signal 1 Eiweiß und Anti-Maus CD28. Nach der Konjugation und waschen Aufschwemmen der aAPC in 1 mL PBS für eine Endkonzentration von 2 mg/mL aAPC.
    2. Proteinstandards in einem schwarzen Polystyrol 96-Well Mikrotestplatte vorzubereiten. PBS in die erste Vertiefung der Platte 5 μg eindringmittel beschrifteten Signal 1 Eiweiß hinzufügen und 10 1:2 Verdünnungen in PBS in der Reihe der Platte zu machen. Lassen Sie das letzte auch leer. Wiederholen Sie diesen Schritt, um einen anderen Satz von Standards mit Gewebekulturen beschrifteten Anti-CD28 zu generieren.
    3. Pipette 100 μL der aAPC Lösung in replizieren Vertiefungen des schwarzen Polystyrol Mikrotestplatte in dreifacher Ausfertigung.
    4. Lesen Sie die Fluoreszenz auf ein Fluoreszenz-Platte-Leser bei den entsprechenden Wellenlängen. Verwenden Sie die Fluoreszenz-Messwerte von den Proteinstandards um Standardkurven für jeden fluoreszierende Antikörper zu erzeugen. Mit Hilfe der Standardkurve, berechnen Sie die Konzentrationen von Signal 1 und Anti-CD28 in jeder Probe gut und dann berechnen Sie die Höhe der Oberfläche Protein und Konjugation Effizienz (Abbildung 4A, Abb. 5A).
  3. Bewertung der aAPC für in-vitro- Stimulation von CD8 + T-Zellen
    1. Bereiten Sie B Medien (RPMI Medium ergänzt mit L-Glutamin, 10 % FBS, 1 % nicht-essentielle Aminosäure-Lösung, 1 % Natrium Pyruvat, 1 % MEM Vitamin Lösung, 92 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL Ciprofloxacin und 30 U/mL IL-2.
    2. Eine schwarz 6-Maus über CO2-Belastung zu opfern.
    3. Ernten Sie die Milz von der Maus nach einem vorher festgelegten Protokoll16. Sammeln Sie die Milz in einem 50 mL konische Röhrchen mit 10 - 15 mL PBS. Mit einem Stößel, Maische die Milz durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL konische Röhrchen. Waschen Sie beim Maischen das Sieb mit 40 mL PBS.
    4. Drehen Sie die splenocyten bei 300 X g für 5 Minuten. Der Überstand abgießen und Aufschwemmen der splenocyten in 4 mL Ack Lyse Puffer zur lyse der roten Blutkörperchen. Ermöglichen Sie das Rohr sitzen 1 Minute lang ungestört zu, dann fügen Sie PBS um das Volumen in der Tube 20 ml zu bringen.
    5. Drehen Sie die Zellen bei 300 X g für 5 Minuten. Der Überstand abgießen und die Zellen in 1 mL PBS Aufschwemmen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
    6. Drehen Sie die Zellen bei 300 X g für 5 Minuten und Aufschwemmen Sie des gewünschten Volumens der Zelle Trennung Puffer. CD8 + T-Zellen aus der Einzelzelle Suspension mit einer CD8 + negative Auswahl T-Zell-isolierungskit, nach der Hersteller-Protokolls zu isolieren.
    7. Nach Magnetische Trennung spin CD8 + T-Zellen bei 300 X g für fünf Minuten und entfernen Sie die Zelle Trennung Puffer. Zellen in 1 mL PBS aufschwemmen und die Zellen zu zählen. Beschriften Sie Zellen mit Carboxyfluorescein Succinyl Ester (CFSE-) laut Protokoll des Herstellers.
    8. Inkubieren 8.333 CD8 + T-Zellen und 0,0833 mg (oder gewünschte Dosis) von aAPC in 150 μL B Medien in jede Vertiefung eine 96 gut U-Gewebekultur behandelt Bodenplatte.
    9. 7 Tage bei 37 ° C inkubieren. Aktualisieren Sie nach 3-4 Tagen das Kulturmedium durch Zugabe von 75 μl frisches Medium in jede Vertiefung.
    10. Analysieren Sie nach 3 Tagen Inkubation CFSE gekennzeichnet Zellen auf einem Durchflusszytometer um Verbreitung zu bewerten. Jeder Peak Flow Cytometry CFSE-Histogramm stellt eine Generation von Zellen durch die CFSE-Verdünnung mit jeder aufeinanderfolgenden Zellteilung.
    11. Verwenden Sie nach 7 Tagen eine Hemocytometer, um die Anzahl der Zellen in jedem gut. Vor der Zählung, Fleck tote Zellen mit einer Trypan blau-Lösung. Abgestorbenen Zellen von der endgültigen zellenzahlen ausschließen. Normalisieren Sie die letzte Zelle Konzentration auf die Ausgangskonzentration berechnen die Falte-Erweiterung (Abbildung 4 und Abbildung 5).

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Ergebnisse

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Ein Schaltplan für die automatisierte 2D Dünnschicht streckvorrichtung ist in Abbildung 1angegeben. Ein Schaltplan und Beschreibung für eine 1D Dünnschicht streckvorrichtung erhält in Ho Et Al.17 , die der Spannrahmen aus Aluminium-Teile mit standard Fräsen und Bearbeitung Techniken aufgebaut ist. Ähnlich wie bei der 1D trage, bestehend aus die 2D Bahre metallische Griffe und Führungsschienen. Bidirektionale Gewindespindeln werden verw...

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt eine vielseitige Methode für die genaue teilchenerzeugung anisotropen Polymeren. Die dünne Folie dehnen hier beschriebene Technik ist skalierbar, reproduzierbare und preiswert. Alternative Techniken zur Erzeugung von anisotropen Partikel leiden viele Einschränkungen, einschließlich hohe Kosten, niedrige Durchsatz und begrenzte Partikelgröße. Die dünne Folie dehnen Ansatz ist auch vorteilhaft, weil die Partikel geändert werden, um nach der Synthese anisotrop sein, und infolgedessen ist kompatib...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die NSF Graduate Research Fellowship-Programm für die Unterstützung danken EBA (DGE-1746891) und KRR (DGE-1232825). RAM Dank der nationalen Forschung Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) und die Belohnungen für deine Leistungen für College-Wissenschaftler-Stipendium für Unterstützung. Die Autoren danken den NIH (R01EB016721 und R01CA195503), die Forschung zu verhindern, dass Blindheit James und Carole kostenlose Catalyst Award, und der JHU Bloomberg-Kimmel Institut für Krebs-Immuntherapie für Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Polyvinylalkohol, MW 25000, 88 % hydrolysiertPolysciences, Inc.02975-500
GlycerolSigma-AldrichG9012
Digitales ThermometerFlukeN/AModellname: Fluke 52 II
TauchtemperaturfühlerFlukeN/AModellname: Fluke 80PK 22
Digitale Heizplatte & RührerBenchmark ScientificH3760-HS
MehrpunktrührerThermo Fisher Scientific50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-Lactid-co-glycolide)Sigma-Aldrich719900
DichlormethanSigma-AldrichD65100
HomogenisatorIKA 
SonicatorSonics & Materialien, Inc.N/AModellnummer: VC 505
Sonicator SchallschutzgehäuseSonics & Materialien, Inc.N/ATeilenummer: 630-0427
UltraschallsondeSonics & Materialien, Inc.N/ATeilenummer: 630-0220
Sonicator MikrospitzeSonics & Materialien, Inc.N/ATeilenummer: 630-0423
HochgeschwindigkeitszentrifugeBeckman CoulterN/AModellnummer: J-20XP (eingestellt), alternatives Modell: J-26XP
Hochgeschwindigkeitszentrifuge RotorBeckman Coulter369691Modellnummer: JA-17
Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen aus PolycarbonatThermo Fisher Scientific3118-005050 mL, Schraubverschluss
Rechteckiges Einweg-Petri SchaleVWR International25384-32275 x 50 x 10 mm
Quadratische Einweg-PetrischaleVWR International10799-140100 mm x 100 mm
LEAF  Gereinigtes Anti-Maus-CD3ε AntikörperBiolegend100314
InVivoMab Anti-Maus CD28, Klon 37.51Bio X CellBE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochloridSigma-AldrichE6383
N-Hydroxysulfosuccinimid-NatriumsalzSigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 Anti-Maus CD3 AntikörperBiolegend100212
APC Anti-Maus CD28 AntikörperBiolegend102109
Corning  96-Well-Mikroplatte aus festem PolystyrolSigma-AldrichCLS3915flachem Boden, schwarze
, 1,5 mLEppendorf22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamin)ThermoFisher Scientific11875093
fötales RinderserumSigma-AldrichF4135Hitzeinaktiviertes, sterilfiltriertes
CiprofloxacinSigma-Aldrich17850
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Rekombinantes humanes IL-2 (trägerfrei)Biolegend589102
Natriumpyruvat (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
MEM-Lösung nicht-essentielle Aminosäuren (100X)ThermoFisher Scientific11140050
MEM-Vitamin Lösung (100X)ThermoFisher Scientific11120052
CD8a+  T-Zell-Isolationskit, MausMiltenyi Biotech130-104-075
CellTrace CFSE ZellproliferationskitThermoFisher ScientificC34554
LS SäulenMiltenyi Biotech130-042-401
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
DurchflusszytometerAccuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate ReaderBioTek
autoMACS Running BufferMiltenyi BIotech130-091-221
ZellsiebThermoFisher Scientific22363548steril, 70 & Mikro; m Nylon
Mesh ACK Lysing BufferThermoFisher ScientificA1049201
C57BL/6J (Black 6) MausThe Jackson Laboratory000664 Männlich, mindestens 7 Wochen alt
U-Bottom GewebekulturplattenVWR353227Sterile, 96-Well-Gewebekulturplatten behandelte Polystyrolplatten
40 V DC NetzteilProbotixLPSK-4010
PTFE Beschichteter DrahtMouser602-5858-100-01Dies ist für eine 100-Fuß-Spule, aber ein gleichwertiger Draht funktioniert
SchrittmotortreiberProbotixMondoStep5.6
IDC Connector KitProbotixIDCM-10-12
MikrocontrollerProbotixPBX-RF
4A SicherungenRadio Shack2701026Gleichwertige Sicherungen funktionieren ebenfalls
DB25 Stecker auf SteckerKabel ProbotixDB25-6
USB-A auf USB-B KabelHeftklammern2094915Gleichwertiges Kabel funktioniert auch
8-polige Amphenol-Steckverbinder Stecker und BuchseMouser654-97-3100A-20-7P und 654-97-3106A20-7S
SchrittmotorProbotixHT23-420-8
GewindespindelRoton60722
Linkshänder-GewindespindelRoton60723
SchraubenMcMaster Carr92196A151
Neopren-GummiMcMaster Carr8698K51
Rechtshänder-Flansch-GewindemutterRoton91962
Linkshänder-Flansch-GewindemutterRoton91963
Linux-SteuercomputerProbotixLCNC-PCJeder Computer mit entsprechender Spezifikation und Linux-Betriebssystem funktioniert
Corning Flaschenaufsatz-VakuumfiltersystemSigma-AldrichCLS431097
Trypan Blue Lösung, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061
0003725001Polystyrol-Protein-LoBind-Röhrchen Rechte

Referenzen

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