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Methodenartikel

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

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DOI:

10.3791/58345

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13. September 2018

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1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

Zusammenfassung

Blasenkrebs ist eine erhebliche gesundheitliche Problem. Es wird geschätzt, dass mehr als 16.000 Menschen in diesem Jahr in den Vereinigten Staaten von Blasenkrebs sterben. Während 75 % der Krebserkrankungen der Blase sind nicht-invasiv und unwahrscheinlich zu metastasieren, Fortschritte machen etwa 25 % ein invasives Wachstum Muster. Bis zur Hälfte der Patienten mit invasiven Krebsarten entwickeln tödliche Metastasen Rückfall. Daher ist es entscheidend, Vorhersagen, Behandlungsergebnisse zu vermeiden tödliche Metastasen, Verständnis des Mechanismus der invasiven Progression bei Blasenkrebs. In diesem Artikel präsentieren wir ein dreidimensionales Krebs Invasion Modell, das ermöglicht die Einbindung von Tumorzellen und Stromazellen Komponenten, in Vivo Bedingungen, die in der Blase Tumor Mikroumgebung zu imitieren. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, den invasiven Prozess mit Zeitraffer Bildgebung in Echtzeit beobachten, befragen die molekulare Bahnen beteiligt mit konfokale immunofluorescent Bildgebung und Bildschirm-Verbindungen mit dem Potenzial, Block-Invasion. Während dieses Protokoll auf Blasenkrebs konzentriert, ist es wahrscheinlich, dass ähnliche Methoden zur Untersuchung von Invasion und Motilität in sowie andere Tumorarten eingesetzt werden könnte.

Einleitung

Invasion ist ein wichtiger Schritt bei Tumorprogression, die Metastasen gefordert, und ist verbunden mit niedrigeren überleben und schlechter Prognose bei Patienten. In der menschlichen Blasenkrebs, am häufigsten Malignome der Harnwege verursacht etwa 165.000 Todesfälle pro Jahr weltweit, krebsstadium, Behandlung und Prognose direkt das Vorhandensein oder Fehlen von Invasion1beziehen sich auf. Rund 75 % der Fälle von Blasenkrebs werden nicht-Muskel invasive und sind mit lokalen Resektion verwaltet. Im Gegensatz dazu Muskel-invasive Blase Krebs (ca. 25 % aller Fälle) sind aggressive Tumoren mit hoher metastasierendem und werden mit aggressiven Multimodalität Therapie2,3behandelt. Daher ist es wichtig, um das Risiko der invasiven Progression besser charakterisieren und therapeutische Interventionen zu entwickeln, die invasive Fortschreiten verhindern können, Verständnis der molekularen Signalwege, die Invasion auslösen.

Invasive Tumorprogression tritt in einem komplexen Umfeld für dreidimensionale (3D) und beinhaltet Tumor Zelle Interaktion mit anderen Tumorzellen, Stroma, Basalmembran und andere Arten von Zellen wie Immunzellen, Fibroblasten, Muskelzellen und vaskuläre Endothelzellen. Durchlässige Unterstützung (z.B.Transwell) Assay-Systeme werden häufig eingesetzt, um Krebs Zelle Invasion4, aber diese Systeme quantitate sind begrenzt, weil sie nicht erlauben, mikroskopische Überwachung des Invasion in Echtzeit und die Entnahme von Proben für weitere Färbung und molekulare Analyse ist eine Herausforderung. Entwicklung eines 3-d-Blase Tumor Sphäroid Invasion zu studieren ist wünschenswert, weil dadurch die Aufnahme von definierten microenvironmental Komponenten mit dem Komfort einer in-vitro- Systeme.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein System, um die invasiven Prozesse der menschlichen Blase Krebszellen mit einem 3-d-Sphäroid Invasion Assay mit Kollagen-basierten Gel Matrizen und konfokalen Mikroskopie damit Ermittler Zelle Motilität überwachen zu verhören und Invasion in Echtzeit (Abb. 1A). Dieses System ist vielseitig und kann geändert werden, um verschiedene Stromatumoren Tumor/Einstellungen zu befragen. Es kann die meisten Blase Krebs-Zell-Linien oder primäre Blase Tumoren und zusätzliche Stromazellen Zellen enthalten, wie z. B. Krebs Fibroblasten und Immunzellen5,6,7verbunden. Dieses Protokoll beschreibt eine Matrix, bestehend aus Kollagen Typ 1, aber kann geändert werden, um andere Moleküle wie FIBRONEKTIN, Laminin oder andere Proteine Kollagen zu integrieren. Invasive Verfahren können für 72 h oder länger je nach der Fähigkeit, das Mikroskop und das verwendete verfolgt werden. Fixierung und Immunfluoreszenz-Färbung des Tumors in der 3-d-Matrix eingebettet, vor, während und nach dem Einmarsch ermöglicht das Verhör von Proteinen hochreguliert in invasive Zellen, wodurch wichtige Informationen, die normalerweise nicht vorhanden oder schwierig zu sammeln Verwendung von anderen 3-d-Kultur-Modellen. Dieses System kann auch genutzt werden, zu Bildschirm-Verbindungen, die Invasion zu blockieren und Signalwege, die solche Verbindungen betroffen abzugrenzen.

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Protokoll

(1) wachsenden Krebs Sphäroide

  1. Anbau von Zelllinien
    1. Kultur menschlichen Blase Krebszellen unter herkömmlichen Anhänger Zelle Kulturbedingungen und pflegen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Halten Zellen an < 90 % Konfluenz.
      Hinweis: Kulturmedien verwendet ist Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, modifiziert und mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in dieses Protokoll geliefert.
    2. Einen Tag vor Beginn des Experiments, trypsinize (mit 0,25 % Trypsin-EDTA) Zellen, Zellkonzentration zu quantifizieren und 1 x 106 Zellen in 3 mL Kulturmedien in jede Vertiefung eine 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte zu verteilen.
    3. Inkubieren Sie Zellen in niedrigen Anlage Bedingungen bei 37 ° C ≥16 h. Dies sollte ausreichend Zeit für die Zellen ermöglichen, Aggregat in Sphäroide für die meisten Blase Krebs-Zelllinien.
      Hinweis: Die Bildung der Sphäroide kann durch invertierte Hellfeld-Mikroskop beobachtet werden. Die optimale Größe und Anzahl der Sphäroide können auf einzelne Experimente abhängen, aber wir finden, dass Sphäroide mit Durchmessern von 50 µm bis 150 µm in der Regel für Zeitraffer-Bildgebung mit einem 20 X Objektiv geeignet sind.
    4. Weitere Zelltypen, wie z. B. Fibroblasten oder Immunzellen in die Sphäroide integrieren mischen die gewünschten Zellen mit Krebszellen im gewünschten Verhältnis (1:1, 01:10, etc..) in einer ultra-niedrigen Anlage Platte und Inkubation bei 37 ° C ≥16 h Bildung ermöglichen gemischte Zelle Typ Sphäroide.
  2. Anbau von Primärtumoren
    Hinweis: Tumor Sphäroide auch primäre Blase Tumor abgeleitet werden können Quellen, wie z. B. Tumoren von karzinogen induzierten Blase Tumor Modelle8entwickelt. Zum Beispiel Blase Tumoren erzeugt von Mäusen gefüttert mit N-Butyl - N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosaminen (BBN), können geerntet und in kleine Stücke (ca. 0,5 mm3) mit sterilen chirurgischen Instrumenten zerkleinert. Verdaut Primärproben menschliche Blase Krebs auch in diesem System studiert werden können.
    1. Sammeln und 0,5 mm3 Tumor Stücke in 5 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) waschen. Zentrifugation bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie waschen einmal.
    2. Sammeln Sie Tumor Stücke durch Zentrifugation bei 200 X g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen den überstand und 5 mL DMEM mit 10 % FBS. Übertragen Sie Tumor Sphäroid/Medien Mischung auf eine 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte. Inkubation bei 37 ° C ≥16 h vor dem Einbetten in Kollagen-Matrix (siehe Punkt 2.3).

2. Vorbereitung der 3-d-Kultur-Kammer

  1. Typ-1-Kollagen (abgeleitet von Rattenschwanz) in DMEM mit 10 % verdünnen FBS, eine Mischung von 2 mg/mL nach Herstellerangaben zu machen.
    1. Kurzum, Kollagen mit entsprechenden Menge 1 N NaOH-Lösung mischen und DMEM durch sanfte pipettieren basiert auf den Anweisungen des Herstellers, physiologischen pH-Wert zu erreichen.
    2. Nach dem Mischen Kollagen und DMEM schnell Beschichten der Brunnen von der Kammer-Folie (für die meisten Anwendungen, Kammer-Folien mit einem Deckglas Nummer 1.5 ist optimal) mit dem Kollagen-DMEM-Gemisch vor Erstarrung (200 µL/Well). Ermöglichen Sie die beschichteten Kammer Folie stationär bei Raumtemperatur 15 Minuten.
      Hinweis: Die Zusammensetzung des Kollagen-basierten Matrix kann geändert werden durch Zugabe von anderen extrazellulären Matrix Zutaten wie Fibronektin und Laminin, entsprechend im Sinne des Experiments.
  2. Sanft pipettieren 500 µL Medium mit Sphäroide (oder Tumor Stücke, wenn primäre tumorprobe verwendet wird) aus der 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte in eine leere 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Warten Sie 2 min der Sphäroide auf den Boden des Röhrchens abrechnen zu lassen.
  3. Entfernen Sie vorsichtig den überstand aus der Tube. Bereiten Sie eine andere Röhre von Typ-1-Kollagen (2 mg/mL) gemischt mit DMEM mit 10 % FBS und schnell die Sphäroide 500 µL dieser Mischung hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig die Sphäroide und Kollagen durch langsame pipettieren.
  4. Geben Sie 250 µL Sphäroide/Kollagen-Mischung in eine Kammer Kollagen-Pre-beschichtete Folie. Lassen Sie die Kollagen-Matrix mit Sphäroide vollständig zu festigen (ca. 30 min bei 37 ° C).
  5. Nachdem die Kollagenmatrix erstarrt ist, fügen Sie 1 mL DMEM mit 10 % FBS in jede Vertiefung (Abbildung 1B). Inkubieren Sie die Kammer Folie in einem 37 ° C Inkubator bis bereit für die Bildgebung mit 5 % CO2 geliefert.

(3) Zeitraffer live Cell Imaging

  1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop nach den Anweisungen des Herstellers und sicherzustellen Sie, dass der Klimakammer 37 ° C erreicht und wird mit 5 % CO2geliefert.
    Hinweis: Unser Mikroskop und Kammer erfordern in der Regel 1 h System Gleichgewicht zu erreichen.
  2. Sorgfältig übertragen der Kammer-Folie auf die Folie-Adapter am Mikroskop befestigt.
  3. Suchen Sie die Sphäroide mit einem low-Power-Ziel (z. B.5 X) und starten Sie Imaging mit dem Ziel, höhere Macht (in aktuellen Protokoll 20 X Objektiv wird verwendet für die meisten das live Cell Imaging für die bessere Bildqualität).
    Hinweis: Für primäre Blase tumorproben, können 5 X und 10 X Ziele benötigt werden um größere imaging-Bereich zu decken. Für unsere Zeitraffer-Aufnahmen der bildgebende Intervall wird als 30 min festgelegt und ein Z-Stapel wird verwendet, um das ganze Sphäroid Bild. In der Regel ist der Abstand zwischen Z-Scheiben bis 4 µm eingestellt für die 20 X Objektive und die Gesamtstrecke der Z-Achse ist rund 200 µm. Bilder mit DIC gewonnen werden können und mit Fluoreszenz wenn Gewebe bzw. Zellen fluoreszierende Protein Marker Hafen.
  4. Durchführen Sie Time-Lapse Bildgebung für 24-72 h.
    Hinweis: Die Dauer richtet sich nach dem Zelltyp und die Bedürfnisse des Experiments.

4. Vorbereitung der Probenblock mit Krebs Sphäroide für gefrorenes Gewebe schneiden

  1. Heben Sie vorsichtig den Block der Kollagen-Gel und Sphäroide aus der Kammer Folien mithilfe von kleinen Zange. Platzieren Sie den Kollagen Gel Block in einer Kunststoff-Histologie-Form.
  2. Spülen Sie das Kollagen-Gel mit 1 X PBS kurz, und dann fix it mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.
    Achtung: PFA potentiellen karzinogen und sollten mit Vorsicht behandelt werden.
  3. Waschen Sie dem Kollagen-Gel mit 1,5 mL 1 X PBS auf einen Shaker für 15 min. ersetzen die PBS und wiederholen Sie den vorherigen Waschschritt 3 X.
  4. Tragen Sie dünn auf (ca. 3 mm) der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung unten eine neue Form der Kunststoff Histologie abdecken. Legen Sie die feste und Betten Sie Kollagen Gel oben auf das Office-Anpassungstool zusammengesetzte gewaschen ein, dann sorgfältig das ganze Gel durch das Ausfüllen der Formwerkzeugs mit zusammengesetzten unter Vermeidung der Bildung von Luftblasen im Office-Anpassungstool OCT.
  5. Lassen Sie die Form bei 4 ° C für 1 h.
  6. Legen Sie die Form mit der Probe und OCT Verbindung auf einer 100 mm Petrischale schwimmend auf flüssigem Stickstoff. Lassen Sie die Probe vollständig Schockfrosten.
  7. Die gefrorenen probenblock bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.

5. Immunfluoreszenz Imaging für gefrorene geschnittenen Krebs Sphäroide

  1. Übertragen Sie die gefrorenen probenblock von-80 ° C Gefrierschrank auf-20 ° C-Kammer von einem Kryostat.
  2. Führen Sie konventionelle gefrorenes Schneiden durch Festlegen des Intervalls Abschnitt bis 7 µm. Lufteinschlüsse oder geschnittenen Proben an der Glas-Folie ohne Falten befestigen lassen.
    1. Speichern Sie die Folien bei-80 ° C vor der Durchführung weiterer Färbung.
      Hinweis: Verschiedene Intervalle können zur experimentellen Anforderungen anpassen.
  3. Die Folien für 1 h bei Raumtemperatur Lufttrocknen.
  4. Permeabilize die Proben mit PBS mit 0,5 % Triton x-100 für 15 Minuten.
  5. Wash Proben 3 X mit PBS für 10 min pro Waschgang.
  6. Umschließen Sie die Proben auf der Folie mit hydrophoben Barrieren mithilfe eine hydrophobe Barriere-Pen.
  7. Behandeln Sie die Proben mit blockierenden Lösung (1 X PBS mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA)), für 1 h bei Raumtemperatur.
  8. Jede Probe auf der Folie zuweisen Sie 40 µL der primäre Antikörper enthaltende Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA mit 1: 100 Verdünnung der Primärantikörper).
  9. Inkubieren Sie die Folien in der primären Antikörper bei 37 ° C für 1 h oder bei Raumtemperatur über Nacht (Inkubationszeit und Bedingungen variieren je nach Primärantikörper).
  10. Wash Proben 3 X mit PBS für 15 min (pro Waschgang).
  11. Jede Probe auf der Folie zuweisen Sie 40 µL sekundäre Antikörper enthaltende Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA mit 1: 300 Sekundärantikörper Verdünnung).
  12. Wash Proben 3 X mit PBS für 15 min (pro Waschgang).
  13. Färben Sie die Proben mit Hoechst 33342 Lösung (1 µg/mL, verdünnt mit PBS-Puffer) bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann waschen Sie Proben mit PBS 5 min.
  14. Montieren Sie die Proben mit Eindeckmittel und bedecke sie mit entsprechend großen Deckel rutscht. Verlassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 h zu, und führen Sie dann konfokalen Mikroskopie.

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Ergebnisse

Erfolgreiche Gestaltung von invasiven Blase Krebs Tumor Sphäroid erfordert die Bildung von geeigneter Größe Tumor Sphäroide aus Zell-Linien oder Primärtumoren. Abbildung 2 A zeigt entsprechend dimensionierte Sphäroide aus vier menschliche Blase Krebszelllinien (UM-UC9, UM UC13, UM UC14, 253J und UM UC18) entwickelt. Abbildung 2 B zeigt ein Tumor Sphäroid von einem BBN generiert Maus Blase Tumor i...

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Diskussion

Hier beschreiben wir eine 3-d-Tumor-Sphäroid-Modell, die Echtzeit-Beobachtung der Blase Krebs Invasion ermöglicht die für Krebs Progression und Metastasierung von entscheidender Bedeutung ist. Dieses System ist offen für die Einbeziehung der verschiedenen Stromazellen und zellulären Komponenten erlauben Ermittler besser zusammenfassend Gewebe Mikroumgebung wo Blase Krebs Invasion stattfindet. Blase Krebs Sphäroide können aus verschiedenen Quellen wie Zell-Linien (einschließlich genetisch veränderter Zelllinien für die Pr...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Die Autoren möchten das Labor von Dr. Howard Crawford (University of Michigan) für technische Unterstützung und Bereitstellung von Materialien und Ausrüstung für diese Studie und Alan Kelleher für den technischen Support zu danken.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN Jia (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Humane Blasenkrebs-Zelllinien UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM-ZellkulturmediumThermo Fisher Scientific11995065
fötales Rinderserum Thermo FisherScientific 26140079
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)Thermo FisherScientific 15240062
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotThermo Fisher Scientific25200056
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA3803
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 Thermo Fisher Scientific10010023
Costar 6-Well-Cluster mit ultral-niedrigem Aufsatz Corning3471
Konventionelles inverses MikroskopCarl Zeiss491206-0001-000Allgemeine Verwendung zur Zellkultur und Überprüfung von Sphäroiden
Kollagen Typ 1 aus Rattenschwanz, hohe KonzentrationCorning354249
Nunc Lab-Tek II ThermoFisher Scientific155382
KonfokalmikroskopCarl ZeissLSM800Ein konfokales Miskoskop mit Klimakammer, Multi-Location-Imaging und Z-Stack-Scanfunktion 
Kryostat MikromtomeLeica BiosystemsCM3050 S
Zen 2 Bildverarbeitungssoftware Carl Zeiss
Paraformaldehyd-LösungElektronenmikroskopie Sciences15710
ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP PenVector Laboratories H4000
O.C.T.-Mischung Thermo Fisher Scientific23730571
Hoechst 33342 Lösung Thermo Fisher Scientific62249
Anti-ATDC (Trim29) AntikörperSigma-AldrichHPA020053
Anti-Cytokeratin 14 AntikörperAbcamab7800
Anti-Vimentin AntikörperAbcamab24525
ProLong DiamondEinbettmedium
mit Deckglas

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