Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Photosynthetische Electron Transfer Kette (usw.) wandelt Sonnenenergie in chemische Energie in Form von NADPH und ATP. Vier große Proteinkomplexe eingebettet in die Thylakoidmembran Membran Ernte Solarenergie Elektronen aus dem Wasser auf NADP⁺ über zwei photosysteme zu fahren, und die erstellten Proton Steigung für Produktion von ATP. Photosystem PSII, PSI, Cytochrom b₆f (Cyt b₆d) und ATPase sind alle Multi-komplexe mit eindeutigen Ausrichtung und Dynamik in der Thylakoidmembran Membran. Wertvolle Informationen über die Zusammensetzung und die Interaktionen der Proteinkomplexe in der Thylakoidmembran Membran erhalten Sie durch Gefäss-komplexe aus der Membran Integrität von Feinwaschmittel gefolgt von native Gel elektrophoretische Trennung von der -komplexe. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine analytische Methode für die Trennung der Proteinkomplexe in ihrer nativen und funktionale Form verwendet. Die Methode eignet sich für komplexe Proteinreinigung für genauere strukturelle Analyse, sondern es bietet auch ein Werkzeug, um die dynamischen Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu sezieren. Die Methode wurde entwickelt für die Analyse der mitochondrialen Atmung Proteinkomplexe, aber seitdem optimiert und verbessert für die Zerlegung der Thylakoidmembran Proteinkomplexe. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll auf dem neuesten Stand für die Analyse der labile photosynthetischen Proteinkomplexe und ihrer Wechselwirkungen in Arabidopsis Thaliana.

Einleitung

Großen speziellen Protein-komplexe Photosystem PSI und PSII, Cyt b₆f und ATPase koordinieren die Herstellung von NADPH und ATP in photosynthetischen Licht Reaktionen. In höheren Pflanzen Chloroplasten die komplexe in der Thylakoidmembran Membran befinden sich ein strukturell heterogenen Membran-Struktur, bestehend aus anliegenden Grana und nicht anliegenden Stroma Thylakoids. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine extensiv genutzte Methode bei der Analyse von großen speziellen Proteinkomplexe in ihrer nativen und biologisch aktive Form. Die Methode wurde für die Zerlegung des Mitochondrien-Membran-Protein-komplexe^....

Protokoll

1. Vorbereitung BN Gel^1,2,3

1. Richten Sie die Gel-Caster mit 8 x 10 cm-Platten (rechteckige Glas- und gekerbten Aluminiumoxid Platte) nach Herstellerangaben mit 0,75 mm spacer.
2. Legen Sie einen Gradienten Mischer auf einen rühren Teller und verbinden Sie es mit der peristaltischen Pumpe durch ein Rohr. Das andere Ende des Schlauches eine Spritzennadel beimessen und die Nadel zwischen Glas und Aluminium Platte platzieren. Magnetrührer Ort zu "schwer" (H)-Kammer.
3. Bereiten Sie die 3,5 % (V/V) und 12,5 % (V/V) Acrylamid....

Ergebnisse

Ein repräsentatives 2D-BN/SDS-PAGE-System in Abbildung 1 zeigt die Trennung von Digitonin und β-DM-solubilisiert Thylakoidmembran Proteinkomplexe und ihre detaillierte Proteinzusammensetzung Untereinheit. Das Protein komplexe Muster der Digitonin solubilisiert Thylakoids (horizontale Gel oben auf der Spitze Figur 1A) enthält die PSII LHCII PSI Megacomplex, zwei große PSII LHCII Supercomplexes (sc), PSI-LHCII Supercomplex, PSI Mon.......

Diskussion

Die photosynthetische Energie Umwandlung Maschinen besteht aus großen speziellen Proteinkomplexe, die in die Thylakoidmembran Membran eingebettet sind. Dieses Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode zur Analyse der Pflanze Thylakoidmembran Proteinkomplexe von Arabidopsis Thaliana mit BN-Seite zusammen mit 2D-SDS-PAGE. Das Protokoll eignet sich auch für die Analyse der Thylakoidmembran Proteinkomplexe aus Tabak und Spinat Thylakoids, aber kleine Anpassungen erfordern.

Für die So.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Aminocapronsäure (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamid (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Achtung: Neurotoxisch!
n-dodecyl-β-D-Maltosid	Sigma-Aldrich	D4641
Tricin	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Harnstoff	VWR	28877.292
Glycerin	J.T. Baker	7044
Natriumfluorid (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA Dinatriumsalz	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Achtung:Giftig!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammoniumpersulfat)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylendiamin)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylen)-Bis-Acrylamid	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Vorgefärbter Proteinmarker, breiter Bereich (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, konische Zentrifugenröhrchen 15 ml	Corning	352093
Dualer Gelcaster mit 10 x 8 cm Platten	Hoefer	SE215
Gradientenmacher SG5	Hoefer
0,75 mm T-Abstandshalter	Hoefer	SE2119T-2-.75
Probengelkamm, 0,75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertikales Elektrophoresesystem	Hoefer	SE250
IPC-Pumpe	Ismatec
Netzteil, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Zentrifuge	Eppendorf	5424R Rocker-Shaker
	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813