Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell qualitativ hochwertige Kerne aus dem frischen oder gefrorenen Gewebe für die nachgelagerten massiv parallelen RNA Sequenzierung zu isolieren. Wir enthalten Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Gewebe Störung und Zelle Lyse Optionen, die für die Isolierung von Kernen verwendet werden können.
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Methodenartikel
Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine einzelne Zelle Genexpression sondieren ermöglicht die Identifizierung von Zelltyp und Zellstatus. Einzelne Zelle RNA Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium transcriptional Profile der Zellen, vor allem in heterogenen Geweben wie das zentrale Nervensystem entstanden. Dissoziation-Methoden, die für die einzelne Zelle Sequenzierung erforderlich können jedoch auf experimentelle Veränderungen in der Gen-Ausdruck und Zelle Tod führen. Darüber hinaus sind diese Methoden in der Regel auf frischem Gewebe, wodurch Studien zur Archivierung und Bio-Bank Material beschränkt. Einzigen Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist eine attraktive Alternative für transkriptionelle Studien, da es genau identifiziert Zelltypen, erlaubt die Untersuchung von Gewebe, das gefrorene oder schwer zu distanzieren, und reduziert die Dissoziation-induzierte die Transkription. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Protokoll für schnelle Lokalisierung der Kerne für nachgeschaltete SnRNA-Seq. Diese Methode ermöglicht die Trennung der Kerne von frischen oder gefrorenen Rückenmark Proben und kann mit zwei parallelen Tröpfchen Kapselung Plattformen kombiniert werden.
Einleitung
Das Nervensystem besteht aus heterogenen Gruppen von Zellen, in denen vielfältige morphologische, Biochemische und elektrophysiologische Eigenschaften angezeigt. Während die Masse RNA Sequenzierung nützlich für die Bestimmung der Gewebe-Änderungen in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen wurde, schließt es die Erkennung von transcriptional Änderungen auf der Ebene der einzelnen Zelle. Jüngste Fortschritte in der einzelligen transkriptionelle Analyse konnten die Einteilung der heterogenen Zellen in funktionellen Gruppen anhand ihrer molekularen Repertoire und können auch genutzt werden, um Gruppen von Neuronen zu erkennen, die vor kurzem aktiv gewesen.
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Protokoll
Alle tierische Arbeit wurde nach einem Protokoll genehmigt von der National Institute of Neurological Disorders and Stroke Animal Care und Use Committee durchgeführt. Ausgewogene Proben von männlichen und weiblichen ICR/CD-1 Wildtyp Mäusen, zwischen 8 und 12 Wochen alt, wurden für alle Experimente verwendet. Mäuse sollten in Übereinstimmung mit lokalen institutionellen Animal Care und Use Committee Richtlinien behandelt werden.
1. Vorbereitung von Materialien und Puffer
- Bereiten Sie alle Puffer Tag der Nutzung und Pre-chill auf Eis (siehe Tabelle 1).
- Wenn Reinigungsmittel-mechanische Lyse, bereiten Sie Was....
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Ergebnisse
Hier haben wir Isolierung der Kerne aus dem Erwachsenen Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark für nachgeschaltete massiv parallelen RNA Sequenzierung durchgeführt. Das Protokoll beteiligten drei Hauptkomponenten: Gewebe Störungen und zellulären Lyse, Homogenisierung und Saccharose Dichte Zentrifugation (Abbildung 1). Innerhalb von Sekunden ergab die Waschmittel-mechanische Lyse eine grobe Kerne Vorbereitung mit einer großen Anzahl von Kernen sowie Mobilfunk und G.......
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Diskussion
Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist, Kerne mit qualitativ hochwertigen RNA für die nachgelagerten transkriptionelle Analyse zu isolieren. Wir angepasst SnRNA-Seq Methoden um alle Zelltypen im Rückenmark zu profilieren. Zunächst fanden wir, dass typische Zelle Dissoziation Methoden für einzelne Zelle RNA Sequenzierung, unwirksam waren, wie Rückenmark Neuronen Absterben von Zellen besonders anfällig sind. Darüber hinaus verursachen Zelle Dissoziation Methoden Ausdruck der verschiedenen Aktivitäten und Stressantwort G.......
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Offenlegungen
Wir haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das intramurale Programm der NINDS (1 ZIA NS003153 02) und NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wir danken L. Li und CI Dobrott für ihre technische Unterstützung und hilfreichen Diskussionen und C. Käthe für die Überprüfung der Handschrift.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Saccharose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8,0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0,5 M EDTA (pH = 8,0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Unmittelbar vor der Verwendung DTT hinzufügen |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nukleasefreies Wasser | Kristallgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7,4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Kristallgen | 221-133-10 | |
| 0,04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0,2 U/ μ L RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Zentrifugenröhrchen | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Einweg-Pasteur-Pipeten aus Borosilikatglas mit Baumwollstopfen | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glasgewebe Dounce (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Glas Stößel mit großem Abstand | Kimble | 885301-0002 | |
| Glasstößel mit kleinem Abstand | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenisator | IKA | 3737001 | |
| Dispergierwerkzeug (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypanblauer Fleck (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μ m Zellensieb | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μ m | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Konische Röhrchen | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Zentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Festwinkelrotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterologische Pipetten: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Hämozytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Dekontaminationslösung | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Reagenzglas mit Zellsiebkappe (35 μ m) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Zellsortierer | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chrom Einzelzelle 3' Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chrom Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
Referenzen
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
