Methodenartikel

Automatisierte Multiplex Immunfluoreszenz Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf Formalin fixiert Karzinom Gewebeproben

DOI:

10.3791/58390

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21. Januar 2019

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1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.

Zusammenfassung

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Weiterentwicklungen in der Immuno-Onkologie erfordert ein besseres Verständnis der Mechanismen der Krebsimmunologie. Die Immunoprofiling Analyse von Gewebeproben aus Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsien ist ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Komplexität der Tumorimmunologie und entdecken neue Prädiktive Biomarker für Krebsimmuntherapie geworden. Immunoprofiling Analyse der Gewebe erfordert die Beurteilung von kombinierten Markierungen, einschließlich der entzündlichen Zelle Subpopulationen und immun Checkpoints in den Tumor Mikroumgebung. Das Aufkommen der neuen multiplex immunhistochemischen Methoden ermöglicht eine effizientere multiparametric Analyse der einzelnen Gewebeschnitte als standard Monoplex Immunhistochemie (IHC) tut. Eine handelsübliche multiplex Immunfluoreszenz ermöglicht (IF) Methode basiert auf Tyramide-Signalverstärkung und kombiniert mit multispektralen mikroskopische Analyse eine bessere Signaltrennung der verschiedenen Markierungen im Gewebe. Diese Methodik ist kompatibel mit dem Einsatz von unconjugated primäre Antikörper, die für standard IHC an FFPE Gewebeproben optimiert wurden. Hierin beschreiben wir ausführlich eine automatisierte Protokoll, das Multiplex-ermöglicht wenn Kennzeichnung von Karzinom Gewebeproben mit einem sechs-Marker Multiplex-Antikörper-Panel bestehend aus PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 und AE1/AE3 Cytokeratin mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole als eine atomare Zelle Gegenfärbung. Das Multiplex-Panel-Protokoll ist in einem automatisierten IHC Stainer Färbung Zeit optimiert, die ist kürzer als die des manuellen Protokolls direkt angewendet und werden von jedem Labor Investigator für Immuno-Onkologie-Studien an menschlichen Gewebeproben der Proteinkinase angepasst. Ebenfalls beschrieben sind mehrere Steuerelemente und Werkzeuge, einschließlich Drop Steuerungsmethode für feine Qualitätskontrolle eines neuen Multiplex-IF-Panels, die nützlich für die Optimierung und Validierung der Technik sind.

Einleitung

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Immunoprofiling Analyse von Gewebeproben FFPE Tumor ist ein wesentlicher Bestandteil der Immuno-Onkologie-Studien, insbesondere für die Entdeckung und Validierung der neue Prädiktive Biomarker für Krebsimmuntherapie im Rahmen von klinischen Studien1 geworden. ,2. Chromogene IHC mit chemischen Chromogens wie Diaminobenzidine, bleibt die Standardtechnik in der diagnostischen Pathologie für die Immunolabeling der Biopsie Gewebe3. Standard IHC einsetzbar auch für Krebs-Gewebe-Immunoprofiling, einschließlich die Quantifizierung der Subpopulationen von Tumor-assoziierten Lymphozyten und die ....

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Protokoll

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Hinweis: Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt das Immunoprofiling eines mIF-Panels mit TSA für sechs Antikörper durchführen (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 und AE1/AE3) auf eine automatisierte Stainer (siehe Tabelle der Materialien). Das Protokoll beschreibt auch die Drop Steuerelemente für eine Qualitätskontrolle der ein neues Panel mIF durchführen (siehe Ergänzende Materialien). In diesem Protokoll wird die Färbung mit acht ungefärbten FFPE-Folien aus menschlichen Tonsillen (Positivkontrolle) und acht ungefärbte Folien aus menschlichen Lunge Adenokarzinom durchgeführt. Die erste Folie ist für volle Multiplex Fä....

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Ergebnisse

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Das hier beschriebene Protokoll liefern Ergebnisse wie in Abbildung 2gezeigt. Beginnen Sie mit einer Bewertung der Färbung in der Tonsillen-Steuerung, beginnend mit der Oberfläche Plattenepithelkarzinome Epithel. Die Histologie der Tonsillen Probe findest du mit einem Pathologen, die H & E Folie als Referenz verwenden. Wenn chromogene IHC Abschnitte mit den gleichen Markierungen auf dem gleichen Gewebe-Block ausgeführt werden, können diese verwendet werde.......

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Diskussion

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Die laufenden Krebs-Immuntherapie-Revolution ist Eröffnung Roman und vielversprechende Therapieoptionen für Krebs-Patienten-13. Fortschritte auf dem Gebiet der Immuno-Onkologie erfordert mehr wissen von der entzündlichen Tumor Mikroumgebung, nicht nur, die Biologie der Karzinogenese immunologische Mechanismen zu verstehen, sondern auch für neue Prädiktive Biomarker zu finden Immuntherapie-Behandlungen1,2. Aufgrund der komplexen Biologie de.......

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Offenlegungen

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Diese Arbeit wurde von MedImmune, die globale Biologics R & D Arm von AstraZeneca unterstützt. C.w., k.r. und C.C.H. sind Mitarbeiter von Perkin Elmer, die Reagenzien (TSA Kit) produziert und multispektralen Scannern, die in dieser Arbeit verwendet wurden. M.s., k.d., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Braun, j.c., A.L., k.s., m.r., und J.R.C. sind Mitarbeiter von MedImmune mit Aktienbesitz und/oder Lager Interessen oder Optionen in AstraZeneca.

Danksagungen

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Redaktionelle Betreuung wurde von Deborah Shuman von MedImmune bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
"InForm 2.4.2" Software für spektrale Entmischung und BildanalysePerkinElmerCLS151066im Text "Spectral Unmixing Software" genannt
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software zur Auswahl von MSI und Gesamtbetrachtung von DiascansPerkinElmerCLS151067in text
#1.5 DeckgläserSigma Aldrich2975246genannt
200 Proof EthanolKoptecV1001
20x Tris-gepufferte KochsalzlösungVWRJ640-4L
AntikörperverdünnungsmittelDAKOS2203
Anti-CD68 Maus MonoklonalDAKOM087601-2Klon PG-M1
Anti-CD8 Kaninchen MonoklonalVentanaM5392Klon SP239
Anti-CK Maus MonoklonalDAKOM351501-2Klon AE1/AE3
Anti-ki67 Maus MonoklonalDAKOM724001-2Klon MIB-1
Anti-PD-1 Kaninchen MonoklonaleZellsignalisierung#86163Klon D4W2J
Anti-PD-L1 Kaninchen MonoklonalVentana790-4905Klon SP263
Bond Dewax LösungLeicaAR9222Im Text als "Entwachslösung" bezeichnet
Bond Epitope Retrieval Solution 1LeicaAR9961Im Text "ER1" genannt
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640Im Text "ER2" genannt
Bond Open Containers, 30 mLLeicaOP309700Im Text "30 mL open containers" genannt
Bond Open Containers, 7 mLLeicaOP79193Called "7 mL open containers" im Text
Bond Polymer Refine DetectionLeicaDS9800Im Text "chromogenes Detektionskit" genannt
Bond Research Detection KitLeicaDS9455Im Text "research detection kit" genannt
Bond Titration KitLeicaOPT9049Im Text "Titration Kit" genannt
Bond Universal Covertile NovocastraLeicaS21.2001Im Text "Covertiles" genannt
Bond Wash Solution 10X ConcentrateLeicaAR9590Im Text "10x Waschlösung" genannt
BondRX AutostainerLeicaIm Text "automatisierter Färber" genannt
BondRX Software Version 5.2.1.204LeicaIm Text "automatisierte Färbesoftware" genannt
Opal 7-Color Automation IHC KitPerkinElmerNEL801001KTim Text "multispectral staining kit" genannt
Peroxidase BlockLeicaRE7101
ProLong Diamond Antifade EindeckmittelThermoP36965Im Text "slide mountant" genannt
Starfrost SlidesFisher15-183-51
Vectra Polaris Multispektralmikroskop mit "Vectra 3.0.5" Software zur Steuerung von MultispektralmikroskopenPerkinElmerCLS143455im Text "Mikroskopsteuerungssoftware" genannt

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications....

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Schlagwörter

FFPE Gewebeprobenautomatisches IHC F rbeger tTyramidsignalverst rkungmultispektrale MikroskopiePD L1 PD 1 CD68 CD8 Ki 67 AE1 AE3TropfenkontrollmethodeSoftware zur spektralen Entmischungmultispektrale Bildgebungsplattform

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