Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.
Methodenartikel
Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.
Rechtsventrikuläre Abfluss-Darm-Trakt (RVOT) Klappenersatz bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern dienen verschiedene Ventil Leitungen und Ventile Stent montiert. Bei Verwendung von prothetische Materialien jedoch, sind diese Transplantate anfällig für bakterielle Infektionen und verschiedene Host Antworten.
Identifizierung von Bakterien und Host Faktoren, die eine entscheidende bei endovaskulären Einhaltung von Mikroorganismen Rolle ist wichtig zum besseren Verständnis die Pathophysiologie der das Auftreten von Infektionen wie infektiöse Endokarditis (IE) und präventiv zu entwickeln Strategien. Daher muss die Entwicklung zuständigen Modelle, bakterielle Adhäsion unter physiologischen scher Bedingungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer neu gestalteten in-vitro- Perfusion Kammer basierend auf parallelen Platten, die ermöglicht, dass die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten des Transplantats Gewebe ausgesetzt wie extrazelluläre Matrix, Endothelzellen und inerte Bereiche . Diese Methode kombiniert mit koloniebildenden Stückzählen (CFU) ist ausreichend, um die Neigung des Knochenmaterials gegen bakterielle Adhäsion unter Strömung zu bewerten. Könnte die Flow-Kammer-System weiterverwendet werden, die Rolle von Blutbestandteilen in bakterielle Adhäsion unter Scherung Bedingungen zu untersuchen. Wir bewiesen, dass die Quelle der Gewebe, ihre Oberflächenmorphologie und Bakterienarten Spezifität sind nicht die großen bestimmenden Faktoren im bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat durch unsere hauseigene gestaltete in-vitro- Perfusion Modell.
Staphylococcus aureus (S. Aureus) beschäftigt eine Vielzahl von Virulenz Strategien zur Umgehung der Host Immunabwehr besiedeln biologische oder nicht-biologischen Oberflächen implantiert in den menschlichen Kreislauf, führt zu schweren intravaskuläre Infektionen wie Sepsis und IE1,2,3,4,5. IE bleibt eine wichtige Behandlung verbundene Komplikation bei Patienten nach Implantation der Prothese Herzklappen während der einzelnen Faktoren für das Auftreten von IEare nicht noch völlig verstanden6,7. Unter Strömungsbedingungen begegnen Bakterien Scherkräfte, die sie benötigen, zu überwinden, um das Schiff Wand8einhalten. Modelle, die studieren des Zusammenspiel zwischen Bakterien und prothetische Ventil Gewebe oder Endothel unter Strömung zu ermöglichen, sind von Interesse, da sie die in-Vivo -Situation mehr widerspiegeln.
Mehrere spezifische Mechanismen ermöglichen bakterielle Einhaltung der Endothelzellen (ECs) und der exponierten subendothelial Matrix (ECM) führt zu Gewebe Kolonisation und Reifung der Vegetationen, wesentlichen frühen Schritte in IE9. Verschiedene Staphylokokken Oberflächenproteine oder MSCRAMMs (mikrobielle DGM-Komponenten erkennen Haftmatrix Moleküle) wurden als Vermittler der Adhäsion Wirtszellen und ECM Proteine beschrieben durch die Interaktion mit Molekülen wie Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen und von-Willebrand-Faktor (VWF)8,10,11. Jedoch haben viele dieser Interaktionen aufgrund intramolekularer Falte der einige Virulenzfaktoren, meist unter statischen Bedingungen untersucht unterschiedliche Relevanz endovaskuläre Infektion im Blut zirkulieren.
Deshalb präsentieren wir ein Inhouse gestalteten in-vitro- Parallel-Platte Fluss Kammer-Modell, ermöglicht die Beurteilung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten von ECM und ECs im Zusammenhang mit Gewebetransplantate in die RVOT-Position implantiert. Das allgemeine Ziel des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es, Mechanismen der Interaktion zwischen Bakterien und darunter liegende endovaskuläre Gewebe in Strömungsverhältnisse, die eng, für die in-Vivo -Umwelt Blutkreislauf Krankheitserreger wie verbunden sind zu studieren S. Aureus. Dieser neuartige Ansatz konzentriert sich auf die Anfälligkeit der Transplantat Gewebe Oberflächen zu bakteriellen Einhaltung der Risikofaktoren für die Entwicklung von IE zu identifizieren.
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1. Vorbereitung Graft Gewebe für In-vitro- Studien
Hinweis: Drei Arten von Geweben wurden verwendet: Bovine Perikard Patch (BP), kryokonserviert Homograft (CH) und Rinder Halsschlagader Transplantate (BJV). Im Falle der BJV Conduit und CH (Gewebe durch europäische Homograft Bank (EHB) verarbeitet und gespeichert in flüssigem Stickstoff vor der Verwendung) dienten die Wand und Herzklappenfehler Flugblätter. BP-Patch und BJV Conduit wurden von den Herstellern gekauft. Vor dem Gebrauch auftauen der EHB Anweisungen12nach CH.
2. Vorbereitung Perfusion Experimente mit Bakterien
Hinweis: Drei bakterielle Isolate wurden verwendet: S. Aureus Cowan (ATCC 12598), ATCC 149900 S. Epidermidis und S. Sanguinis NCTC 7864. S. Aureus und S. Epidermidis wurden bei 37 ° C in tryptic Soy Bouillon (TSB) und S. Sanguinis wurde bei 37 ° C mit 5 % CO2 im Gehirn Herz Infusion Brühe (BHI) angebaut.
3. in-vitro- Perfusion Experimente mit einer Parallel-Platte fließen Kammer
(4) Fluoreszenzmikroskopie haftende Bakterien Gewebe bei der Perfusion verpflanzen
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Besseres Verständnis die Mechanismen hinter IE Entwicklung, dieses Modell ermöglicht die Auswertung der bakteriellen und Gewebe verbundenen Faktoren zu präsentieren, in der in-Vivo -Situation der Infektion auftreten.
Im Detail, die neuartige in-vitro- Ansatz ermöglicht die bakterielle Adhäsion in Strömungsverhältnisse zu verschiedenen Transplantat Geweben quantifizieren von Vorrichtung Eindringmittel b...
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Neuere klinische Beobachtungen geben besondere Aufmerksamkeit auf IE als Komplikation bei Patienten nach einer Klappenersatz des RVOT6,13. Dysfunktion der implantierten Ventil im IE ist das Ergebnis der bakteriellen Interaktion mit der endovaskuläre Prothese führt zu umfangreichen Entzündungs- und gerinnungsfördernden Reaktionen1,14. Präsentiert neue in-vitro- Modell erlaubt uns zu untersuchen, o...
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Diese Studie wurde gesponsert durch einen Zuschuss von der Research Fund KU Leuven (OT/14/097), RH gegeben. TRV war Postdoctoral Fellow der FWO Research Foundation - Flandern (Belgien; Gewährungsnummer - 12K0916N) und RH stützt sich auf die klinische Forschung Fonds UZ Leuven.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Pflaster für Rinderperikard (BP), Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Leitungen für Rinder-Jugularvenen (BJV) | Contegra-Leitung; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH kryokonserviertes Homotransplantat | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| humanes Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgien | BE171464 LOT:16G12C | |
| Tryptische Sojabrühe (TSB) | Fluka, Steinheim, Deutschland | 22092-500G | |
| Herzinfusionsbrühe (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-Hydroxysuccinimidester (CF) | Sigma-Aldrich, Deutschland | 21878-100MG-F | |
| Schlauchpumpe (MODELL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Deutschland | 631942-2 | |
| Beschallungsbad | VWR Ultraschallreiniger; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Eindeckmittel | Invitrogen von ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (Fluoreszenzscanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - Reinstwasser - H2O MilliQ Millipore | 87206462 | ||
| Mikroskopische Objektträger - Gewebekulturkammern (1 Well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-Well auf Lumox abnehmbar | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Edelstahl - chirurgische Klingen | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silikonschlauch, 1/8" ID x 1/4" OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperaturbereich: – 80 bis 200°; C Sterilisieren: Mit Ethylenoxid, Gammabestrahlung oder Autoklav für 30 min, 15 psi Druck |
| PharMed BPT Schlauch | Saint-Gobain | AY242012 | Autoklavierbar 30 min bei 121 °; C |
| Tygon LMT-55 Schlauch | Saint Gobain Performance Plastics™ | ||
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
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