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Oberfläche-verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanoprobe Ratiometry zur Erkennung von mikroskopischen Eierstockkrebs über Folsäure Rezeptor Targeting

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DOI:

10.3791/58389

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25. März 2019

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1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eierstockkrebs bildet Metastasen in die Bauchhöhle. Hier präsentieren wir ein Protokoll machen und Verwendung Folat-Rezeptor gezielt Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanosonden, die diese Läsionen mit hoher Spezifität über ratiometrischen Bildgebung zu offenbaren. Die Nanosonden lebenden Mäusen intraperitoneal verabreicht werden, und die abgeleitete Bilder korreliert gut mit der Histologie.

Zusammenfassung

Eierstockkrebs ist die tödlichsten gynäkologische Malignom. Die meisten Patienten präsentieren sich in einem fortgeschrittenen Stadium (FIGO-Stadium III oder IV), wenn lokale Metastasen verbreiten bereits stattgefunden hat. Eierstock-Krebs hat ein einzigartiges Muster der Metastasierung, in diesem Tumor Implantate zunächst in der Bauchhöhle enthalten sind. Diese Funktion könnte im Prinzip die komplette Resektion des Tumors Implantate mit heilender Absicht. Viele dieser metastatischen Läsionen sind mikroskopisch, so dass sie schwer zu erkennen und zu behandeln. Neutralisierung solcher Fixierungsprotokoll gilt als ein wichtiges Ziel zur Beseitigung von Tumor-Rezidiv und langfristiges Überleben zu erreichen. Raman imaging mit Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung Nanosonden kann verwendet werden, um mikroskopisch kleine Tumoren mit hoher Empfindlichkeit, durch ihre helle und Bioorthogonal spektrale Signaturen zu umreißen. Hier beschreiben wir die Synthese von zwei "Varianten" von solchen Nanosonden: ein Antikörper funktionalisiert derjenige, der die Folat-Rezeptor richtet sich an – in vielen Ovarialkarzinome überexprimiert — und eine ungezielte Steuerung Nanoprobe mit unterschiedlichen Spektren. Die Nanosonden sind gemeinsam verwalteten intraperitoneal, Maus-Modellen der metastatischen menschlichen Eierstock Adenokarzinom. Alle Tierversuche stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Die Bauchhöhle der Tiere ist chirurgisch ausgesetzt, gewaschen und mit einem Raman Microphotospectrometer gescannt. Anschließend die Raman-Unterschriften von zwei Nanosonden sind entkoppelten mit einem klassischen Least Squares passenden Algorithmus, und ihre jeweiligen Noten aufgeteilt, um ein ratiometrischen Signal von Folat gezielt über ungezielte Sonden zu liefern. Auf diese Weise werden mikroskopische Metastasen mit hoher Spezifität visualisiert. Der größte Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die lokale Anwendung in der Bauchhöhle – was kann bequem während des chirurgischen Eingriffs erfolgen – können tag Tumoren ohne systemische Nanopartikel Exposition des Patienten zu unterwerfen. Falsche Positive Signale aus unspezifischen Bindung der Nanosonden auf viszerale Oberflächen beseitigt werden kann, von einem ratiometrischen Ansatz folgend, wo gezielte und ungezielte Nanosonden mit unterschiedlichen Raman-Signaturen als Mischung angewandt. Das Verfahren ist derzeit noch begrenzt durch den Mangel an einer kommerziellen Weitfeld-Raman imaging Kamerasystem, wodurch einmal verfügbar für die Anwendung dieser Technik in den OP-Saal.

Einleitung

Raman imaging mit "Oberfläche verstärkten Raman-Streuung" (SERS) Nanopartikel zeigte große Versprechung in Abgrenzung Läsionen in einer Vielzahl von Einstellungen und für viele verschiedene Tumor Typen1,2,3,4 . Der Hauptvorteil von SERS Nanopartikeln ist ihr Fingerabdruck-ähnliche spektrale Signatur, bieten ihnen unzweifelhaft erkennen, die nicht durch biologische Hintergrund Signale5verwechselt wird. Darüber hinaus ist die Intensität des abgestrahlten Signals verstärkt mit dem Einsatz von Reporter Moleküle (Farbstoffe) mit Absorption Maxima im Einklang mit der Erregung Laser, verursachend "Oberfläche verstärkte Resonanz Raman-Streuung" (SERRS) Nanopartikel mit einer noch größeren Empfindlichkeit6,7,8,9,10,11,12.

Eine Barriere, die für die Annahme von SE(R)RS Nanopartikel13 behandelt werden muss und viele andere Nanopartikel Konstrukte14,15 für den klinischen Einsatz ist ihre Art der Verabreichung, als intravenöser Injektion systemische Ursachen Exposition des Agenten, und erfordert umfangreiche Tests, um mögliche Nebenwirkungen ausschließen. In diesem Artikel präsentieren wir ein anderes Paradigma, basierend auf der Anwendung von Nanopartikeln lokal in Vivo, direkt in der Bauchhöhle während der Operation, gefolgt von einen Waschschritt jede ungebundene Nanopartikel1entfernen. Dieser Ansatz steht im Einklang mit neue therapeutische Ansätze, die derzeit untersucht werden, die auch von lokalen Instillation von Agenten in der Bauchhöhle, genannt hyperthermische intraperitoneale Chemotherapie (HIPEC) verwenden. So sollte das Prinzip selbst relativ einfach in einem klinischen Workflow zu integrieren. Wir haben die Bioverteilung der Nanopartikel nach intraperitonealer Anwendung untersucht, und nachweisbaren Absorption in den systemischen Kreislauf1nicht eingehalten. Darüber hinaus umgeht die lokale Anwendung Ansatz die Sequestrierung von Nanopartikeln vom retikuloendothelialen System, so dass die Zahlen von Nanopartikeln erforderlich deutlich reduziert werden. Allerdings neigen bei topischer Anwendung, Antikörper-funktionalisiert Nanopartikel auf die viszerale Oberfläche auch in Abwesenheit von ihr Ziel einzuhalten. Um falsche positive Signale durch unspezifische Nanopartikel Haftung zu minimieren, verfolgen wir einen ratiometrischen Ansatz sieht eine Molekular gezielten Nanoprobe spezifisches Signal und eine ungezielte Steuerung Nanoprobe mit verschiedenen Raman-Spektrum, Konten für unspezifische Hintergrund16,17. Wir haben diese Methode der topisch applizierten Oberflächen verstärkte Resonanz ratiometrischen Ramanspektroskopie vor kurzem in einem Mausmodell der diffusen Eierstockkrebs1gezeigt.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, zwei SERRS Nanosonden, eine gezielt zu entwickeln und eine unspezifische, lokal in Mausmodellen, angewendet werden, um die Prävalenz/Überexpression des Krebses Bild im Zusammenhang mit ratiometrischen Erkennung der beiden Sonden biomarker über Raman imaging. In dieser Arbeit wurde der Folat-Rezeptor (FR) als das Ziel gewählt, da dies ein Marker hochreguliert in viele Ovarialkarzinome18,19. Raman Microimaging mit SERS-basierte Nanopartikel wurde ebenfalls für Krebs Zelle Identifikation20nachgewiesen. Zwei unterschiedliche "Varianten" von Raman Nanopartikel sind, jeweils ein unterschiedlicher organischer Farbstoff seinen Fingerabdruck ableiten synthetisiert. Die Nanopartikel bestehen aus einem sternförmigen gold Kern von einer Silikon-Hülle umgeben und zeigen Oberflächenplasmonenresonanz auf rund 710 nm. Die Raman-Reporter (organischer Farbstoff) lagert sich gleichzeitig mit der Bildung von Kieselsäure Schale. Schließlich ist für die FR-gezielte Nanosonden (αFR-NPs) die Kieselsäure-Shell mit Antikörpern, konjugiert, während die ungezielte Nanosonden (nt-NPs) mit einer Monoschicht von Polyethylenglykol (PEG) passiviert werden.

Diese Technik wurde erfolgreich zur mikroskopische Tumoren in einem Mausmodell Xenograft der diffus metastasierten Ovarialkarzinom (SKOV-3), demonstriert seine Eignung für den Einsatz in-vivo Karte. Es kann auch für den Einsatz in ausgeschnittenen Gewebe für Tumor Phänotypisierung oder Marge Bestimmung nach Gallerte wie gezeigt in einer verwandten Studie21erweitert werden.

SERRS Nanosonden bieten eine robuste Plattform für die Erstellung von mehreren gezielten Tags für Biomarker, mit einfachen chemischen Reaktionen synthetisiert, wie in Abbildung 1schematisch dargestellt. Hier stellen wir das Protokoll für die Synthese der zwei Arten von SERRS Nanosonden (Abschnitte 1 bis 3), die Entwicklung einer geeigneten Eierstockkrebs-Maus-Modell (Abschnitt 4), die Verwaltung von Nanosonden und Bildgebung (Kapitel 5) und schließlich die Datenanalyse und Visualisierung (siehe Abschnitt 6).

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (# 07.06.11) genehmigt.

1. gold Nanostar Kern Synthese

Hinweis: Gold Nanostars dienen als Kerne für beide Varianten von SERRS Nanosonden in diesem Experiment verwendet.

  1. 800 mL 60 mM Ascorbinsäure (C6H8O6) Lösung in entionisiertem Wasser (DI) und 8 mL 20 mM Tetrachloroauric (HAuCl4) Säurelösung in VE-Wasser vorzubereiten. Auf 4 ° c abkühlen lassen
  2. Führen Sie diesen Reaktionsschritt bei 4 ° C. Legen Sie eine konische Kanne mit 800 mL der Ascorbinsäure-Lösung auf einem magnetischen rühren Teller und induzieren Sie einen stetigen Wirbel. Fügen Sie schnell 8 mL der Tetrachloroauric sauren Lösung in den Strudel. Innerhalb von Sekunden Nanostars bilden und die Lösung wird eine dunkelblaue Farbe annehmen. Für den Fall, dass die Farbe jederzeit wird rosa oder lila, bedeutet die Bildung von Nanokugeln, die Aussetzung zu verwerfen und die Synthese vorübergehenden.
  3. Gießen Sie die Nanostar Suspension in 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge für 20 min (4 ° C, 3.220 X g). Aspirieren des Überstands ca. 200 µL der Lösung in jedem Röhrchen zu verlassen. Vorsicht, nicht zu stören das Pellet von Nanopartikeln an der Unterseite des Rohres zu bezahlen.
    Hinweis: Der Überstand sollte einen blauen Farbton wegen verbleibenden suspendierten Nanostars haben.
  4. Mit einer Mikropipette, schütteln Sie die Lösung auszusetzen und die Nanopartikel aus jeder Tube zu sammeln. Teil des Pelletofens kann auf der Unterseite des Rohres komprimiert werden und wird nicht auch mit kräftig Pipettieren-Rückbau dieser Teil Aufschwemmen.
  5. Die Nanopartikel Suspension auf eine Dialyse-Kassette (MWCO 3,5 kDa) übertragen und Dialyse mindestens drei Tage gegen 2 L DI-Wasser, das Wasser täglich zu wechseln. Speichern Sie Nanostars in der Dialyse bei 4 ° C bis zu einem Monat mit Wasserwechsel alle 3-4 Tage.
    Hinweis: Die Nanostars sollte in der Dialyse bis für die Silication Reaktion erforderlich gehalten werden, wie in Abschnitt 2 beschrieben.

(2) Bildung von Kieselsäure Shell

Hinweis: Zwei Varianten von Raman Nanosonden synthetisiert werden. Die Synthese-Verfahren ist das gleiche für beide, mit dem einzigen Unterschied, das Raman-Reporter Molekül (Farbstoff) verwendet. In diesem Experiment werden IR780 Perchlorat und IR140 verwendet. Die Reaktion sollte immer in Kunststoff-Behältern durchgeführt werden. Die Synthese ist hoch skalierbar und kann für die gewünschte Menge an Injectate erforderlich angepasst werden. Hier wird eine mittlere Batch-Synthese beschrieben, die niedrigere oder höhere Mengen linear skaliert werden kann, je nach Bedarf, mit der gleichen Konzentration und Reaktionszeit. Die Reaktionen der beiden SERRS Nanoprobe Arten können parallel ausgeführt werden. Achten Sie auf Cross-Kontamination zu vermeiden. Beschallung sollte durchgeführt werden, für die Redispergierung von Nanopartikel-Pellets nach Zentrifugation während Waschschritte, oder nachdem die Nanopartikel für länger als eine Stunde gespeichert wurden. Beschallung durchgeführt werden, bis die Nanopartikel deutlich in die Lösung, in der Regel für 1 suspendiert sind s.

  1. Im Schlauch A (ein 50 mL konische Rohr), 10 mL Isopropanol, 500 µL von TEOS, 200 µL VE-Wasser, und 60 µL Farbstoff (IR780 Perchlorat oder IR140, 20 mM im DMF (Dimethylformamid)) zu mischen.
  2. Mischen Sie in Rohr B (15 mL konische Rohr) 3 mL Ethanol und 200 µL Ammonium Hydroxid. Beschallen Sie die Nanostars aus Schritt 1.4 zu jedem Cluster in Lösung zu zerstreuen und 1,2 mL Nanostars am Rohr.
    Hinweis: Ammonium Hydroxid Lösung ist sehr flüchtig und schwer, präzise pipette. Bewahren Sie es bei 4 ° C, bis benötigt Pipettieren zu erleichtern.
  3. Schlauch A auf einem Vortex-Mixer und induzieren Sie einen stetigen Wirbel. Schnell den Inhalt der Tube B in den Strudel und halten Sie mischen für ca. 5 s. Sofortüberweisung ein Shaker und lassen Sie reagieren für 15 min unter Schütteln bei 300 u/min bei Raumtemperatur.
  4. Stillen Sie nach 15 min Inkubation die Reaktion durch Zugabe von Ethanol um die 50 mL-Tube zu füllen. Zentrifuge für 20 min bei 3.220 x g und 4 ° C.
  5. Aspirieren Sie den Überstand, so dass ca. 0,5 mL der Lösung, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Pellet. Fügen Sie 1 mL Ethanol und schütteln mit einer Pipette, die Nanopartikel aufzuwirbeln. Übertragen auf ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und waschen Sie 4 Mal mit Ethanol von 11.000 x g für 4 min Zentrifugieren, überstand Absaugen und resuspending der Pellets durch Ultraschall für ca. 1 s.
    Hinweis: In diesem Stadium können die silicated Nanopartikel funktionalisiert, wie in Abschnitt 3 beschrieben oder Nukleinsäuretablette in VE-Wasser mit einer zusätzlichen Waschschritt zur Lagerung bei 4 ° C bis zu einer Woche.

3. Oberfläche Funktionalisierung

Hinweis: IR780 SERRS Nanosonden werden mit Folsäure Rezeptor-targeting Antikörper über eine PEG-Vernetzer in Form αFR-NPs konjugiert werden; IR140 SERRS Kontrolle Nanosonden werden mit eine passivierende PEG Monolage für nt-NPs konjugiert werden. Beide Varianten werden durch ein Thiol-Maleimide Reaktion in getrennte, aber parallel Reaktionen gebildet.

  1. Waschen Sie Nanopartikel zweimal von 11.000 x g für 4 min Zentrifugieren, überstand Absaugen und resuspending das Pellet in 1 mL Ethanol durch Ultraschall. Die Waschschritt noch einmal zu wiederholen, aber redisperse in 1 mL aus 85 % Ethanol, 10 % 3-MPTMS (3-Mercaptopropyltrimethoxysilane) und 5 % DI-Wasser. Inkubation bei Raumtemperatur für ca. 1-2 h, Thiole, an der Partikeloberfläche einzuführen.
  2. Waschen Sie die Thiol-funktionalisiert Nanopartikel von 11.000 x g für 4 min Zentrifugieren, überstand Absaugen und resuspending der Pellets durch Ultraschall, zweimal in Ethanol, zweimal in DI, und schließlich in HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure) (10 mM, pH 7.1) zu puffern, und beiseite stellen.
    Hinweis: MES (2-(N- Morpholino) Ethanesulfonic Säure) Puffer oder HEPES eingesetzt werden. Puffer mit höheren Salzgehalt, wie PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), können Nanopartikel Aggregation auslösen.
  3. Reagieren Sie für die Antikörper funktionalisiert αFR-NPs 200 µg von Antikörpern (Anti-Folat bindende Protein Antikörper Klon [LK26]) mit zehnfach Molaren Überschuss an PEG Vernetzer (Poly(ethylene glycol) (N-Hydroxysuccinimide 5-Pentanoate) Äther N′-(3- Maleimidopropionyl) Aminoethane (CAS: 851040-94-3), in Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) in 500 µL MES-Puffer (10 mM, pH 7,1) für 30 Minuten.
  4. Entfernen Sie überschüssige Vernetzer und konzentrieren Sie Antikörper durch Zentrifugieren die Antikörper-PEG-Lösung in einem zentrifugalen Filter (MWCO 100 kDa) zu. Führen Sie für die zentrifugale Filter in dieser Studie verwendet Zentrifugation für 10 min bei 14.000 X g und 23 ° C. Wiederherstellen Sie die konjugierten Antikörper in einem frischen Rohr durch Umkehrung des Filters und 1.000 x g für 2 min zentrifugieren.
  5. Pipette IR780 Nanopartikel aus Schritt 3.2 in das Rohr mit den Antikörpern und schütteln mit der Pipette zu mischen. Inkubieren Sie die Mischung für mindestens 30 min bei Raumtemperatur, oder alternativ bei 4 ° C über Nacht in Form der αFR-NPs.
  6. Nt-NPs bilden, fügen Sie 1 % w/V Methoxy-beendet (m) PEG5000-Maleimide (CAS: 99126-64-4), die IR140 SERRS Nanopartikel aus Schritt 3.2 und lassen Sie reagieren in 500 µL MES-Puffer (10 mM, pH 7,1) für mindestens 30 min bei Raumtemperatur in DMSO gelöst oder alternativ bei 4 ° C übernacht.
  7. Zur Verabreichung an Mäusen (Abschnitt 5), Spin-down beide Nanoprobe Aromen bei 11.000 X g für 4 min, Aspirieren des Überstands entfernen Lösung mit kostenlosen nicht umgesetztes Antikörper/PEG und redisperse jeden Geschmack in MES-Puffer (10 mM, pH 7,1) bei 600 pM-Konzentration . Wenn die Nanopartikel resuspending, um zu minimieren unnötige Ultraschall, Denaturierung des Antikörpers zu verhindern.

(4) Maus-Modell-Entwicklung

  1. Etablieren Sie eine stetige Kultur der menschlichen Eierstock Adenokarzinom (SKOV-3) Zelllinie. Optional, um Kontrolle über Biolumineszenz/Fluoreszenz zu ermöglichen, verwenden Sie transfizierten Zellen SKOV-3 Luc+/GFP+ . Zellkulturen in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium mit 10 % fetalen Kälberserum und Passage zweimal in der Woche. Inkubieren Sie für die Injektion Zellen mit 0,25 % trypsin/0.05% EDTA für 3 min zu trennen, und anschließend waschen mit PBS-Puffer bei 2 x 106 Zellen/100 µL aufzuwirbeln.
  2. Um die Eierstöcke Micrometastasis Modell zu etablieren, 200 µL abgehängte SKOV-3 Zellen intraperitoneal in Athymic weiblichen Mäusen (FOXn1nu/FOXn1nu Mäuse, 6-8 Wochen alt) zu injizieren. Disseminierter peritoneale Ausbreitung erfolgt in ca. 4 Wochen. Wenn SKOV-3 Luc+ Zellen verwenden, kann durch die Gabe von 2 mg der Käfer Luciferin in 50 µL PBS über Retroorbital Injektion Tumorwachstum mit Biolumineszenz überwacht werden.

5. Nanoprobe Injektion und Bildgebung

  1. Bereiten Sie Nanosonden (αFR-NPs und nt-NPs), wie in den Abschnitten 1 bis 3 und Mischung im Verhältnis 1:1, für eine Endkonzentration von 300 beschrieben pM jeder Art in MES-Puffer (10 mM, pH 7,1). Optional, bereiten Referenzstandards von 30 Uhr aller Nanoprobe Aromen in konischen Röhrchen (100 µL).
  2. Injizieren Sie intraperitoneal 1 mL der Suspension Nanopartikel in jeder Maus zu und massieren Sie den Bauch um die Nanopartikel in der Bauchhöhle zu verteilen. Das Gehäuse die Maus zurückzukehren. Nach 25 oder mehr Minuten einschläfern Sie die Maus über CO2 ersticken.
  3. Befestigen Sie die Maus auf eine chirurgische Plattform, in der Rückenlage (für ganze Bauch imaging, die Plattform muss auf die aufrechte Mikroskoptisch montierbar).
    1. Mit gezackten Zange und Schere Dissektion, entfernen Sie die Haut um das Peritoneum aufzudecken und einen großen sagittalen Schnitt (zwischen 2 und 3 cm lang) durchführen, um den ganzen Bauch aussetzen. Befestigen Sie die Peritonealdialyse Klappen auf die Plattform. Waschen Sie das Innere der Bauchhöhle mit mindestens 60 mL PBS mit einem Kunststoff-Spritzflasche.
      Hinweis: Um freie Bildgebung des gesamten Abdomens zu aktivieren, müssen den Darm mobilisiert oder herausgeschnitten werden. Resezieren Sie für die Exzision mit einer Ligatur der mesenterialen Gefäße um Blutungen in die Bauchhöhle zu reduzieren.
    2. Alternativ Bild bestimmte Organe, schneiden sie nach dem PBS waschen und legen Sie sie auf einen Objektträger.
  4. Übertragen Sie die Plattform oder die Folie auf einem Raman Microspectrophotometer mit aufrechten optische Konfiguration und einer motorisierten Bühne für die Bildgebung; Verwenden Sie ein kommerzielles System mit einem 300 mW 785 nm Diodenlaser, mit einem Gitter von 1.200 Nuten pro mm, zentriert auf 1.115 cm-1.
    1. Konzentrieren Sie sich auf den Bereich von Interesse, die mit weißem Licht Optik, parfokal mit der Raman-Laser. Wählen Sie den Bereich abgebildet werden und die gewünschte Auflösung; in diesem Bericht wurde eine High-Speed-Akquisitionsmodus verwendet (Spektren unter kontinuierlicher Laser Beleuchtung mit den Mikroskoptisch, ständig in Bewegung, mit effektiven räumlichen Auflösung 14,2 µm von 200 µm; am 5 X Vergrößerung 100 mW Leistung am Ziel, erworben und < 100 ms Exposition pro Punkt).
      Hinweis: Die Rohre mit der Referenz-Nanosonden aus Schritt 5.1 können innerhalb des abgebildeten Bereichs ggf. interne Referenz-Standards für die nachfolgende Analyse bieten platziert werden. Stellen Sie sicher, dass keine fremden Lichtquellen außer der Laser das Ziel zu erreichen.
  5. Optional, bereiten Sie die Probe zur histologischen Verarbeitung und Validierung durch Fixierung in 4 % Paraformaldehyd in PBS über Nacht bei 4 ° c Spülen Sie mit PBS bei 4 ° C für 15 min mindestens zweimal. Bewahren Sie die Probe in 70 % igem Ethanol in Wasser bis standard histologischen Verarbeitung und Paraffin einbetten. Zur histologischen Überprüfung der Tumoren können Abschnitte (5 µm dick) aus verschiedenen Tiefen der Paraffinblock mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt werden.

6. Datenverarbeitung und Visualisierung

Hinweis: Alle Datenverarbeitung wurde mit einer grafischen Benutzeroberfläche selbst entwickelte mit Hilfe kommerziellen Software durchgeführt. Alle benutzten Funktionen haben generische Äquivalente in anderen computing-Umgebungen zur Verfügung.

  1. Erhalten Sie Referenz-Spektren für die beiden Geschmacksrichtungen durch reine Aufhängungen der einzelnen Abfragen. Die Referenz-Spektren können Punkt Scans von der Nanosonden abgeleitet werden imaging von Nanosonden in Well-Platten, oder interne Verweise in die experimentelle Scans in den Referenz-Röhren (siehe Schritt 5.1).
  2. Vorverarbeitung der Referenz-Spektren mit Grundlinie Subtraktion (Whittaker Filter, λ = 200), Normalisierung durch die Fläche unter der Kurve und Derivative Savitzky-Golay Filter (zweiten Grades Polynom fit, erster Ordnung Ableitung, Breite = 15 Schritte). Diese vorverarbeiteten Spektren dienen als Referenz für das klassische kleinste Quadrate (CLS) Modell.
  3. Vorverarbeitung der Beispieldaten aus dem Bild in die gleiche Weise wie die Referenz-Spektren. CLS-Punkte für jeden Punkt der Probe durch mithilfe eines verfügbaren CLS-Algorithmus zu erhalten. Die direkte CLS (DCLS) Noten sind einfach die Koordinaten der Projektion des Probenspektrum auf der linearen Raum definiert durch verallgemeinerte inverse Matrix (Moore-Penrose-Inverse) die Referenz-Spektren. Anderen Anschluss werden Algorithmen verwendet (nichtnegative kleinsten Quadrate, partielle kleinste Quadrate oder andere).
    Hinweis: Einige passende Algorithmen können negative Resultate ergeben, die in diesem Zusammenhang nicht körperlich sind. Dies ist der Fall, eine Schwelle auf negative Ergebnisse ausschließen festgelegt werden, ob ein eingeschränkte nichtnegative kleinsten Quadrate Algorithmus werden stattdessen beschäftigt.
  4. Berechnen Sie die punktweise Verhältnis der Werte auf die Referenz für die gezielte Nanopartikel (αFRPunkte) über die Noten auf die Referenz für die ungezielte Nanopartikel (Partiturennt). Wenn die Werte negativ sind, kann das Verhältnis in einer logarithmischen Weise ausgedrückt werden:
    R = Log10(αFRNoten / Partiturennt).
    Das Verhältnis R wird am besten in eine divergierende Farbskala auf Null, um die relative Häufigkeit der Sonden in Größenordnungen auszudrücken zentriert angezeigt. Das resultierende Bild kann auf das weiße Licht Bild der Probe, Bereiche von Folat Rezeptor Überexpression offenbaren überlagert werden.

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Ergebnisse

Zur Qualitätskontrolle kann die Nanopartikel charakterisiert werden, mit einer Vielzahl von Methoden bei der Synthese, einschließlich TEM, DLS, Nanopartikel Tracking Analyse und UV/Vis Absorption Spektroskopie, wie in Abbildung 2dargestellt.

Auf diese Weise können die Größe des Kerns gold Nanostar (beschrieben in Abschnitt 1), die Bildung von Kieselsäure Schale (Abschnitt 2) und anschließende Oberfl...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet Unterricht für die Synthese von zwei "Varianten" von SERRS Nanosonden und ihre Beschäftigung bei Mäusen für Raman imaging ovarian Tumors überexprimierenden Folat-Rezeptor, mit einem ratiometrischen Algorithmus. Der wesentliche Vorteil der Raman imaging über andere optische bildgebenden Verfahren (z. B. Fluoreszenz) ist der hohen Spezifität der Nanoprobe Signal, das mit keine Signale biologischen Ursprungs verwechselt werden kann nicht. Bei dieser Ausführungsform der Raman imaging si...

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Offenlegungen

• M.F.K. wird als ein Erfinder auf mehreren ausgestellt oder Patentanmeldungen im Zusammenhang mit dieser Arbeit aufgeführt. M.F.K. ist ein Mitbegründer des RIO Imaging, Inc., die darauf abzielt, SERRS Nanopartikel in den Kliniken zu übersetzen.

• Die Autoren erklären, dass sie keine anderen konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die folgenden Finanzierungsquellen (zu M.F.K.) sind anerkannt: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 und K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, Pershing Square Sohn Preis durch die Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance und MSKCC-Mitte für molekulare Bildgebung & Nanotechnologie (CMINT) und Technologieentwicklung gewährt. Bestätigungen sind auch die Zuschüsse Unterstützung durch die MSKCC NIH Core Grant (P30-CA008748) erweitert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes
AscorbinsäureSigma-AldrichA5960
3-MPTMSSigma-Aldrich175617
Ammoniumhydroxid (28%)Sigma-Aldrich338818
Anti-Folatrezeptor-Antikörper [LK26] AbCamab3361
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich276855
Dimethylsulfoxid (wasserfrei)Sigma-Aldrich276855
EthanolSigma-Aldrich792780
IR140Sigma-Aldrich260932
IR780 Perchlorat*Sigma-Aldrich576409eingestellt*
IsopropanolSigma-Aldrich650447
N.N.DimethylformamidSigma-Aldrich227056
PEG-VernetzerSigma-Aldrich757853
PEG-MaleimidSigma-Aldrich900339
TetrachloraurensäureSigma-Aldrich244597
TetraethylorthosilikatSigma-Aldrich86578
*IR792Sigma-Aldrich425982*Alternative
Name des Geräts
Dialysekassette (3.500 MWCO)ThermoFIsher87724
ZentrifugalfilterMilliporeUFC510096
inVia konfokales Raman-MikroskopRenishaw
MATLAB (v2014b)Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)Eigenvektor-Forschung

Referenzen

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