Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein der Neutrophilen behoben/permeabilized Histologie Abschnitte erkennen und bewerten den Aktivierungsstatus der live gereinigten Neutrophilen. Vor allem bindet MUB40 Peptid Lactoferrin in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden. Exposition der Granulat-Inhalte durch Permeabilisierung oder Neutrophilen Aktivierung ermöglicht die Kennzeichnung von Neutrophilen.
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Methodenartikel
Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier bieten wir ein Protokoll unter Verwendung von MUB40, ein synthetisiertes Peptid mit der Fähigkeit, glykosylierten Lactoferrin gespeichert in hohen Konzentrationen in bestimmten und tertiäre Körnchen der Neutrophilen zu binden. Dieses Protokolldetails wie MUB40 direkt an ein Fluorophor konjugiert einsetzbar, Neutrophile in feste/permeabilized Geweben sowie zu beflecken, wie Hiermit können live Cell Imaging für die Neutrophilen Aktivierung und de-Granulierung assay. Neutrophilenzahl Nachweismethoden beschränken sich auf Spezies-spezifische monoklonale Antikörper, die nicht immer für bestimmte Anwendungen geeignet sind. MUB40 die Zellmembran nicht durchdringen und ist somit von Lactoferrin gespeichert in nicht-aktiviert/nicht-permeabilized Neutrophilen ausgeschlossen. MUB40 hat den zusätzlichen Vorteil erkennen Lactoferrin aus ein breites Wirtsspektrum, macht es besonders nützlich für den Vergleich der Ergebnisse in Studien mit mehreren Forschungsmodelle, Verringerung der Zahl der doppelte Reagenzien und Vereinfachung der Protokolle durch ein-Schritt-Färbung.
Einleitung
Neutrophile sind eines der primären Waffen des angeborenen Immunsystems und werden routinemäßig zu den Stätten der Entzündung um den Körper angeworben. Die Studie der Neutrophilen wurde weitgehend beeinträchtigt durch ihre kurze Lebensdauer in Vitro (weniger als 8 h) und begrenzte Erkennungs-Tools unter basalen Bedingungen oder nach der Aktivierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine erprobte Protokoll für die Breite und spezifische Erkennung von Säugetier-Neutrophils in feste/permeabilized Proben. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll zum Beizen live Neutrophilen mit MUB40. Mit dem live Neutrophilenzahl Färbung Protokoll, können den Zeitpunkt ....
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Protokoll
Alle hier beschriebene Methoden wurden überprüft und genehmigt von den französischen Organisationen CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) und CNIL (Kommission Nationale Informatique et Liberté).
1. Neutrophile im Histopathologie Gewebe mit Gewebekulturen Färbung gekennzeichnet MUB40
- Um das Gewebe für die Histopathologie zu erhalten, befestigen Sie Gewebeentnahme/Abschnitte in einem geeigneten Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bis zu 4 h je nach der Dicke der Probe. Legen Sie die Proben im Kühlschrank 4 ° C, während der Fixierung.
Hinweis: Alternative Fixierung Me....
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Ergebnisse
Ergebnisse der MUB40-gefärbten Gewebe von Histopathology Dias zeigen in der Regel einzelne Zellen in das Gewebe verteilt. MUB40 Flecken Lactoferrin, die ist in Neutrophilen Granulat und Abteilen. So gesehen, in der Regel punctata beflecken oder mehrere große getrennte Bereiche des Signals aus einzelnen Neutrophilen (Abbildung 1) kommen. Es ist hilfreich, fügen eine zweite Zelle Markierung wie DAPI zu helfen, das MUB40 Signal m.......
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Diskussion
Hier sind zwei Tests beschrieben, in denen das MUB40 Peptid verwendet wird, um Neutrophilenzahl Entzündung und Aktivierung zu studieren. Wir zeigen, wie MUB40 offenbaren kann, Neutrophile in Histopathologie Abschnitte oder zeigen ihren Aktivierungsstatus mit live gereinigten Neutrophilen. Die entscheidenden Schritte für die Verwendung von MUB40 als Färbung Reagens sind dasselbe wie mit keiner anderen Methode der Fluoreszenz-Detektion. Vorsicht ist geboten, damit Kompatibilität von fluores.......
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Offenlegungen
B.S.M. wird als Erfinder auf MUB40 Patente aufgeführt:
MUB40: Europäische Patent EP11290403.2, 09.09.2011.
RI-MUB40: Europäische Patent EP Nr. 17306746.3, 12.11.17.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) und ANR JCJC gewährt (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluoreszierendes MUB40Peptid (mit anderen konjugierten Fluorophoren erhältlich) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluoreszierendes MUB40-Peptid. Synthetisiert mit D-Aminosäuren und resistent gegen Proteasen (erhältlich mit anderen konjugierten Fluorophoren) |
| Parformaldehyd | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixiermittel für die Histologie |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S7903 | Lösung zur Entfernung von überschüssigem PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Wird zum Einfrieren von Gewebe vor dem Kryostatenschnitt |
| 2-Methylbutan | Sigma-Aldrich | M32631 | Wird zum Einfrieren von Gewebe vor dem Kryostatenschnitt |
| verwendet Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Wird für ein Trockeneisbad zum Einfrieren von Gewebe |
| verwendet Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Wird zum Schneiden von Geweben |
| verwendet Glasmikroskopie-Objektträger | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Deckgläser | Thor Labs | CG15CH | Hi precision Deckglas |
| Dako Kugelschreiber | Sigma-Aldrich | Z377821 | Zur Vermeidung von Flüssigkeitsverlust bei der Gewebefärbung |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Zur Permeabilisierung von Zellen für die ZF-Färbung |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | zur DNA-Färbung |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Bindet Aktin |
| Prolong Gold Antifading Eindeckmittel | Fisher Scientific | P36930 | Verlängert das ZF-Signal und die Beständigkeit gegen Photobleiche |
| Fluoreszierendes Mikroskop | Verschiedenes | Wird | zur Abbildung von IF-Objektträgern |
| verwendet Anoxischer Schrank | Verschiedenes | Wird zur Reinigung von lebenden inaktivierten Neutrophilen | |
| Natriumchlorid NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Waschpufferkomponente |
| MACS BSA Puffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Waschpufferkomponente |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient für die Reinigung von Neutrophilen |
| CD235a Glykophorin magnetische Mikrokügelchen | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Zur Entfernung von kontaminierenden Erythrozyten |
| LS-Säulen | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Zur Entfernung von Erythrozyten aus Neutrophilen |
| RPMI-1640 ohne Phenolrot | Sigma-Aldrich | R8755 | Wird für Neutrophilen-Assays |
Referenzen
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B....
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Nachdrucke und Genehmigungen
