Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um produzieren große Mengen an rekombinanten RNA in Escherichia coli Co zum Ausdruck bringen, eine Chimäre RNA, die die RNA in ein Viroid-Gerüst und eine Pflanze enthält tRNA-Ligase. Das Hauptprodukt ist ein kreisförmigen Molekül, das erleichtert die Reinigung zur Homogenität.

Zusammenfassung

Mit zunehmendem Interesse an RNA Biology und die Verwendung von RNA-Molekülen in anspruchsvolle biotechnologische Anwendungen, sind die Methoden, um große Mengen von rekombinanten RNAs produzieren beschränkt. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um produzieren große Mengen an rekombinanten RNA in Escherichia coli basierend auf Co Ausdruck eines Chimären Moleküls, die die RNA in ein Viroid-Gerüst und eine Pflanze enthält tRNA-Ligase. Viroide sind relativ klein, nicht-kodierenden, hoch Basis gepaart kreisförmige RNAs, die ansteckend für höhere Pflanzen sind. Der Host Pflanzen tRNA Ligase ist ein Enzym rekrutiert durch Viroide, die zu der Familie Avsunviroidae, wie z. B. Auberginen latente Viroid (ELVd) gehören, um RNA-Circularization während der Viroid-Replikation zu vermitteln. Obwohl ELVd nicht in E. Coli repliziert, eine ELVd Vorläufer ist effizient durch die E. Coli -RNA-Polymerase transkribiert und verarbeitet durch die eingebetteten Hammerhai Ribozyme in Bakterienzellen und die daraus resultierende Monomere durch circularized sind die Co zum Ausdruck gebrachten tRNA-Ligase eine bemerkenswerte Konzentration zu erreichen. Das Einfügen einer RNA von Interesse in der ELVd Gerüst ermöglicht die Produktion von zehn Milligramm des rekombinanten RNA pro Liter Bakterienkultur unter normalen Laborbedingungen. Eine Hauptfraktion des RNA-Produkts ist kreisförmig, ein Feature, das erleichtert die Reinigung der rekombinanten RNA zur virtuellen Homogenität. In diesem Protokoll wird die eine komplementäre DNA (cDNA) entsprechend der RNS des Interesses an einer bestimmten Position ELVd cDNA in ein Expressionsplasmid eingefügt, die entlang das Plasmid Aubergine tRNA Ligase Co Ausdrücken verwendet wird, um E. Colizu verwandeln. Co Ausdruck der beiden Moleküle unter der Kontrolle der starken konstitutiven Promoter führt zur Produktion von großen Mengen der rekombinanten RNA. Rekombinante RNA kann der bakteriellen Zellen entnommen und getrennt von der Masse der bakteriellen RNAs unter Ausnutzung seiner Zirkularität.

Einleitung

Im Gegensatz zu DNA und Proteine sind Protokolle für einfache, effiziente und kostengünstige Produktion von großen Mengen an RNA nicht reichlich vorhanden. Jedoch anspruchsvolle Forschung und Industrie verlangen immer mehr diese Biomoleküle ihre einzigartigen biologischen Eigenschaften¹zu untersuchen oder eingesetzt werden biotechnologische Anwendungen, einschließlich ihrer Verwendung als hochspezifische Aptameren ², Therapeutika³oder selektive Schädlingsbekämpfungsmittel⁴. In vitro Transkription und chemische Synthese werden häufig in der Forschung verwendet, um RNA zu pro....

Protokoll

(1) Plasmid Bau

1. Durch PCR (oder durch reverse Transkription PCR, wenn ausgehend von einer RNA-Vorlage) verstärken die cDNA entspricht der RNS mit Primer mit 5' Extension zum Einbau in das Expressionsplasmid zu ermöglichen. Verwenden Sie zur Vermeidung von unerwünschten Mutationen ein High-Fidelity-DNA-Polymerase.
   1. Die folgenden 5' Erweiterungen hinzufügen um die cDNA von Gibson Montage²⁰in das Expressionsplasmid einfügen, die PCR-Primer: vorwärts, 5'-TctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3 "; Revers, 5'-CcctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3 "; X steht für Nukleotide homologe zu den ter....

Ergebnisse

Zur Herstellung rekombinanter RNA in E. Coli mit ELVd abgeleitete System¹²ist die RNA von Interesse in eine ELVd RNA-Gerüst veredelt. Diese Chimären RNA ist Co ausgedrückt entlang der Aubergine tRNA-Ligase in E. Coli. Nach der Bearbeitung, gespalten und circularized, bildet die Chimäre kreisförmige RNA, aus der RNA des Interesses ragt, wahrscheinlich ein Ribonucleoprotein Komplex mit dem Co ausgedrückt Aubergine Enzym, das bemerkenswerte Konzentra.......

Diskussion

Bei der Recherche die ELVd Sequenz und Strukturanforderungen an die Anerkennung durch die Auberginen tRNA-Ligase beteiligt, bemerkten wir, dass Co Ausdruck der beiden Moleküle in nicht-Host E. Coli führte zu einer unerwarteten großen Anhäufung von Viroid kreisförmige Formen in Bakterienzellen¹⁹. Wir verstanden, dass die große Ansammlung von Viroid-RNA in E. Coli sehr wahrscheinlich die Folge Co auszudrücken ein hochstabiles RNA-Molekül, wie die relativ kleinen (333 nt), hoch Basi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Essigsäure	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidiumbromid	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
	NanoDrop ThermoFisher	Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Konzentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Trypton	Intron Biotechnology	Ba2014
Hefeextrakt	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamid	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerin	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF Säule	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
Ä KTAprime plus Flüssigchromatographie-System	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000
2KN,N' -Methylenbisacrylamid	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Harnstoff	PanReac AppliChem	146392.1211
Borsäure	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamid	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromphenolblau	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylolcyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamin	Sigma-Aldrich	A4929-5G