Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Summary

Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).

Abstract

Chloroplasten sind die Organellen in grünen Pflanzen verantwortlich für zahlreiche wichtige Stoffwechselwege, die vor allem Photosynthese. Innerhalb der Chloroplasten der Thylakoidmembran-Membran-System beherbergt die photosynthetische Pigmente, Reaktion-Zentrum-komplexe und die meisten der Elektron-Träger, und ist verantwortlich für Licht-abhängige ATP-Synthese. Über 90 % der Chloroplasten Proteine sind im Zellkern codiert, übersetzt in die Zellflüssigkeit und anschließend in die Chloroplasten importiert. Protein-Weitertransport in oder über der Thylakoidmembran Membran nutzt eine der vier Translokation Wege. Hier beschreiben wir eine hochverzinsliche Methode zur Isolierung von Transport-kompetente Thylakoids aus Erbsen (Pisum Sativum), zusammen mit Transport-Assays durch drei Energie-abhängige CpTat, cpSec1 und CpSRP-vermittelten Signalwege. Diese Methoden ermöglichen Experimente bezüglich Thylakoidmembran Protein Lokalisierung, Transport-Energetik und die Mechanismen der Protein Translokation über biologische Membranen.

Introduction

Fast alle die proteinhaltige Maschinen verantwortlich für die ordnungsgemäße Chloroplasten Funktion muss aus dem Zytosol¹umgesiedelt werden. Die Chloroplasten-Umschläge sind Protein Substrate durch das Translocon der äußeren Membran (TOC) und die Translocon der inneren Membran (TIC)²eingeführt. Weitere Ausrichtung auf die Thylakoidmembran erfolgt Membran und Lumen durch Twin Arginin Translokation (CpTat)³, die sekretorischen (cpSec1)⁴, Signal Anerkennung Teilchen (CpSRP)⁵, und die spontane Aufnahme Wege⁶ . Eine Methode für die....

Protocol

1. erste Materialien

1. Ca. 55 g Erbsen für 3 Stunden in 400 mL destilliertem Wasser einweichen und dann säen in einem Plastikbehälter (35 cm x 20 cm x 6 cm) im Boden mit dünnen Schicht von Vermiculit bedeckt.
2. Wachsen Sie das Tablett mit Erbsen bei 20 ° C unter 12/12 h hell/dunkel (50 µE/m²s)-Zyklus für 9 bis 15 Tage.
3. Bereiten Sie Protein Substrat nach eine bevorzugte Methode.
   Hinweis: Haben wir Protein Substrate mit einer Vielzahl von Methoden, einschließlich 1) in-vitro- Transkription von gereinigte Plasmide gefolgt von Übersetzung mit WEIZENKEIM-Extrakte oder Kaninchen Retikulozytenzahl Lysates in Gegenwart von [

Results

Um erfolgreich transportiert Substratmenge einschätzen zu können, ist es sinnvoll, einen oder mehrere "prozentuale Eingabe" Bahnen gehören. Für die unten dargestellten Daten wurde 10 % des endgültigen Transportreaktion ohne Thylakoids verwendet. Diese "prozentuale Eingabe" hilft auch, um die Größe des Substrats Vorläufer zu visualisieren. Der Prozentsatz ist eine bekannte und definierte Menge an Substrat mit denen zu vergleichen, die transportiert Substrat gegen und kann skaliert werden o.......

Discussion

Chloroplasten und Thylakoidmembran isolation

Übermäßiger Bruch führt in armen Chloroplasten Isolierung und damit schlechte Thylakoidmembran nach Trennung im Verlauf ergeben. Es empfiehlt sich, die geerntete Gewebe sanft zu homogenisieren, indem sichergestellt wird, dass sämtliches Material eingetaucht ist, vor dem Mischen und pulsieren in 15 s Zyklen bis vollständig homogenisiert. Verwenden Sie ggf. mehrere kürzere Runden mit weniger Gewebe in jeder Runde.

Kühl-alle Ma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pisum sativum seeds	Seedway LLC, Hall, NY	8686 - Little Marvel
Miracloth	Calbiochem, Gibbstown, NJ	475855-1
80% Aceton	Sigma, Saint Louis, MO	67-64-1
Mixer mit geschärften Klingen	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma, Saint Louis, MO	GE17-0891-01
Beckman J2-MC mit JA 20 Rotor	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B mit HB-4 Rotor	Sorvall	8327-30-1016
100 mM Dithiothreitol (DTT) in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	12/3/83	Kann in Aliquoten für die zukünftige Verwendung eingefroren werden
200 mM MgATP in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	74804-12-9	Kann für die zukünftige Verwendung in Aliquoten eingefroren werden
Thermolysin in 1xIB (2mg/ml)	Sigma, Saint Louis, MO	9073-78-3	Kann für die zukünftige Verwendung in Aliquoten eingefroren werden
HEPES	Sigma, Saint Louis, MO	H3375
K-Tricine	Sigma, Saint Louis, MO	T0377
Sorbit	Sigma, Saint Louis, MO	50-70-4
Magnesiumchlorid	Sigma, Saint Louis, MO	7791-18-6
Manganchlorid	Sigma, Saint Louis, MO	13446-34-9
EDTA	Sigma, Saint Louis, MO	60-00-4
BSA	Sigma, Saint Louis, MO	9048-46-8
Tris	Sigma, Saint Louis, MO	77-86-1
SDS	Sigma, Saint Louis, MO	151-21-3
Glycerol	Sigma, Saint Louis, MO	56-81-5
Bromophenol Blue	Sigma, Saint Louis, MO	115-39-9
B-Mercaptoethanol	Sigma, Saint Louis, MO	60-24-2