Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.
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Methodenartikel
3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Blasenkrebs ist eine erhebliche gesundheitliche Problem. Es wird geschätzt, dass mehr als 16.000 Menschen in diesem Jahr in den Vereinigten Staaten von Blasenkrebs sterben. Während 75 % der Krebserkrankungen der Blase sind nicht-invasiv und unwahrscheinlich zu metastasieren, Fortschritte machen etwa 25 % ein invasives Wachstum Muster. Bis zur Hälfte der Patienten mit invasiven Krebsarten entwickeln tödliche Metastasen Rückfall. Daher ist es entscheidend, Vorhersagen, Behandlungsergebnisse zu vermeiden tödliche Metastasen, Verständnis des Mechanismus der invasiven Progression bei Blasenkrebs. In diesem Artikel präsentieren wir ein dreidimensionales Krebs Invasion Modell, das ermöglicht die Einbindung von Tumorzellen und Stromazellen Komponenten, in Vivo Bedingungen, die in der Blase Tumor Mikroumgebung zu imitieren. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, den invasiven Prozess mit Zeitraffer Bildgebung in Echtzeit beobachten, befragen die molekulare Bahnen beteiligt mit konfokale immunofluorescent Bildgebung und Bildschirm-Verbindungen mit dem Potenzial, Block-Invasion. Während dieses Protokoll auf Blasenkrebs konzentriert, ist es wahrscheinlich, dass ähnliche Methoden zur Untersuchung von Invasion und Motilität in sowie andere Tumorarten eingesetzt werden könnte.
Einleitung
Invasion ist ein wichtiger Schritt bei Tumorprogression, die Metastasen gefordert, und ist verbunden mit niedrigeren überleben und schlechter Prognose bei Patienten. In der menschlichen Blasenkrebs, am häufigsten Malignome der Harnwege verursacht etwa 165.000 Todesfälle pro Jahr weltweit, krebsstadium, Behandlung und Prognose direkt das Vorhandensein oder Fehlen von Invasion1beziehen sich auf. Rund 75 % der Fälle von Blasenkrebs werden nicht-Muskel invasive und sind mit lokalen Resektion verwaltet. Im Gegensatz dazu Muskel-invasive Blase Krebs (ca. 25 % aller Fälle) sind aggressive Tumoren mit hoher metastasierendem und werden mit aggressiven M....
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Protokoll
(1) wachsenden Krebs Sphäroide
-
Anbau von Zelllinien
- Kultur menschlichen Blase Krebszellen unter herkömmlichen Anhänger Zelle Kulturbedingungen und pflegen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Halten Zellen an < 90 % Konfluenz.
Hinweis: Kulturmedien verwendet ist Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, modifiziert und mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in dieses Protokoll geliefert. - Einen Tag vor Beginn des Experiments, trypsinize (mit 0,25 % Trypsin-EDTA) Zellen, Zellkonzentration zu quantifizieren und 1 x 106 Zellen....
- Kultur menschlichen Blase Krebszellen unter herkömmlichen Anhänger Zelle Kulturbedingungen und pflegen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Halten Zellen an < 90 % Konfluenz.
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Ergebnisse
Erfolgreiche Gestaltung von invasiven Blase Krebs Tumor Sphäroid erfordert die Bildung von geeigneter Größe Tumor Sphäroide aus Zell-Linien oder Primärtumoren. Abbildung 2 A zeigt entsprechend dimensionierte Sphäroide aus vier menschliche Blase Krebszelllinien (UM-UC9, UM UC13, UM UC14, 253J und UM UC18) entwickelt. Abbildung 2 B zeigt ein Tumor Sphäroid von einem BBN generiert Maus Blase Tumor i.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine 3-d-Tumor-Sphäroid-Modell, die Echtzeit-Beobachtung der Blase Krebs Invasion ermöglicht die für Krebs Progression und Metastasierung von entscheidender Bedeutung ist. Dieses System ist offen für die Einbeziehung der verschiedenen Stromazellen und zellulären Komponenten erlauben Ermittler besser zusammenfassend Gewebe Mikroumgebung wo Blase Krebs Invasion stattfindet. Blase Krebs Sphäroide können aus verschiedenen Quellen wie Zell-Linien (einschließlich genetisch veränderter Zelllinien für die Pr.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Autoren möchten das Labor von Dr. Howard Crawford (University of Michigan) für technische Unterstützung und Bereitstellung von Materialien und Ausrüstung für diese Studie und Alan Kelleher für den technischen Support zu danken.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN Jia (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Humane Blasenkrebs-Zelllinien UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM-Zellkulturmedium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| fötales Rinderserum | Thermo Fisher | Scientific 26140079 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum (100x) | Thermo Fisher | Scientific 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar 6-Well-Cluster mit ultral-niedrigem Aufsatz | Corning | 3471 | |
| Konventionelles inverses Mikroskop | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | Allgemeine Verwendung zur Zellkultur und Überprüfung von Sphäroiden |
| Kollagen Typ 1 aus Rattenschwanz, hohe Konzentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Thermo | Fisher Scientific | 155382 | |
| Konfokalmikroskop | Carl Zeiss | LSM800 | Ein konfokales Miskoskop mit Klimakammer, Multi-Location-Imaging und Z-Stack-Scanfunktion |
| Kryostat Mikromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Bildverarbeitungssoftware | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyd-Lösung | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T.-Mischung | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 Lösung | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) Antikörper | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 Antikörper | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin Antikörper | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Einbettmedium |
Referenzen
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C.
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Nachdrucke und Genehmigungen
