Methodenartikel

Induktion der endothelialen Differenzierung in kardialen Vorläuferzellen unter niedrigen Serum-Bedingungen

DOI:

10.3791/58370

⸱

7. Januar 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik der endothelialen Differenzierung für kardiale Vorläuferzellen. Es konzentriert sich besonders auf wie Serum-Konzentration und Dichte Zelle Aussaat der endothelialen Differenzierung Potenzial auswirken.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardialen Vorläuferzellen (CPCs) möglicherweise therapeutisches Potenzial zur kardialen Regeneration nach Verletzungen. Mitten in Erwachsenen Säugetier intrinsische CPCs sind extrem selten, aber erweiterte CPCs nützlich sein könnte für Zelltherapie. Voraussetzung für die Nutzung ist ihre Fähigkeit, in einer kontrollierten Weise in die verschiedenen kardialen Linien mit definierten und effiziente Protokolle zu differenzieren. Darüber hinaus auf in-vitro- Erweiterung CPCs von Patienten isoliert oder präklinischen Krankheitsmodelle können fruchtbare Recherche-Tools für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen anbieten.

Aktuelle Studien mit, dass verschiedene Marker CPCs bestimmt werden kann. Jedoch sind nicht alle von ihnen beim Menschen geäußert, beschränkt die translationale Auswirkungen einiger präklinischen Studien. Differenzierung-Protokolle, die unabhängig von der Isolation Technik und Marker Ausdruck gelten ermöglicht den standardisierten Ausbau und Grundieren der CPC-Gebote für Zelle Therapie Zweck. Hier beschreiben wir, dass die Grundierung des CPCs unter einer niedrigen fetalen bovine (FBS) Serumkonzentration und niedrigen Zelle Dichte Bedingungen erleichtert die endotheliale Differenzierung des CPCs. mit zwei verschiedenen Subpopulationen von Maus und Ratte CPCs, wir zeigen, dass Laminin a mehr geeignetes Substrat als Fibronektin zu diesem Zweck unter das folgende Protokoll: nach Kultivierung für 2-3 Tage in Medium einschließlich Ergänzungen, dass Multipotenz behaupten mit 3,5 % FBS, CPCs sind ausgesät und auf Laminin an < 60 % Zusammenfluss und kultiviert in Ergänzung-freies Medium mit niedrigen Konzentrationen des FBS (0,1 %) für 20-24 Stunden vor der Differenzierung in endothelialen Differenzierung Medium. Da CPCs eine heterogene Bevölkerung sind, Serumkonzentrationen und Inkubationszeiten möglicherweise je nach den Eigenschaften der jeweiligen CPC Subpopulation angepasst werden. Vor diesem Hintergrund kann auch auf andere Arten von CPCs sowie die Technik und bietet eine nützliche Methode, um das Potenzial und die Mechanismen der Differenzierung und wie sie von der Krankheit betroffen sind, bei CPCs isoliert vom jeweiligen Krankheitsmodelle zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuere Studien unterstützen die Existenz von resident kardialen Vorläuferzellen (CPC) in den Erwachsenen Säugetier-Herz1,2,3könnte, und CPCs eine nützliche Quelle für die Zelltherapie nach kardialen Schädigung4, 5. Darüber hinaus erweiterte CPCs können eine fruchtbare Modell vorsehen, dass Drogen-Screening und die Untersuchung der Krankheitsmechanismen bei Patienten mit seltenen Kardiomyopathien, oder vom jeweiligen Krankheit isoliert Modelle6,7.

CPCs isoliert aus dem Erwachsenen Herzen besitzen Stamm/Stammvater Zelle Eigenschaften1,2,3,8 , sind multipotent, klonogenen, und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Allerdings gibt es viele verschiedene (Teil-) Populationen des CPCs präsentiert verschiedene Oberfläche Marker Profile, einschließlich, zum Beispiel c-Kit, Sca-1 und andere, oder von unterschiedlichen Isolierungstechniken (Tabelle 1) abgerufen. Verschiedene Kultur und Differenzierung Protokolle wurden etablierte1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Diese Protokolle unterscheiden sich vor allem in Bezug auf den Wachstumsfaktor und Serum Inhalte, die nach dem Zweck der Kultivierung angepasst sind und zu unterschiedlichen Ergebnisse und Ergebnisse, einschließlich Differenzierung Effizienz führen kann.

Marker-basierte Isolationstechniken:

CPC-Gebote können isoliert werden, basierend auf einer bestimmten Oberfläche Marker Ausdruck1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Frühere Studien deuten darauf hin, dass c-Kit und Sca-1 der beste Marker resident CPCs1,11,14,19,20isoliert werden kann. Da keiner dieser Marker für CPC-Gebote wirklich spezifisch ist, sind Kombinationen von verschiedenen Markern in der Regel angewendet. Z. B. während CPCs niedrige Konzentrationen von c-Kit21auszudrücken, ist c-Kit auch andere Zelltypen, einschließlich Mastzellen22, Endothelzellen23und hämatopoetischen Stammzellen/Progenitor Zellen24zum Ausdruck. Ein weiteres Problem ist die Tatsache, dass nicht alle Markierungen auf allen Arten ausgedrückt werden. Dies ist der Fall für Sca-1, die Maus aber nicht in menschlichen25zum Ausdruck bringt. Daher kann die Protokolle verwendet, die unabhängig von der Isolierung Marker sind vorteilhaft im Hinblick auf klinische Studien und Untersuchungen mit humanen Proben sein.

Marker-unabhängige Isolierungstechniken:

Es gibt mehrere Haupttechniken der CPC-Isolation, die in erster Linie unabhängig von Surface Marker Ausdruck, aber das kann durch die aufeinander folgenden Auswahl der spezifischen Marker-positiven Unterfraktionen verfeinert werden, je nach Bedarf (siehe auch Tabelle 1). (1) die Seite Bevölkerung (SP) Technik wurde ursprünglich in einer primitiven Bevölkerung von hämatopoetischen Stammzellen, die auf der Fähigkeit basiert, Ausfluss der DNA-Farbstoff Hoechst 3334226 von ATP-bindende Kassette (ABC) Transporter27gekennzeichnet. Herzmuskelzellen SP wurden durch verschiedene Gruppen isoliert und berichtet, dass eine Vielzahl von Markern mit einigen kleinen Unterschieden zwischen Berichte2,8,13,14zum Ausdruck bringen. (2) koloniebildenden Einheit Fibroblastenzellen (KBE-Fs) ursprünglich definiert wurden basierend auf einer mesenchymaler Stromazellen Zelle (MSC)-wie Phänotyp. Isolierte MSCs sind auf Speisen induzieren Kolonie Bildung kultiviert. Koloniebildenden MSC-wie KBE-Fs kann von Erwachsenen Herzen getrennt werden und sind in der Lage, in kardialen Linien15zu unterscheiden. (3) Cardiosphere-abgeleitete Zellen (CDC) sind einzelne Zellen aus Gruppen von Zellen aus Gewebebiopsien gewachsen oder explants28,29,30,31. Es wurde kürzlich gezeigt, die meist die CD105+/CD90–/c-kit– Zelle Bruchteil Exponate, Cardiomyogenic und regenerative potenzielle32.

Hier bieten mit SP-CPCs von Mäusen isoliert, wir ein Protokoll zur effizienten Einarbeitung von endothelialen Linie basierend auf einer früheren Studie CPCs Ratte und Maus SP-CPCs33. Das Protokoll enthält spezifische Anpassungen an die Kultur und Ausbau Technik in Bezug auf die Zelldichte, der Serum-Inhalt des Mediums und dem Substrat. Es kann nicht nur auf Maus SP-CPCs angewendet werden, aber zu verschiedenen Arten von CPC-Gebote für den Zweck, einen Schicksal Wechsel von einer Verstärkung zu einer endothelialen begangen CPC zu induzieren, sei es im Hinblick auf die Transplantation dieser Zellen sowie deren Nutzung für mechanistische in-vitro- Studien.

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Protokoll

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Die Verwendung von Mäusen zu Zelle Isolierung Zweck wurde gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit dem Schweizer Tier-Schutz-Gesetz und wurde von den Schweizer Kantonen genehmigt.

Hinweis: Die Isolation der Sca-1+/CD31– SP-CPCs aus dem Herzen der Maus erfolgte im Wesentlichen als zuvor beschriebenen34 mit einigen Änderungen. Die Materialien und Reagenzien verwendet finden Sie unter Tabelle der Materialien. Für alle Experimente wurden kardiale SP-CPCs von Mäusen isoliert verstärkt passagiert und verwendet in einer Zelle Zeile-Manier. 7-20 Passagen wurden für diese Studie verwendet.

(1) Gewebe-Vorbereitung

Hinweis: Alle Experimente mit Mäusen müssen gemäß den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden. Dieses Protokoll verwendet vier Mäuse. Kultur-Platten, die 100 mm Durchmesser sind, sind als P100 und Kultur-Platten, die 60 mm Durchmesser sind, als P60 für die folgenden Teile des Protokolls beschrieben sind.

  1. Jede Maus mit 200 mg/kg von Pentobarbital intraperitoneal zu injizieren (i.p.) und warten Sie, bis es vollständig betäubt ist, durch die Überprüfung ihrer Antwort kneifen bis Fuß.
  2. Wischen Sie die Brust mit 70 % Ethanol. Schneiden Sie die Haut und Brustwand mit einer Schere, der Brusthöhle verfügbar zu machen.
  3. Heben Sie das Herz mit der Pinzette und an der Basis mit einer Schere abschneiden. Setzen Sie das Herz in einem P100 mit 25 mL (5 mL für P60) kalt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (drei bis fünf Herzen pro P100) oder ein bis zwei Herzen pro P60.
  4. Pumpen Sie, das Herz mit der Pinzette, das Blut aus den Hohlräumen (Abbildung 1A) auszuwerfen.
  5. Setzen Sie das Herz in einem P100 mit 25 mL (5 mL für P60) von kaltem PBS zum Waschen. Entfernen Sie die Vorhöfe mit einer kleinen Schere. Schneiden Sie das Herz in zwei längliche Stücke und waschen Sie sie wieder in eiskaltem PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60).
  6. Übertragen Sie die Stücke auf eine neue P100 mit 25 mL (5 mL für P60) kaltem PBS. Schneiden Sie die Stücke in kleinere Stücke, die mit einer kleinen Schere (Abbildung 1 b). Geben Sie einen Tropfen 1 mg/mL Kollagenase B in Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) verdünnt und Hackfleisch Kleinteile gründlich mit einer sterilen Rasierklinge (Abbildung 1).

(2) Verdauung

  1. Fügen Sie der Kollagenase B Lösung 1 mg/mL 10 mL (2,5 mL für P60) in die Schale aus Schritt 1.6.
  2. Setzen Sie die Kollagenase B-Lösung mit Hackfleisch / Herz-Stück in eine schräge (ca. 30°) P100 (oder P60) in einem Inkubator 37 ° C (Abbildung 1).
  3. Inkubieren Sie die Hackfleisch / Herz-Stücke für maximal 30 min; homogenisieren Sie, indem man sie immer wieder durch eine Pasteurpipette alle 10 Minuten während der Inkubation (Abbildung 1E).
    Hinweis: Es ist wichtig, 30 min Inkubation für Schritt 1.3 insgesamt nicht überschreiten.

(3) filtration

  1. Fügen Sie 10 mL (5 mL für P60) des kalten HBSS ergänzt mit 2 % FBS, Hackfleisch und homogenisierte Herz Stücke.
    Hinweis: HBSS mit 2 % FBS Quenchen Kollagenase B Aktivität ergänzt.
  2. Filtern Sie die Herz-Stücke durch 100 µm-Filter, unverdaute Gewebe und Zentrifuge bei 470 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) (Abb. 1F, Gelbfilter) zu entfernen.
  3. Verwerfen Sie den Überstand Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 mL (3 mL für P60) der roten Blutzelle Lysis Puffer und inkubieren Sie die Tablette für 5 min mit gelegentlichen schütteln auf Eis.
  4. Fügen Sie 10 mL (5 mL für P60) von PBS (um die Lyse Reaktion zu stoppen) und filtern die Probe durch einen 40 µm-Filter, größere Zellen, einschließlich residuale Kardiomyozyten (Abb. 1F, blaue Filter) auszuschließen.
  5. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 470 X g für 5 min bei RT (ohne Bremse). Den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 1 mL DMEM mit 10 % FBS.
  6. Zählen der Zellen in einem aliquoten mit einem Hemocytometer. Aufschwemmen der Zellen mit DMEM mit 10 % FBS, mit dem Ziel einer endgültigen Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL.
    Hinweis: Etwa 5 x 106 Cardiomyocyte und Erythrozyten erschöpft Zellen per Mausklick abgeschätzt werden.
  7. Verteilen Sie die Zellen in zwei Röhren (Abbildung 2): Add-in Rohr A, 1, 5 mL für Hoechst 33342 Färbung mit Verapamil; in Rohr B18,5 mL für Hoechst 33342 Färbung und zu färben und Durchflusszytometrie SP Herzmuskelzellen (Stufen 4.1 und 4.2) sortieren.

(4) Sortierung der kardialen SP-Zellen durch Durchflusszytometrie

Hinweis: Verapamil hemmt Hoechst Efflux von multidrug-Resistenz (MDR) ABC-Transporter-Aktivität blockiert. Hoechst 33342 ist ein DNA-Bindung-Farbstoff, der in lebenden Zellen verwendet werden kann, um den Zellzyklus zu erkennen, wie es mit der DNA-Gehalt korreliert. Hoechst 33342 Extrudieren Zellen erscheinen im unteren Teil der beiden Kanäle Emission Hoechst (450 nm, Hoechst blau; 650 nm, Hoechst rot), das heißt, abgesehen von der Hoechst-Beibehaltung "Bevölkerung", geben sie ihren Namen "Seite Bevölkerung". SP Zellen in Zellen mit Stammvater Eigenschaften angereichert sind und zeigen eine hohe Expression von multiresistenten ABC-Transporter (z. B. MDR1 und ABCG2). Hoechst 33342 wird als Hoechst für die folgenden Teile des Protokolls geschrieben. Es ist wichtig zum Schutz der lichtempfindlichen Materialien für optimale Ergebnisse.

  1. Färbung mit Hoechst in an- und Abwesenheit von verapamil
    1. Verapamil (mit einer Endkonzentration von 83,3 µM) und Hoechst (mit einer Endkonzentration von 5 µg/106 -Zellen) der Zelle Projektmappe hinzufügen. Verwenden Sie für Schlauch AVerapamil und Hoechst; Verwenden Sie für Rohr BHoechst nur. In einem Wasserbad (bei 37 ° C) für 90 min inkubieren Sie und wieder die Schläuche alle 20 min (Abbildung 1).
    2. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 470 X g für 5 min bei RT. verwerfen der Überstand und Aufschwemmen Sie jedes Pellet in HBSS (1 x 106 Zellen/mL).
    3. Nehmen Sie eine 1,5 mL aliquoten für einzelne Färbungen und Negativkontrolle aus Rohr B (Abbildung 2): (i) Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugierten Anti-Sca-1; (Ii) Allophycocyanin (APC)-konjugierten Anti-CD31; (Iii) nonstained Zellen (Negativkontrolle).
      Hinweis: Isotype Steuerelemente werden hier für den Aufbau der Isolierung-Protokoll verwendet.
    4. Zentrifugieren Sie Röhren A und B und die Single-Färbung und eine negative Kontrolle Aliquote 470 X g für 5 min bei RT für Hoechst und Verapamil auswaschen.
    5. Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie die Pellets Schlauch A und (Iii) die negativ-Kontrolle in 250 µL HBSS und halten sie auf dem Eis im Dunkeln bis zu sortieren.
    6. Dem Pellet Rohr B in 200 µL HBSS und das Pellet (i, Ii) der einzelnen Färbung Aliquote in 100 µL HBSS Aufschwemmen. FITC-konjugierten Anti-Sca-1 (0,6 µg/107 Zellen) und APC-konjugierten Anti-CD31 (0,25 µg/107 Zellen) hinzufügen. Brüten Sie die Pellets für 30 min auf Eis, und schütteln Sie sie von Zeit zu Zeit im Dunkeln.
    7. Die Rohre 2 mL HBSS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 470 X g für 5 min bei RT
    8. Den Überstand verwerfen und erneut alle Pellets mit 1 mL HBSS und Zentrifuge als oben. Entsorgen Sie die Überstände. Das Pellet Single-Färbung Aliquote in 200 µL HBSS aufzuwirbeln. Aufschwemmen der Pellet Schlauch B in HBSS (20 x 106 Zellen/mL).
    9. Halten Sie die Proben auf Eis und vor Licht geschützt werden, bis zu sortieren.
  2. Sortieren mit Durchflusszytometrie
    1. Bereiten Sie sterile 1,5 mL Sortierung Rohre mit 500 µL HBSS einschließlich 2 % FBS.
    2. Färben Sie die Zellen mit 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µg/106 Zellen) für 10 min auf Eis, abgestorbenen Zellen auszuschließen.
    3. Sortieren die kardialen SP mit folgenden Einstellungen: Hoechst mit 350 nm (UV) Erregung zu begeistern, Fluoreszenzemission mit einem 450/50 nm Bandpass-Filter (Hoechst blau) und 670/30 nm Bandpass-Filter (Hoechst rot) sammeln und verwenden eine Düsengröße von 100 µm und Druck 15 Psi.
    4. Für die Analyse, aufzeichnen, 5 x 105 Ereignisse für die Sortierung Proben und 1 x 105 Ereignisse für die Negativkontrolle, Verapamil Kontrolle und Single-Färbung Proben.
      Hinweis: Die kardialen SP liegt bei etwa 0,5 % - 2 % (Abbildung 1 H) aber kann variieren zwischen Labors und Isolate. Die Sca-1+/CD31– Bruch liegt bei etwa 1 % - 11 % der gesamten kardiale SP (Abbildung 1I) aber variieren zwischen Labors und Isolate. SCA-1+/CD31– SP-CPCs sind als SP-CPC-Gebote für die folgenden Teile des Protokolls geschrieben.

(5) Primärkultur von isolierten SP-CPC-Gebote

Hinweis: In diesem Protokoll wurden drei verschiedene Arten von Medien verwendet. Sie werden als Medium 1 (gemäss Noseda Et Al.) bezeichnet 8, Medium 2 und Medium 3 und sind in der Tabelle der Werkstoffe hinsichtlich ihrer Zusammensetzung beschrieben.

  1. Warm up Medium 1 bis 37 ° C vor dem Gebrauch und der Zentrifuge auf 4 ° c abkühlen Die Sortierung Rohre bei 4 ° C und 470 X g für 6 min Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen im Medium 1.
  2. Setzen Sie die Zellen auf einem gasdurchlässigen P60 Teller mit 4 mL Medium 1. Das Medium jeder 3-d zu ändern, bis die Zellen Zusammenfluss von 70-80 % erreicht haben.
    Hinweis: Schritt 5.2 kann etwa 2-3 Wochen dauern.

6. Erweiterung und Differenzierung der SP-CPC

  1. Zellkultur
    1. 3 x 105 SP-CPCs in 8 mL Medium 1 in ein Auffanggefäß T75-Kultur.
    2. Inkubieren Sie SP-CPCs bei 37 ° C mit 5 % CO2 bis 70-80 % Zusammenströmen, ändern des Mediums alle 2-3-d.
      Hinweis: Die Anzahl von Zellen sollten nach der Art des CPCs verwendet, die Verdopplungszeit und Größe der Zellen geändert werden.
  2. SP-CPC Wachstum und Rentabilität unter unterschiedlichen Serumkonzentrationen
    1. Kultur SP-Kooperationssystem für 2-3-d in T75 Fläschchen mit 8 mL Medium 1. Vorsichtig aspirieren Sie das Medium und sanft mit 5 mL Warm (37 ° C) HBSS abspülen.
    2. Behandlung der Zellen mit 5 mL Trypsin-EDTA für 5 min in der Zelle-Inkubator, fügen Sie 5 mL Medium 1, die Trypsin-Aktivität zu stoppen und übertragen die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube.
    3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 470 X g für 5 min bei RT
    4. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 1 Medium oder Medium 2 (Linie Induktion Mittel) und Platte 2,5 x 105 SP-CPCs P60 Gerichte mit 3 mL Medium mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen.
    5. Sammeln Sie das Medium aus der Schale des Schrittes 6.2.4 für die Sammlung von abgestorbenen Zellen in ein 15 mL Röhrchen nach 2 d der Kultivierung in Medium 1 oder 2 Medium.
    6. Trypsinize adhärente Zellen wie in Schritt 6.2.2 und sammeln Sie die Zellsuspension in der 15 mL Tube von Schritt 6.2.5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 840 X g für 5 min bei RT
    7. Aspirieren Sie überstand und 1 mL Medium 1 oder 2 Medium für Zellzählung. Führen Sie SP-CPCs mit Trypan blau (0,4 %) und Graf Trypan blau-positiv (tot) und Trypan blau-negativ (praktikable) Zellen zu Flecken.
      Hinweis: Der Zellviabilität (Schritt 6.2.7) wird als Trypan blau negative Zellzahl in Bezug auf die gesamte Zelle Nummer gegeben.
  3. Induktion der endothelialen Differenzierung
    1. Precoat eine (6-Well) Kultur-Platte mit 10 µg/mL Laminin (LN) oder Fibronektin (FN).
      1. Machen Sie eine Substratlösung enthält 10 µg/mL LN oder FN mit F12 Medium (oder PBS). Jede Vertiefung 2 mL Substratlösung hinzufügen. Pflegen Sie die Platte für 30 min bei 37 ° C.
      2. Aspirieren Sie die Lösung aus der Platte und 2 mL PBS in jede Vertiefung bis zu benutzen.
    2. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen aus Schritt 6.1.2, spülen Sie sie vorsichtig mit 5 mL Warm (37 ° C) HBSS, behandeln sie mit 5 mL Trypsin-EDTA für 5 min in der Zelle-Inkubator, fügen Sie 5 mL Medium 1, die Trypsin-Aktivität zu stoppen und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube.
    3. Zentrifugieren der Zellen bei 470 X g für 5 min bei RT Aspirat überstand und Medium 2 für Zellzählung hinzufügen.
    4. 8 x 104 Samenzellen pro gut auf die beschichtete Platte mit 3 mL Medium 2 und halten Sie es bei 37 ° C für 20-24 h Änderung des Mediums zu 3 mL Medium 3.
      Hinweis: Wir empfehlen die Verwendung eine niedrigen Serum-Konzentration-haltigem Medium – und ohne Zusätze – für die ersten 20-24 h. Wir empfehlen mit < 60 % Zelle Zusammenfluss (d. h., die Handynummer des Schritts 6.3.4 hat je nach Zelle Größe und Wachstum angepasst werden).
    5. Kulturzellen für 21 d und das Medium alle 3 d verändern.
    6. Überprüfen die endotheliale Natur von differenzierten Zellen färben sie mit eine endotheliale Marker wie z. B. von-Willebrand-Faktor (vWF) und darstellende Fluoreszenz-Mikroskopie.
      1. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS und befestigen Sie die Zellen in 3,7 % Formaldehyd für 2 min bei RT
      2. Permeabilize der Zellen mit 0,1 % Triton X in DdH2O (oder PBS) für 30 min und mit 10 % Ziegenserum für 1 h bei RT blockieren
      3. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper (1: 100) für 48 h bei 4 ° C
      4. Waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL PBS, für 10 Minuten jedes Mal. Inkubieren sie mit Alexa Fluor 546 Ziege Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 500) für 1 h bei RT im Dunkeln.
      5. Waschen wieder 3 X für jeweils 10 min mit 1 mL PBS. Färben Sie die Zellkerne mit 4'6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI; 1: 500) für 5 min bei RT in der Dunkelheit.
      6. Waschen Sie die Zellen 3 X für jeweils 5 min mit 1 mL PBS. Montieren Sie die Zellen und bei 4 ° C lagern
        Hinweis: Die Kultivierung Bedingungen (Substrat, Medium, zusätzliche Reagenzien und FBS Konzentration) Schritte 6.1 und 6.3 sind in Abbildung 3beschrieben.
  4. Rohr-Bildung-assay
    1. Vorbereiten eine Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel, im folgenden als Matrix bezeichnet) Platte.
      1. Die Matrix bei 4 ° C über Nacht Auftauen.
      2. Mantel einer 96-Well-Platte mit 100 µL der Matrix auf Eis.
        Hinweis: Es ist wichtig, Luftblasen in der Matrix zu vermeiden. Die Platten müssen auf Eis zu vermeiden, die Jellification der Matrix beschichtet werden.
      3. Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C für 30 Minuten.
    2. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen (nach Abschluss von Schritt 6.3.5), sanft spülen Sie die Zellen mit 5 mL Warm (37 ° C) HBSS, und behandeln sie mit Trypsin-EDTA für 5 min in der Zelle-Inkubator. Fügen Sie Medium 3 um die Trypsin-Aktivität zu stoppen und die Zellsuspension auf eine 15 mL Tube übertragen.
    3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 470 X g für 5 min bei RT Aspirat überstand, fügen Sie 1 mL Medium 3 und Pipettieren sanft.
    4. Filtern Sie die Zellen mit 35 µm Zelle Sieb, wenn die Zellen aggregiert werden.
    5. Zählen der Zellen und 2 x 103 bis 4 x 103 Zellen in 100 µL Medium 3 in jeder Matrix-beschichtete gut Samen. Halten Sie die Platte bei 37 ° C in der Zelle-Inkubator für 16 h.
    6. Nehmen Sie ein Bild mit einem Hellfeld Mikroskop mit 2 X Vergrößerung.
      Hinweis: Im Falle eines unvollständigen Trypsinization verlängern Sie die Belichtungszeit, Trypsin-EDTA bis maximal 7-8 min.

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Ergebnisse

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Maus SP-CPC Isolation:

In dieser Studie verwendeten wir Maus CPCs isoliert nach SP Phänotypus, während Ergebnisse von Ratte CPCs sind geändert und aus einem früheren Bericht mit Erlaubnis (Abbildung 8)33hinzugefügt.

Zellproliferation unter hohen und niedrigen Zelldichten und mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen:

...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorteile dieses Protokolls:

Dieses Protokoll bietet eine Technik der endothelialen Differenzierung des CPCs. Wir fanden, dass eine niedrige Serumkonzentration und geringer Zelldichte die Effizienz der endothelialen Differenzierung, wobei LN erwies sich als ein geeigneter Substrat als FN unter diesen Bedingungen verbessern könnte. Wir haben zwei verschiedene Arten von CPCs: Ratte CPCs, die in einer Zelle der Zeile-Manier und Maus SP-CPCs verwendet wurden, die isoliert und erweitert wurden. Vor all...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Vera Lorenz für ihre hilfreiche Unterstützung während der Experimente und das Personal von der Flow Cytometry Einrichtung der Abteilung Biomedizin (DBM), Universität und Universitätsspital Basel. Diese Arbeit wurde durch den Aufenthalt auf Track-Programm an der Universität Basel (um Michika Mochizuki) unterstützt. Gabriela M. Kuster wird unterstützt durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (Grant Nummer 310030_156953).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kulturmedium
Iscove's Modifiziertes DulbeccoMedium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)/Nährstoffmischung F12 SchinkenMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher#15140122
Fötales Rind Serum (FBS)Hykllon#SH300713,5% (0,1% für die Induktion)
L-Glutamin ThermoFisher#25030Endkonzentration 2 mM
GlutathionMerck#G6013
Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Rekombinanter basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 NahrungsergänzungsmittelThermoFisher#17504044
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Schweiz#100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0,05 % Trypsin-EDTAThermoFisher#25300
T75 KolbenSarstedt#83.3911
Endotheliale Differenzierung   
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronektin Merck#F4759Verdünnen in ddH2O
6 Well PlateFalcon#353046
FormaldehydlösungMerck#F1635Diluit 1:10 in PBS (3,7% Endkonzentration)
Triton X-100Merck#934200,1% in ddH2O
Normales Ziegenserum (10%)ThermoFisher#50062Z
Anti-von-Willebrand-Faktor-AntikörperAbcam#ab69941:100 in 10% Ziegenserum
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in 10% Ziegenserum
4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI)ThermoFisher#622471:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade KitThermoFisher#S2828
BX63 WeitfeldmikroskopOlympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml Rundbodenröhrchen mit SiebkappeFalcon#352235
Matrigel Wachstumsfaktor reduziertCorning#354230
IX50 WeitfeldmikroskopOlympus
Sca-1+/CD31- Isolierung der Herzseitenpopulation34 
Reagenzien
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.hauseigene Krankenhausapotheke#9077862Arbeitslösung: 200 mg/kg
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), Phenolrot (-)ThermoFisher#14175Bereiten Sie HBSS 500 mL + 2% FBS vor  zum Abschrecken der Kollagenase B-Aktivität 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/l D-Glucose, L-Glutamin, PyruvatThermoFisher#331885Präparat DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S für Hoechst Stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Endkonzentration 25 mM
Fötales Rinderserum (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLAuf 1X in ddH2O verdünnen und durch ein 0,2 & Mikro filtrieren; m Filter
Kollagenase BMerck#11088807001Endkonzentration 1 mg/ml in HBSS, gefiltert durch eine 0,2 &μ; m Filter
BisBenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst)Merck#B2261Bereiten Sie 1 mg/ml in ddH2O
Verapamil-hydrochlorid her Merck#V4629Endkonzentration 83,3 &Mikro; M 
APC Ratte Anti-Maus CD31BD Biosciences#5512620.25 µ g/107cells
FITC Ratte Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050,6 µ g/107Zellen
7-Aminoactinomycin D (7-ADD)ThermoFisher#A13100,15 µ g/106Zellen
APC Ratte IgG2a k IsotypkontrolleBD Biosciences#5539320,25 µ g/107Zellen
FITC Ratte IgG2a k Isotyp-KontrolleBD Biosciences#5546880,6 µ g/107cells
Material
Nadeln 27GTerumo#NN-2719R
Nadeln 18GTerumo#NN-1838S
Einmalspritzen 1 mL sterilCODAN#62.1640
Transferpipette 3,5 mLSarstedt#86.1171.001
Zelle Sieb 40 µ m blueBD Biosciences #352340
Zellsieb 100 & Mikro; m yellowBD Biosciences#352360
Lumox Schale 50Sarstedt#94.6077.305
Kulturschalen P100Corning#353003
Kulturschalen P60Corning#353004
Mouse
LineAgeBreeding
C57BL/6NRj / männlich12 Wochenim Haus
Product Name<>CompanyKatalognummer:
Reagenzien
Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modifiziertes Adlermedium (DMEM)/Nährstoffgemisch F12 SchinkenMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
Fötales Rinderserum (FBS)Hyklone#SH30071
L-Glutamin ThermoFisher#25030
GlutathionMerck#G6013
B27 NahrungsergänzungsmittelThermoFisher#17504044
Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Rekombinanter basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Schweiz #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Übersicht über die Zusammensetzung des Mediums. Einige dieser Informationen sind identisch mit den oben genannten, jedoch nach der Zusammensetzung der Medien 1-3 sortiert.
Product NameMedium 18Medium 2Medium 3
<>ReagenzienKulturLineage inductionEndothelial diff.
Iscove's Modifiziertes Dulbecco's Medium (IMDM)35%35
%Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nährstoffmischung F12 Schinken65%65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S)1%1%
Fötales Rinderserum (FBS)3,5%≤ 0,1%L-Glutamin
 2 mM2 mM
Glutathion0,2 nM0,2 nM
B27 Supplement1,3%
Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)6,5 ng/ml
rekombinanter basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)13 ng/ml
Cardiotrophin 1 0,65 ng/ml
Thrombin0,0005 U/mlAlle notwendigen Komponenten im Kit enthalten
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitAlle notwendigen Komponenten im Kit enthalten
Iscove's Modified Dulbecco's

Referenzen

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