Methodenartikel

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

DOI:

10.3791/58461

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11. Januar 2019

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1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Zusammenfassung

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Die genaue und spezifische Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in verschiedenen Mobilfunk- und Gewebe Kompartimenten ist wichtig für die Untersuchung von Redox-regulierten Signalisierung in biologischen Einstellungen. Elektron-paramagnetische Resonanz-Spektroskopie (EPR) ist die einzige direkte Methode, um freie Radikale eindeutig zu beurteilen. Sein Vorteil ist, dass physiologische Ebenen von bestimmten Arten mit hoher Spezifität erkennt, aber es erfordert spezialisierte Technologie, sorgfältige Probenvorbereitung und entsprechende Kontrollen, um genaue Interpretation der Daten zu gewährleisten. Zyklische Hydroxylamin Spin Sonden reagieren selektiv mit Superoxid oder andere radikale ein Nitroxid-Signal generieren, die von EPR-Spektroskopie quantifiziert werden können. Zelle durchlässig Spin Sonden und Spin Sonden entwickelt, um schnell in den Mitochondrien sammeln ermöglichen die Bestimmung der Superoxid-Konzentration in verschiedenen zellulären Kompartimenten.

In kultivierten Zellen, die Verwendung der Zelle durchlässig 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) zusammen mit und ohne Handy-undurchlässig Superoxid Dismutase (SOD) Vorbehandlung oder Verwendung der Zelle durchlässig PEG-SOD, ermöglicht die Differenzierung der extrazellulären aus cytosolischen Superoxid. Die mitochondriale 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] Piperidinium Paraquatdichlorid (Mito-TEMPO-H) ermöglicht die Messung von mitochondrialen ROS (überwiegend Superoxid).

Spin-Sonden und EPR-Spektroskopie können auch auf in Vivo Modelle angewendet werden. Superoxid kann in extrazellulären Flüssigkeiten wie Blut und alveoläre Flüssigkeit sowie Gewebe wie Lungengewebe erkannt werden. Verschiedene Methoden werden vorgestellt, um zu verarbeiten und speichern Gewebe für EPR-Messungen und intravenöse 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) Spin Sonde in Vivozu liefern. Während Messungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden können, können durch EPR bei 77 K. Proben aus in Vitro und in Vivo Modellen auch bei-80 ° C gelagert und analysiert werden Die Proben können in spezialisierten Schläuche stabil bei-80 ° C gelagert und laufen bei 77 K ermöglichen eine praktische, effiziente und reproduzierbare Methode, das erleichtert die Speicherung und Übertragung von Proben.

Einleitung

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Maßnahmen der oxidativen Stress und reaktive Sauerstoffspezies sind, zwar wichtig für die Untersuchung von verschiedenen Krankheiten auf alle Organsysteme ist die Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch eine kurze Halbwertszeit und hohe Reaktivität anspruchsvoll. Eine Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Technik ist die am meisten eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. Spin-Sonden haben Vorteile gegenüber den häufig verwendeten fluoreszierenden Sonden. Obwohl fluoreszierende Sonden sind relativ preiswert und einfach zu bedienen und ermöglichen eine schnelle, empfindliche Erkennung von ROS, haben sie gravierende Einschränkungen aufgrund....

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden von der University of Colorado Denver institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Diethylenetriaminepentaacetic Säure (DTPA) Lager (150 mM)
    1. Fügen Sie 2,95 g DTPA (393.35 g/Mol) auf 10 mL entionisiertem Wasser.
    2. Auflösen von DTPA, 1 M NaOH tropfenweise hinzufügen und bringen einem pH-Wert von 7,0.
    3. Bringen Sie die Lautstärke auf 50 mL mit Wasser für eine Endkonzentration von DTPA von 150 mM und bei 4 ° c lagern
  2. Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) (50 mM, pH 7.4)
    1. 5 M....

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Ergebnisse

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Superoxid-Erkennung mit CMH validiert wurde, mit dem X / XO Superoxid generieren System nachweisen können, dass das Nitroxid (CM.) Signal voll von SOD, gehemmt wurde, während die Katalase keinen Effekt (Abbildung 1A hatte). Total, extrazelluläre Superoxid wurde dann im RAW 264,7 Zellen durch Inkubation der Zellen mit der Zelle durchlässig CMH-Spin-Sonde + / SOD Vorbehandlung bewertet. Die Nitroxid-Konzentration wurde gemessen, in der Zellsuspension.......

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Diskussion

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Die Bewertung der Produktion freier Radikale in den biologischen Einstellungen ist wichtig im Verständnis Redox geregelt Signalisierung in Gesundheit und Krankheit, aber das Maß dieser Arten ist sehr schwierig wegen der kurzen Halbwertszeit von freien Radikalen Arten und technische Einschränkungen mit häufig verwendeten Methoden. EPR ist eine wertvolle und mächtige Werkzeug in der Redox-Biologie, wie es die einzige eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. In diesem Projekt zeigen wir praktische EPR Methoden.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der University of Colorado School of Medicine Dean strategische Forschungsinfrastruktur Award, R01 HL086680-09 und 1R35HL139726-01, zu eng und UCD CFReT Fellowship Award (er) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Sandra Eaton und Dr. Gareth Eaton (University of Denver), Dr. Gerald Rosen und Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), und Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) für hilfreiche Diskussionen und Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie und Ivy McDermott (University of Colorado Denver) für den technischen Support.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMLifeTech10566-016Zellkulturmedien
Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
Natriumchlorid (NaCl) Fisher Wissenschaftlich   BP358-212wird zur Herstellung von 50 mM Phosphat-Kochsalzpuffer verwendet  nach Sigma aldrish   
Kaliumphosphat zweibasisch (HK2PO4 )Fisher Scientific   BP363-500wird zur Herstellung von 50 mM Phosphat-Kochsalzpuffer verwendet  nach Sigma aldrish   
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379zur Herstellung von 50 mM Phosphat-Kochsalzpuffer  nach Sigma aldrish   
Krebs-Henseleit-Puffer (KHB)(Alfa Aesar, Hill)J67820
Rinder-Erythrozyten-Superoxid-Dismutase (SOD)Sigma Aldrich  S7571-30KU
Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)Sigma AldrichP1585-1MGIn DMSO auflösen
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGIn Ethanol auflösen und in Glasfläschchen aufbewahren (MW verwendet ist das gemittelte Molekulargewicht für vier Chargen)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidin, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidiniumdichlorid ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammoniumchlorid . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodoniumchlorid Sigma Aldrich43088
Deferoxamin MesylatsalzSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
MARKE Einweg BLAUBRAND  Mikropipetten, intraMarkSigma Aldrich708733Kapillaren
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16" Außendurchmesser x 1/8" ID		NORELL1598774ATeflonschlauch 
SILIKONKAUTSCHUKSTOPFEN FÜR NMR-PROBENRÖHRCHEN  FÜR DÜNNWANDIGE ROHRE MIT EINEM AUSSENDURCHMESSER VON 4 mm-5 MM (3,2 MM BIS 4,2 MM ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Tisch-EPR-Spektrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Referenzen

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  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Reaktive SauerstoffspeziesSuperoxid DetektionSpin SondenEPR SpektroskopieRaumtemperatur77 KelvinProbenlagerungLungengewebeZellkultur

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