Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung der axonalen targeting mit ein fluoreszierendes Protein in Erwachsenen Beinen von Drosophila durch Fixierung, Montage, imaging und Post-Bildgebung Schritte.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Großteil der Arbeit auf der neuronalen Spezifikation wurde in genetisch und physiologisch gefügig Modellen wie z.B. Cdurchgeführt. Elegans, Drosophila Larven und Fische, die alle in Mischstrom Bewegungen (wie kriechen oder Schwimmen) als ihre primäre Form der Fortbewegung zu engagieren. Jedoch eine anspruchsvollere Verständnis der einzelnen Motoneuron (MN) Spezifikation – zumindest in Bezug auf die Information der Krankheit Therapien – erfordert eine ebenso steuerbar System, das besser die komplexen Anhängsel-basierte Fortbewegung Systeme der Modelle Wirbeltiere. Erwachsenen Drosophila Bewegungsapparates verantwortlich für zu Fuß erfüllt alle diese Kriterien mit Leichtigkeit, da in diesem Modell es möglich ist, die Spezifikation einer kleinen Anzahl von leicht unterschieden Bein MNs (ca. 50 MNs pro Bein) zu studieren beide mit einem riesigen Reihe von genetischen Werkzeuge und in der physiologischen Rahmen ein Anhängsel-basierte Fortbewegung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um das Bein Muskel Innervation in einem Erwachsenen fliegen zu visualisieren.
Einleitung
Wie das vertebrate Glied gliedert sich die Drosophila Erwachsenen Bein in Segmente. Jede Fliege Bein enthält 14 Muskeln, von die jeder mehrere Muskelfasern1,2umfasst. Die Zellkörper der Erwachsenen Bein MNs befinden sich in der T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) und T3 (metathoracic) Ganglien auf jeder Seite der ventralen Nervenstrang (VNC), strukturell analog zu den Wirbeltieren Rückenmark (Abbildung 1). In jedem Ganglien, welches Ziel in vier Segmenten des ipsilateralen Beins (Coxa, Trochanter, Femur und Tibia) (Abbildung 1)
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Bein Dissektion und Fixierung
- Nehmen Sie ein Glas Multi-well-Platte und Füllung entsprechende Anzahl von Brunnen mit 70 % Ethanol. Hinzufügen von 15 – 20 CO2-narkotisierten fliegen (der entweder Sex und jeden Alters) für jeden gut und mit einem Pinsel, sanft Tupfen die fliegen in die Ethanol-Lösung bis fliegen vollständig untergetaucht sind.
Hinweis: Dieser Schritt ist der Hydrophobie der Nagelhaut entfernen. Nicht für mehr als 1 min waschen Sie, weil das Auto-Fluoreszenz der Kutikula erhöht. - Spülen Sie die fliegen 3 Mal mit 0,3 % nichtionische Tenside Reinigungslösung in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Halten Sie die....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Wie in Abbildung 4gezeigt, ermöglicht dieses Verfahren hervorragende Darstellung der GFP-Label Axone in Erwachsenen Drosophila -Beine, zusammen mit ihre terminal Dorne. Vor allem erhält man ein klares Signal der GFP ohne jegliche Kontamination aus der Fluoreszenz emittierten Bein Nagelhaut. Das Signal von der Nagelhaut kann dann mit der GFP-Signal zu identifizieren, die Positionierung der Axone in den Beinen (Video 1,Abbildung 4E.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Cuticula von Erwachsenen Drosophila und anderen Arthropoden, die vielen dunklen Pigmente enthält, ist ein großes Hindernis für die Anzeige von Strukturen im Inneren ihres Körpers. Darüber hinaus ist es stark Auto fluoreszierend, durch Fixierung verschlimmert. Diese beiden Funktionen sind sehr problematisch für Beobachtungen von Fluoreszenzfarbstoffen oder Molekülen im Körper von Tieren mit ein Exoskelett.
Das Verfahren, die wir beschrieben haben und dass wir routinemäßig im Labor, ergibt s.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Robert Renard für die Zubereitung von fliegen Essen Medium. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen NIH Grant NS070644, R.S.M und Finanzierung aus dem ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) und ATIP-Avenir Programm, j.e.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ethanol absolut | Fisher | E/6550DF/17 | Absolutes nichtionisches Tensidreinigungsmittel für analytische Reagenzien |
| Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, für die Molekularbiologie | |
| Feine Pinzette | Sigma-Aldrich | F6521 | Juwelierzange, Dumont Nr. 5 |
| Multiwell-Glasplatte | Elektronenmikroskopie Sciences | 71563-01 | 9 Kavität Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyd (w/v), Methanolfrei |
| Glycerin | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerin (Molekularbiologie) |
| Spacer | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, vier Vertiefungen, ca. 12 μ L Arbeitsvolumen pro Vertiefung, 7 mm Durchmesser, 0,18 mm tief |
| Quadratisch 22 mm x 22 mm Deckgläser | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | Nr. 1,5-0,16 bis 0,19 mm dick |
| Eindeckmedium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Eindeckmedium |
| Konfokales Mikroskop | Carl Zeiss | LSM780; Objektiv verwendet LD LCI Plan-Apochromat 25X/0,8 Imm Korr DIC M27 (Öl/ Silizium/Glycerin/Wasser Immersion) (420852-9871-000) | |
| Bildgebungssoftware | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Bildsoftware | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
Referenzen
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- B....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
