Phospho-Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Zelle Barcoding für einzelne Zelle Signalisierung Analyse und Entdeckung von Biomarkern

Summary

Hier ist ein Protokoll für Medium-High Throughput Analyse von Protein-Phosphorylierung-Veranstaltungen auf der zellulären Ebene präsentiert. Phospho-Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiger Ansatz charakterisieren Signalisierung Aberrationen, identifizieren und Biomarker zu validieren und Pharmakodynamik zu beurteilen.

Abstract

Aberrante Zelle Signalisierung spielt eine zentrale Rolle bei der Krebsentstehung und Progression. Am meisten neue zielgerichtete Therapien richten sich in der Tat an Proteine und Proteinfunktionen und Zelle Signalisierung Aberrationen können daher als Biomarker an personalisierte Behandlungsmöglichkeiten dienen. Im Gegensatz zu DNA und RNA Analysen können Veränderungen der proteinaktivität die Mechanismen, die Droge Sensibilität und Widerstand effizienter auswerten. Phospho-Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik, die Protein-Phosphorylierung-Veranstaltungen auf der zellulären Ebene, ein wichtiges Merkmal misst, das diese Methode von anderen Antikörper-basierten Ansätzen unterscheidet. Die Methode ermöglicht simultane Analyse von mehreren Signalproteine. In Kombination mit fluoreszierenden Zelle Barcoding können größere Medium-Hochdurchsatz-Datensätze von standard Cytometer Hardware in kurzer Zeit erworben werden. Phospho-Durchflusszytometrie hat Anwendungen in Studien der grundlegende Biologie und in der klinischen Forschung, einschließlich der Entdeckung von Biomarkern, Analyse und Bewertung der Pharmakodynamik-Signalisierung. Hier wird ein detaillierte experimentelle Protokoll für Phospho-Flow-Analyse der gereinigten peripheren mononukleären Blutzellen, mit chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen als Beispiel bereitgestellt.

Introduction

Phospho-Durchflusszytometrie wird verwendet, um Protein-Phosphorylierung-Spiegel bei einzelligen Auflösung zu analysieren. Das übergeordnete Ziel der Methode ist zellulären Signalisierung Muster unter bestimmten Bedingungen zuordnen. Durch die Ausnutzung der multiparameter Kapazität der Durchflusszytometrie, können mehrere Signalwege gleichzeitig in verschiedenen Teilmengen eine heterogene Zellpopulation wie peripheren Blut analysiert werden. Diese Eigenschaften bieten Vorteile gegenüber anderen Antikörper-basierten Technologien wie Immunohistochemistry, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), Protein Arrays und umgekehrter Phase Protein Arrays (RPPA)¹. Phospho-Durchflusszytometrie kombinierbar mit fluoreszierenden Zelle Barcoding (FCB), was bedeutet, dass einzelne Zellproben mit eindeutige Signaturen von Fluoreszenzfarbstoffen gekennzeichnet sind, so dass sie miteinander vermischt, gebeizt und, wie eine einzelne Probe^{2 analysiert}. Dies reduziert den Antikörper erhöht die Robustheit der Daten durch die Kombination von Steuerung und behandelten Proben und erhöht die Geschwindigkeit des Erwerbs. Die Gesamtbevölkerung der FCB kann dann in kleineren Proben unterteilt und befleckt mit bis zu 35 verschiedene Phospho-spezifische Antikörper, abhängig von der Menge des Ausgangsmaterials. Großen Profilerstellung Experimente können dabei mit standard Cytometer Hardware ausgeführt werden. Phospho-Durchflusszytometrie wurde auf Profil Signalwege in Patientenproben aus mehreren hämatologischen Krebserkrankungen einschließlich chronischer lymphatischer Leukämie (CLL)^3,4,5, akute myeloische Leukämie (AML) angewendet ⁶ und non-Hodgkin Lymphome⁷. Phospho-Durchflusszytometrie ist somit ein leistungsfähiger Ansatz charakterisieren Signalisierung Aberrationen, identifizieren und Biomarker zu validieren und Pharmakodynamik zu beurteilen.

Hierbei ist die optimierte Protokoll für die Analyse von CLL Patientenproben von Phospho-Durchflusszytometrie (Abbildung 1A) vorgesehen. Beispiele für basale Signalisierung Charakterisierung, Anti-IgM/B-Zell-Rezeptor-Stimulation und Droge Störung sind. Eine detaillierte Beschreibung einer FCB-Matrix wird zur Verfügung gestellt. Das Protokoll kann leicht auf andere Zelltypen Fahrwerk angepasst werden.

Protocol

Blutproben gingen nach schriftlicher Einwilligung von allen Spendern. Die Studie wurde vom Regionalkomitee für Medizin und Gesundheit Forschung Ethik des Südost-Norwegen genehmigt und die Forschung auf menschliches Blut erfolgte in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki-⁸.

Hinweis: Schritte 1 bis 3 sollte unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube durchgeführt werden.

1. Isolierung der peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von CLL-Patienten Blutproben

Achtung: Menschliches Blut sollte gemäß den Vorschriften für Biosafety Level 2 behandelt werden.

1. Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na₂HPO₄ 2 H₂O, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) und Transfer zum 50 mL Röhrchen (30 mL/Tube).
2. Sorgfältig Schicht 10 mL eine Dichte Gradienten Medium (z.B.Lymphoprep) an der Unterseite des Rohres mit einer 10 mL-Pipette.
3. Zentrifuge bei 800 X g für 20 min bei 4 ° C. Die PBMCs sind jetzt am Anfang der Dichte Gradienten mittlere Schicht sichtbar.
4. Mithilfe einer Pasteurpipette um die Zellen in zwei neuen 50 mL Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie zweimal mit PBS (füllen sich die Röhren).
5. Zentrifugieren bei 350 X g für 15 min. überstand verwerfen und in 3 mL PBS aufzuwirbeln.
6. Zählen Sie die Zellen mit einer bevorzugten Methode.
7. Zentrifugieren der Zellen bei 350 X g für 5 min. verwerfen des Überstands. Hinweis: 1.8 bis 3.2 Schritte sind optional. Es ist möglich, direkt mit Schritt 3.3 fortfahren.
8. Aufschwemmen der Zellen im fetalen bovine Serum (FBS) mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) ergänzt und nach unten in geeigneten Aliquote mit Cryo-Röhrchen einfrieren.
   Hinweis: DMSO ist giftig für die Zellen. Arbeiten Sie schnell, sobald die Zellen mit FBS/DMSO vermischt werden. Zellen können in flüssigem Stickstoff gespeicherte langfristig sein.

(2) Auftauen von Zellen

1. Schnell Auftauen der Zellen in einem 37 ° C-Wasserbad.
   Hinweis: DMSO ist giftig für die Zellen. Arbeiten Sie schnell, um die Belichtung zu DMSO zu begrenzen.
2. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL kaltes Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640 mit ergänzenden GlutaMAX, siehe Tabelle of Materials).
3. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
4. Aufschwemmen der Zellen in RPMI 1640 Medium ergänzt mit Natrium Pyruvat, MEM nicht-essentiellen Aminosäuren und Penicillin/Streptomycin (bei 1 X Verdünnung gemäß Anweisungen hinzugefügt) und 10 % FBS. Die Zellen in eine kleine Zelle Kultur Kolben übertragen und in einem Inkubator bei 5 % CO₂, 37 ° C für 1 Stunde, um die Zellen zu kalibrieren lassen.

3. Vorbereitung der Zellen

1. Zählen der lebensfähigen Zellen mittels eine bevorzugte Methode.
2. Übertragen Sie die Zellen auf ein 50 mL-Tube und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. Überstands verwerfen.
3. Aufschwemmen der Zellen in RPMI 1640 Medium (Schritt 2.2) ergänzt mit 1 % FBS zu nicht mehr als 50 x 10⁶ Zellen/mL.
4. Übertragen Sie die erforderliche Menge an Zellsuspension auf Brunnen in eine 96-well-V-Boden-Platte.
   Hinweis: Anzahl der Bohrungen entspricht die Anzahl der Bedingungen getestet werden. Proben für eine Stimulation Zeitverlauf werden aus einem einzigen Brunnen gezeichnet. 50 µL Probe pro Zeit-Punkt + 50 µL Totvolumen zu berechnen. Proben für Entschädigung Steuerelemente (eine ungefärbte Probe + eine Probe pro Barcode Farbstoff) zu speichern.
5. Übertragen Sie die 96-well-Platte auf einem vorgewärmten 37 ° C Wasserbad. Ruhen Sie die Zellen für 10 min.

4. Stimulation und Fixierung der Zellen

Hinweis: Führen Sie die Schritte 4 bis 8 auf dem Labortisch (d. h. nicht steril).

Achtung: Die wichtigste Zutat des Puffers zu beheben ich ist Paraformaldehyd, giftigen (Einatmen und Haut-Kontakt). Mit Vorsicht handhaben.

1. Bereiten Sie eine 96 well V-Boden-Platte mit 60 µL Puffer zu beheben ich pro Bohrloch pro Probe. Lassen Sie in das 37 ° C-Wasserbad.
   Hinweis: Zellen: Fix Puffer sollte 1:1 sein. Um Verdunstung bei 37 ° C zu ermöglichen, ist der Fix-Puffer zunächst in Hülle und Fülle.
2. Optional, behandeln Sie die Zellen mit Drogen vor der Stimulation.
3. Übertragen Sie eine Kontrollprobe 50 µL auf Fix-Platte. Mischen von pipettieren rauf und runter.
4. Optional, zunächst den Zeitverlauf Stimulation der Zellen 10 µg/mL Anti-IgM hinzu. Mischen von pipettieren rauf und runter.
5. Übertragen Sie zu jedem Zeitpunkt eine 50 µL Probe auf Fix Platte. Mischen von pipettieren rauf und runter.
   Hinweis: Anti-IgM induzierte Signalisierung in der Regel früh eingeleitet wird (Minuten).
6. Verlassen Sie die Fix-Platte bei 37 ° C für 10 min nach die letzte Probe hinzugefügt wurde.

5. fluoreszierende Zelle Barcoding (FCB)

Hinweis: Siehe Tabelle 1 für eine Liste der Barcoding Reagenzien.

1. Waschen Sie die festen Zellen 3 X mit PBS (füllen Sie den Brunnen).
2. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
3. Bereiten Sie einen 96 well V-Boden-Platte mit Barcoding Reagenzien. Pipettieren 5 µL jedes Barcoding Reagenz pro Bohrloch in die Anzahl der Kombinationen erforderlich, alle Proben nach der Färbung Matrix, z. B. in Abbildung 1 bzu beflecken. Jede Probe wird eine einzigartige Kombination aus verschiedenen Barcoding Konzentrationen haben.
4. Die Zellen in 190 µL PBS und Übertragung auf die Platte Barcoding aufzuwirbeln. Mischen Sie gründlich.
   Hinweis: Fleck eine Entschädigung Probe mit der höchsten Endkonzentration für jeden Barcode-Reagenz verwendet und eine ungefärbte Probe zu retten.
5. Lassen Sie die Zellen für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
6. Waschen Sie die gefärbten Zellen 2 X mit Fluss waschen (PBS, 1 % FBS, 0,09 % Natriumazid) (füllen Sie den Brunnen).
7. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
8. Die Zellen fügen Sie 190 µL Fluss waschen hinzu und kombinieren Sie die Barcode-Proben in einem 15 mL-Tube. Übernahmesteuerung jede Entschädigung an eine separate 1,7 mL-Tube.
9. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.

6. Zelle Permeabilisierung zum intrazellulären Antigen Beizen

Achtung: Der Hauptbestandteil von Perm Puffer III ist Methanol ist giftig (Einatmen und Haut-Kontakt) und entzündlich. Mit Vorsicht handhaben.

1. Übertragen Sie 2 mL Perm Puffer III auf eine 15 mL Tube. Lassen Sie bei-20 ° C, so ist es eiskalt bei Verwendung.
   Hinweis: Perm-Puffer kann von Beginn des Experiments bei-20 ° C belassen werden.
2. 1,5 mL eiskaltes Perm-Puffer, die Barcode-Zell-Population (in der 15 mL Tube) und 100 µL jeder Entschädigung Steuerelement fügen Sie hinzu (in 1,7 mL Röhrchen) tropfenweise beim aufschütteln zu vermeiden, dass die Zellen verklumpen.
3. Übertragen Sie die Zellen direkt auf-80 ° C. Lassen Sie für ein Minimum von 30 Minuten.
   Hinweis: Es ist natürlich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten. Zellen in Perm Puffer können gespeicherte langfristig bei-80 ° c sein.

(7) Antikörper Färbung

Hinweis: Tabelle der Materialien finden Sie eine Liste der gemeldeten Phospho-spezifische Antikörper.

1. Übertragen Sie die Zellen von-80 ° C auf eine Schachtel mit Eis.
2. Waschen Sie 3 X mit Fluss waschen.
   Hinweis: Es ist wichtig, Fluss waschen im Übermaß zu sehen, die Zelle Pellet hinzufügen, z. B. 3 mL Fluss waschen, die Barcode-Zell-Population und 1 mL jede Entschädigung-Steuerelement hinzufügen.
3. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
4. Aufzuwirbeln Sie die Barcode-Zell-Population in einem Volumen von Fluss waschen, wodurch 25 µL Zellsuspension pro Phospho-Antikörper Fleck. Die Entschädigung Steuerelemente in 200 µL Fluss waschen aufzuwirbeln.
5. Bereiten Sie vor, dass Antikörper Färbung in eine 96-well-V-Boden-Platte. Das Endvolumen werden 50 µL/Well. Fügen Sie pro Bohrloch Phospho-spezifische Antikörper im Fluss Waschen zu einem Endvolumen von 10 µL, Surface Marker verdünnt im Fluss Waschen zu einem Endvolumen von 15 µL und 25 µL Zellsuspension verdünnt.
   Hinweis: Antikörper-Verdünnungen sollten vor dem Experiment titriert werden. Umfassen Sie die Isotype Kontrolle.
6. Lassen Sie die Zellen für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
7. Waschen Sie die gefärbten Zellen 2 X mit Fluss waschen (füllen Sie den Brunnen).
8. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. verwerfen den überstand.
9. Die Zellen in 150 µL Fluss waschen aufzuwirbeln.

8. Vorbereitung der Entschädigung steuert

1. Die Antikörper konjugiert Fluorochromes parallel mit dem Antikörper Beflecken Entschädigung Kontrollen vorbereiten. Verwenden Sie Perlen der Entschädigung gemäß den Anweisungen des Herstellers.

9. Flow Cytometry Analysis

Hinweis: Das Experiment kann auf einem Durchflusszytometer mit einem hohen Durchsatz Sampler (HTS) ausgeführt werden.

1. Die Photomultiplier (PMT) röhrenspannung mit der ungefärbten Steuerung zu optimieren.
2. Führen Sie Entschädigung Kontrollen und berechnen Sie die Entschädigung-Matrix zu.
3. Laufen Sie Proben. Die Ereignisrate sollte gemäß den Spezifikationen des Instruments.

10. Anspritzung Strategie und Datenanalyse

1. Importieren Sie die FCS-Dateien aus dem Experiment, eine Flow-zytometrie-Analyse-Software wie FlowJo oder Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Gating Strategie
   1. Wählen Sie Lymphozyten von SSC-A im Vergleich zu Plotten FSC-A in eine Dichte-Dot-Plot.
   2. Die Lymphozyten und wählen Sie die Unterhemden von SSC-A im Vergleich zu FSC -W. Plotten
   3. Zeigen Sie die Einzelzellen und Tor die Zelle geben Sie durch Plotten SSC-A im Vergleich zu der Oberfläche Marker an.
   4. Typ Zellpopulation in Pacific Blue vs. SSC-A Dichte Handlung anzeigen, und wählen Sie die verschiedenen FCB-Populationen anhand ihrer Pacific Blue Färbung Intensität (siehe Abbildung 1A).
   5. Plot den Phospho-Antikörper-Kanal gegen den FCB-Kanal oder als eine Heatmap (siehe Abbildung 1A), die Phosphorylierung Ereignisse anzuzeigen.
3. Phospho-Signale mit Hilfe des inversen hyperbolischen Sinus (Arcsinh) des MFI (Median Fluoreszenz Intensität) des Phospho-Signal im Vergleich zu Isotype-Steuerelements zu berechnen (basale Phosphorylierung Ebenen, siehe Abbildung 1), oder der stimulierten im Vergleich unstimulierte Zell-Populationen (siehe Abbildung 1E).

Results

Die wichtigsten Schritte des Phospho Flow Cytometry Protokolls sind in Figur 1Adargestellt. Im dargestellten Beispiel waren die CLL-Zellen mit dem Barcode-Reagenz Pacific Blue bei vier Verdünnungen befleckt. Dreidimensionale Barcoding kann durchgeführt werden, durch die Kombination von drei Barcoding Farbstoffe, wie in Abbildung 1 bdargestellt. Die Einzelproben sind dann deconvoluted durch nachfolgende Anspritzung auf jeden Barco...

Discussion

Phospho-Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik, Phosphorylierung proteingehalte in einzelnen Zellen zu messen. Da die Methode stützt sich auf die Färbung mit Antikörper, ist Phospho-Durchflusszytometrie durch Antikörper Verfügbarkeit begrenzt. Außerdem, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, alle Antikörper sollten titriert und vor Gebrauch überprüft. Ein detailliertes Protokoll für die Titration von Phospho-spezifische Antikörper wurde an anderer Stelle¹²beschrieben. Während Panel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Zellkulturmedium
Fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific	10270169	Zusatz zu Zellkulturmedium
Natriumpyruvat	ThermoFisher Scientific	11360-039	Zusatz zu Zellkulturmedium
MEM nicht-essentielle Aminosäuren	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additiv zum Zellkulturmedium
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Density Gradient
Medium Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Zur Stimulation des B-Zell-Rezeptors
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Fixierungspuffer
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Permeabilisierungspuffer
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Barcoding-Reagenz
Pacific Blue Succinimidylester	ThermoFisher Scientific	P10163	Barcoding-Reagenz
Pacific Orange Succinimidylester, Triethylammoniumsalz	ThermoFisher Scientific	P30253	Barcoding-Reagenz
Kompensationsperlen	Definiert durch Benutzer		Korrekte Spezies reaktivität
Falcon tubes	Definiert durch user
Eppendorf tubes	Definiert durch user
96 well V-bottom plates	Definiert durch user		Kompatibel mit dem Durchflusszytometer
Zentrifugen	Definiert durch user		Für Eppendorf-Röhrchen, Falcon-Röhrchen und -Platten
Wasserbad	Definiert durch user		Temperaturgeregeltes
Durchflusszytometer	Definiert durch user		Mit High Throughput Sampler (HTS)
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< strong>Antigen
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SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Milz-Tyrosinkinase-Inhibitoren reduzieren…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Referenz: Skå nland et al., 2014, T-Zell-Co-Stimulation durch die CD2 und CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation der proximalen Signalgebung in normalen und transformierten…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Unterschiedliche Muster der B-Zell-Rezeptor-Signalgebung in…, Blut, 129(6): 759-770