Überwachung von Hippo Signalisierung Pathway-Aktivität unter Verwendung eines Biosensors Luciferase-basierte großen Tumorsuppressor (LATS)

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Luciferase-basierten Biosensor zur Quantifizierung der Kinase-Aktivität von großen Tumorsuppressor (LATS)-einer zentralen Kinase in den Signalweg Hippo. Diese Biosensor hat vielfältige Anwendungen in Grundlagen- und Translationale Forschung zur Hippo Weg Regulierungsbehörden in Vitro und in Vivozu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Nilpferd Signalweg ist eine konservierte Regulator der Orgel Größe und hat eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Krebs Biologie. Aufgrund der technischen Herausforderungen bleibt es schwierig zu beurteilen, die Aktivität dieser Signalweg und in einem biologischen Kontext zu interpretieren. Die vorhandene Literatur zu großen Tumorsuppressor (LATS) stützt sich auf Methoden, die qualitative und können nicht leicht werden skaliert-Up für das Screening. Vor kurzem, entwickelten wir eine Biolumineszenz-basierten Biosensor um die Kinase-Aktivität des LATS-ein zentraler Bestandteil der Hippo-Kinase-Kaskade zu überwachen. Hier beschreiben wir Verfahren für die Verwendung von diesem Biosensor LATS (LVL-BS) Hippo Weg Regulierungsbehörden zu charakterisieren. Erstens bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der Wirkung eines Protein überexprimieren Kandidaten (z.B.VEGFR2) auf LATS-Aktivität unter Verwendung der LATS-BS. Dann zeigen wir, wie die LATS-BS für einen kleine Kinase-Inhibitor-Bildschirm verwendet werden kann. Dieses Protokoll kann durchaus realistisch skaliert bis zu größere Bildschirmen, durchführen, die zweifellos neuartige Regulatoren des Hippo-Signalwegs identifiziert werden.

Einleitung

Das Nilpferd Signaltechnik Weg zuerst in Drosophila als ein neuartiger Regulator von Zellwachstum und Tiergröße^1,2identifiziert wurde. Seit seiner ersten Entdeckung Montage Beweise hat überzeugend nachgewiesen, dass die Hippo-Weg entscheidende Rolle spielt bei der Entwicklung (z.B.frühe embryonale Entwicklung, Orgel Größe Kontrolle und dreidimensionale [3D] Morphologie), Tumorgenese () z.B., Tumorentstehung, Metastasen, Angiogenese, immun ausweichen, genomische Instabilität, Stressantwort und Resistenzen), und Gewebe Homöostase (z.B., Stammzellen Erneuerung und Differenzieru....

Protokoll

1. Untersuchung eines vermeintlichen Regulators der Hippo-Signal mit der LATS-BS

1. Beschichtung und Transfektion von Zellen
   1. Vorbereitung der Zellkultur
      1. 1 X PBS, DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,25 % Trypsin-EDTA auf 37 ° C in einem Wasserbad für ca. 30 min. warm.
      2. Reinigen Sie gründlich einen Biosafety-Schrank mit 70 % Ethanol.
      3. Platzieren Sie Gewebekultur Gerichte, Pasteur-Pipetten, serologische Pipetten und Pipettenspitzen in der Gewebekultur Haube nach Bedarf.
      4. 1 x PBS, die Medien und die Trypsin-EDTA aus dem Wasserbad herausnehmen Sie, reinigen Sie sie mit 70 % Etha....

Ergebnisse

Der LATS-BS war cotransfected mit verschiedenen Genen, deren Wirkung auf die LATS Aktivität (Abbildung 3) zu bewerten. In diesem Experiment wurde Renilla als interne Kontrolle verwendet. Die transiente Expression von YAP-5SA, ein konstitutiv aktive Form von YAP, Ursachen, die Erhöhung von YAP transkriptionelle Ziele und eine nachträgliche Erhöhung in LATS-Kinase-Aktivität durch einen etablierten Feedback Weg²⁵. MST, die vorgel.......

Diskussion

Während die Hippo-Signalweg wichtige Rollen in verschiedenen biologischen Prozessen spielt und Dysregulation des Hippo-Signalwegs zu Krebs^{6 führt}, ist wie der Hippo-Weg in Reaktion auf verschiedene Reize reguliert wird nicht vollständig verstanden. Darüber hinaus gab es keine quantitativen und Echtzeit-System zur Bewertung der Tätigkeit von Hippo Kernkomponenten. Vor kurzem haben wir entwickelt und validiert ein neuartiges Biosensor zur Messung der LATS-Kinase-Aktivität in der Hippo Weg

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0,25
%Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM mit hohem Glukosegehalt
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA-Transfektionsreagenz	Signagen	SL100688,5
5x Passiver Lysepuffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml Kit
20/20 Luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Einröhrchen-Reader Luminometer
GloMax® Navigator mit zwei Injektoren	Promega	GM2010	96-Well-Plattenleser, Luminometer