Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung der leukämischen Zellen aus dem Knochenmark Leukämie Patienten und Analyse ihrer metabolischen Zustand. Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen könnte dazu beitragen, um die Nachfrage von Primärzellen besser zu charakterisieren und könnte bis zu mehr personalisierte Medizin.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die metabolische Anforderung von Krebszellen kann überleben und die Wirksamkeit der Behandlung negativ beeinflussen. Heutzutage ist die pharmazeutische Ausrichtung der Stoffwechselwege in vielen Arten von Tumoren getestet. Charakterisierung von Krebs Zelle metabolische Setup ist also unumgänglich, um gezielt den richtigen Weg, um das Gesamtergebnis des Patienten zu verbessern. Leider in der Mehrzahl der Krebserkrankungen, die bösartigen Zellen sind ziemlich schwierig, in größerer Zahl zu erhalten und die Gewebeentnahme ist erforderlich. Leukämie ist eine Ausnahme, wo eine ausreichende Anzahl an leukämischen Zellen aus dem Knochenmark isoliert werden. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung der leukämischen Zellen aus dem Knochenmark Leukämie Patienten und anschließende Analyse ihrer metabolischen Zustand mit extrazellulären Flux-Analyzer. Leukämischen Zellen sind durch die Dichtegradienten isoliert, die ihre Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Anbau als nächstes hilft sie zu regenerieren, damit der metabolische Zustand gemessen ist der Zustand der Zellen unter optimalen Bedingungen. Dieses Protokoll ermöglicht konsistente, gut standardisierte Ergebnisse, die für die personalisierte Therapie genutzt werden könnten.
Einleitung
Die metabolischen Profils ist eines der Hauptmerkmale von Zellen und veränderten Bioenergetik gelten jetzt als eines der Markenzeichen von Krebs1,2,3. Darüber hinaus könnten Veränderungen im Stoffwechsel-Setup bei der Behandlung von Krebs durch gezielte Transduktion Signalwege oder enzymatische Maschinerie der Krebs Zellen4,5,6verwendet werden. Zu wissen, die metabolische Veranlagung von Krebszellen ist also ein Vorteil und kann helfen, die aktuelle Therapie zu verbessern.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Proben stammen die Patienteneinverständnis der Eltern oder Erziehungsberechtigten der Kinder mit Zustimmung der Ethikkommission der Karlsuniversität in Prag, Tschechische Republik, die Studie keine. NV15-28848A.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie 500 mL PBS durch Auflösen von 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4in DdH2O. anpassen der pH-Wert 7,4 mit HCl. entkeimen durch Autoklavieren vor.
- 100 mL RPMI Medium vorbereiten: RPMI-1640 Medium mit L-Alanyl-Glutamin ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 U/mL) und Strept....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 3 zeigt die Kurven nach Glykolyse Stresstest und Zelle Mito Stresstest Messungen der leukämischen Blasten aus dem BCP-ALL (B-Zelle Vorläufer akute lymphoblastische Leukämie) und AML (akute myeloische Leukämie) Patienten. Die Berechnung der metabolischen Parametern aus diesen Messungen wird ebenfalls angezeigt. 500.000 Zellen pro Bohrloch wurden ausgesät und alle Messungen erfolgten in Hexaplicates.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Messung der Stoffwechselaktivität von OCR und ECAR Werte in primären leukämischen Blasten abgeleitet von Patienten mit akute lymphoblastische Leukämie (ALL) bewertet oder akute myeloische Leukämie (AML). Der Vorteil der Messung mit einer extrazellulären Flux-Analyzer ist, dass es die Erkennung von metabolischen Profils in Echtzeit in lebenden Zellen ermöglicht. Jeder Schritt in das angegebene Protokoll konnte im wesentlichen je nach Zelltyp angepasst werden, was man studiere.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir möchten den tschechischen Pediatric Hematology Zentren zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grant des Gesundheitsministeriums (NV15-28848A), vom Gesundheitsministerium der Tschechischen Republik, University Hospital Motol, Prag, Tschechische Republik 00064203 und vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport NPU ich nr. LO1604.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fötales Rinderserum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glukose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A von Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-Glutaminlösung, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES-Lösung, 1 M, pH 7,0-7,6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Natriumpyruvat | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Rinderserum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Dichtegradient mittel |
| Seepferdchen XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Zell- und Gewebekleber | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seepferdchen-Analysator XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seepferdchen XFp Zellkultur-Miniplatte | Agilent Technologies | 103025-100 |
Referenzen
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallm....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
