Methodenartikel

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

DOI:

10.3791/58476

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7. Januar 2019

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1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.

Zusammenfassung

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Rechtsventrikuläre Abfluss-Darm-Trakt (RVOT) Klappenersatz bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern dienen verschiedene Ventil Leitungen und Ventile Stent montiert. Bei Verwendung von prothetische Materialien jedoch, sind diese Transplantate anfällig für bakterielle Infektionen und verschiedene Host Antworten.

Identifizierung von Bakterien und Host Faktoren, die eine entscheidende bei endovaskulären Einhaltung von Mikroorganismen Rolle ist wichtig zum besseren Verständnis die Pathophysiologie der das Auftreten von Infektionen wie infektiöse Endokarditis (IE) und präventiv zu entwickeln Strategien. Daher muss die Entwicklung zuständigen Modelle, bakterielle Adhäsion unter physiologischen scher Bedingungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer neu gestalteten in-vitro- Perfusion Kammer basierend auf parallelen Platten, die ermöglicht, dass die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten des Transplantats Gewebe ausgesetzt wie extrazelluläre Matrix, Endothelzellen und inerte Bereiche . Diese Methode kombiniert mit koloniebildenden Stückzählen (CFU) ist ausreichend, um die Neigung des Knochenmaterials gegen bakterielle Adhäsion unter Strömung zu bewerten. Könnte die Flow-Kammer-System weiterverwendet werden, die Rolle von Blutbestandteilen in bakterielle Adhäsion unter Scherung Bedingungen zu untersuchen. Wir bewiesen, dass die Quelle der Gewebe, ihre Oberflächenmorphologie und Bakterienarten Spezifität sind nicht die großen bestimmenden Faktoren im bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat durch unsere hauseigene gestaltete in-vitro- Perfusion Modell.

Einleitung

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Staphylococcus aureus (S. Aureus) beschäftigt eine Vielzahl von Virulenz Strategien zur Umgehung der Host Immunabwehr besiedeln biologische oder nicht-biologischen Oberflächen implantiert in den menschlichen Kreislauf, führt zu schweren intravaskuläre Infektionen wie Sepsis und IE1,2,3,4,5. IE bleibt eine wichtige Behandlung verbundene Komplikation bei Patienten nach Implantation der Prothese Herzklappen während der einzelnen Faktoren für das Auftreten von IEare nicht noch völlig verstanden6,7. Unter Strömungsbedingungen begegnen Bakterien Scherkräfte, die sie benötigen, zu überwinden, um das Schiff Wand8einhalten. Modelle, die studieren des Zusammenspiel zwischen Bakterien und prothetische Ventil Gewebe oder Endothel unter Strömung zu ermöglichen, sind von Interesse, da sie die in-Vivo -Situation mehr widerspiegeln.

Mehrere spezifische Mechanismen ermöglichen bakterielle Einhaltung der Endothelzellen (ECs) und der exponierten subendothelial Matrix (ECM) führt zu Gewebe Kolonisation und Reifung der Vegetationen, wesentlichen frühen Schritte in IE9. Verschiedene Staphylokokken Oberflächenproteine oder MSCRAMMs (mikrobielle DGM-Komponenten erkennen Haftmatrix Moleküle) wurden als Vermittler der Adhäsion Wirtszellen und ECM Proteine beschrieben durch die Interaktion mit Molekülen wie Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen und von-Willebrand-Faktor (VWF)8,10,11. Jedoch haben viele dieser Interaktionen aufgrund intramolekularer Falte der einige Virulenzfaktoren, meist unter statischen Bedingungen untersucht unterschiedliche Relevanz endovaskuläre Infektion im Blut zirkulieren.

Deshalb präsentieren wir ein Inhouse gestalteten in-vitro- Parallel-Platte Fluss Kammer-Modell, ermöglicht die Beurteilung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten von ECM und ECs im Zusammenhang mit Gewebetransplantate in die RVOT-Position implantiert. Das allgemeine Ziel des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es, Mechanismen der Interaktion zwischen Bakterien und darunter liegende endovaskuläre Gewebe in Strömungsverhältnisse, die eng, für die in-Vivo -Umwelt Blutkreislauf Krankheitserreger wie verbunden sind zu studieren S. Aureus. Dieser neuartige Ansatz konzentriert sich auf die Anfälligkeit der Transplantat Gewebe Oberflächen zu bakteriellen Einhaltung der Risikofaktoren für die Entwicklung von IE zu identifizieren.

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Protokoll

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1. Vorbereitung Graft Gewebe für In-vitro- Studien

Hinweis: Drei Arten von Geweben wurden verwendet: Bovine Perikard Patch (BP), kryokonserviert Homograft (CH) und Rinder Halsschlagader Transplantate (BJV). Im Falle der BJV Conduit und CH (Gewebe durch europäische Homograft Bank (EHB) verarbeitet und gespeichert in flüssigem Stickstoff vor der Verwendung) dienten die Wand und Herzklappenfehler Flugblätter. BP-Patch und BJV Conduit wurden von den Herstellern gekauft. Vor dem Gebrauch auftauen der EHB Anweisungen12nach CH.

  1. Spülen Sie alle Gewebe mit 0,9 % NaCl vor dem Gebrauch ab.
  2. Bereiten Sie Gewebebiopsien Einweg Hautbiopsie mit Punsch, kreisförmige Gewebe Stücke (10 mm Durchmesser) zu schneiden.
  3. Schneiden Sie alle Gewebe-Patches auf die gleiche Höhe mit sterilen Einweg-Skalpelle.
  4. Inkubieren Sie für Gewebe mit Glutaraldehyd (z. B. BJV Conduit) fixiert Transplantat Stücke über Nacht bei 4 ° C mit 200 g/L von Humanalbumin, das Fixiermittel zu neutralisieren.
  5. Auswaschen Rückstände von Glutaraldehyd mit 0,9 % NaCl in einer Mikrotiterplatte.  Wiederholen Sie 3-Mal für 1 Minute.

2. Vorbereitung Perfusion Experimente mit Bakterien

Hinweis: Drei bakterielle Isolate wurden verwendet: S. Aureus Cowan (ATCC 12598), ATCC 149900 S. Epidermidis und S. Sanguinis NCTC 7864. S. Aureus und S. Epidermidis wurden bei 37 ° C in tryptic Soy Bouillon (TSB) und S. Sanguinis wurde bei 37 ° C mit 5 % CO2 im Gehirn Herz Infusion Brühe (BHI) angebaut.

  1. Über Nacht Kultur von Bakterien auf einem soliden Blutagar Teller vorzubereiten.
    1. Verwenden Sie eine sterile Schleife um die gefrorenen Bakterien abkratzen und impfen auf einen Mueller-Hinton-Blutagar-Teller für Übernachtung Kultur bei 37 ° C.
  2. Verwenden Sie eine sterile Inokulation Schleife zu holen eine einzige Kolonie von der Übernachtung Blutagar Kultur und impfen in 10 mL TSB oder BHI 14 mL-Tube und Kultur über Nacht bei 37 ° C.
  3. Zentrifugieren Sie Übernacht Kulturen (3000 x g, 4 ° C, 10 min) und erneut die Pellets in 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Legen Sie 14 mL-Tuben auf Eis.
  4. Bereiten Sie eine aliquote 3,7 mg/mL Lösung von 5 (6) - Carboxy - Fluorescein N-hydroxy-Succinimidyl Ester (CF) in Ethanol und Lagerung bei-20 ° C. Weiter verdünnen Sie den Bestand an CF 150 µg/ml mit "Reinstwasser".
    Hinweis: Rohre vor Licht mit Alufolie schützen und speichern bei-20 ° C.
  5. Zentrifugieren Sie die Bakterien (3000 x g, 4 ° C, 10 min) und Aufschwemmen Sie der Pellets in 800 µL PBS und fügen Sie 200 µL der 150 µg/mL CF Lösung (Endkonzentration von 30 µg/mL für Perfusion Experimente genutzt). Rohre vor Licht mit Alufolie schützen und 30 min mit einem Orbitalschüttler inkubieren.
  6. Nach der Kennzeichnung, block mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung mit PBS-Puffer und spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Folgen Sie mit einem Waschschritt mit 10 mL PBS und Pellet Bakterien durch Zentrifugieren (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
  7. Verdünnen Sie Bakterien mit PBS zu 107 Koloniebildenden Einheiten (KBE) /mL (überprüft von KBE zählen auf Mueller-Hinton-Blutagar-Platten), das entspricht einer OD600 (Extinktion) von 0,65. Halten Sie die Rohre in der Dunkelheit auf dem Eis vor Perfusion Experimente.
    Hinweis. Denken Sie daran, dass die OD600 Messungen die ungefähre Anzahl der Bakterien widerspiegeln. Um die wirksame Impfung Dosis zu zählen, ist die serielle Verdünnungsmethode ein zusätzliche notwendiger Schritt zur Überprüfung der OD Zahlen wie im Abschnitt 3.8 beschrieben.

3. in-vitro- Perfusion Experimente mit einer Parallel-Platte fließen Kammer

  1. Montieren Sie Gewebebiopsien von 10 mm im Durchmesser und gleicher Dicke (vorbereitet in den Schritten 1.1-1.5) in ein Flow-Kammer-System mit der Innenfläche nach oben kommt man in Kontakt mit der Bakteriensuspension.
    Hinweis: Die gleiche Dicke der Gewebe in verschiedenen Transplantate sorgt dafür, dass die gleiche Höhe der Gewebe in den Kanal, so dass Laminar-Flow unter allen Bedingungen erreicht wird. Alle Elemente der Strömungsraum vorgestellt und in Abbildung 1beschrieben.
    1. Um das Protokoll zu beginnen, legen Sie die Runde Gewebe zwischen einen Objektträger mit einer 8 mm Runde Perforation und eine Gummidichtung.
      Hinweis: Die Objektträger besitzt die ultra-dünnen Unterfolie um die Generation der 8 mm Bohrung zu ermöglichen. Zusammen mit dem Gummiblatt es behebt das Gewebe um den direkten Kontakt zwischen der Probe und das strömende Medium zu ermöglichen und auch verhindert, dass die Versetzung der Biopsie während des Experiments. Die Oberfläche des untersuchten Gewebes, welches den Fluss (kleiner Durchmesser) ausgesetzt ist nicht von der Zange zu manipulieren.
    2. Legen Sie den Halter mit dem Gewebe in das Dichtung-Blatt, das in den unteren Metallrahmen der Kammer eingebettet ist.
    3. Befestigen Sie den oberen Metallrahmen mit dem entsprechenden Dichtung Blatt auf den Unterteil der Kammer mit dem zuvor eingefügten Gewebe-Halter. Anschließend montieren Sie die ganze Kammer mit acht Schrauben und Muttern. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der Kammer in Transplantate immer identisch ist.
      Hinweis: Die Höhe der Kammer sollte immer beim Anziehen der Schrauben bestimmt werden. Verwenden Sie eine Zange oder Herrscher.
  2. Verbinden Sie die Fluss-Kammer mit einer peristaltischen Pumpe und Ausgleichsbehälter mit den Rohren.
  3. Durchspülen der Gewebe mit Suspensionen von 107 KBE/mL (verifiziert durch KBE zählen und im Zusammenhang mit OD600 Messungen) Eindringmittel beschriftet Bakterien mit PBS-Puffer mit einer Scherbeanspruchung von 3 dyn/cm2 (Dyne pro Quadratzentimeter Druckeinheit) durch Mittel der peristaltischen Pumpe (Durchflussmenge 4 mL/min) für 1 h mit 400 mL bakterielle Reservoir (Werksdesign, Abbildung 1) bei 37 ° C über eine Platte-Thermostat (Table of Materials) konditioniert.
  4. Umwälzen Sie kontinuierlich die 100 mL Bakteriensuspension verwenden den gleichen Sammelbehälter.
  5. Demontieren Sie nach Perfusion die Kammer um das Transplantat freizugeben und das Gewebe Stück zweimal mit 4 mL PBS in einer 12-Well-Platte mit dem Labor Orbitalschüttler für 3 min waschen. Anschließend Schneiden der innere Teil des Transplantats eine Hautbiopsie mit Punsch mit kleinerem Durchmesser.
  6. Legen Sie jeder Gewebeentnahme in einer separaten 14 mL Röhrchen mit 1 mL steriler 0,9 % NaCl. Beschriften Sie das Rohr als #1.
  7. Lösen Sie die Bakterien aus dem Gewebe mit einer Beschallung Bad für 10 min (Amplitude = 100 % und Frequenz = 45 kHz).
    Hinweis: Vollständige Loslösung von Bakterien aus dem Gewebe, die Transplantate nach Inkubation von Patches über Nacht bei 37 ° C im flüssigen Medium TSB gefolgt von OD600 Messungen ausgewertet werden sollen im Vergleich um zu steuern, Patches mit einer Bakterien-frei-Lösung behandelt.
  8. Verwenden Sie ein serielles Verdünnungsmethode auf Mueller-Hinton-Blutagar-Platten KBE zählen.
    1. Bereiten Sie einen einzigen 14 mL-Tube mit 10 mL steriler Kochsalzlösung Verdünnungsreihen die Bakteriensuspension erhalten nach Beschallung zu machen. Beschriften Sie diese Röhre als #2.
      Hinweis: Für jedes Gewebe Experiment eine Tube mit 10 mL 0,9 % NaCl ist erforderlich.
    2. Bereiten Sie drei 14 mL Röhrchen mit 10 mL steriler 0,9 % NaCl für serielle Verdünnungen des ersten Bakteriensuspension aus Schritt 2.7. Beschriften Sie die Schläuche wie folgt #3, #4, #5.
      Hinweis: Dieser Schritt ist notwendig, die echte KBE-Zahl in Bakteriensuspension verwendet für die Perfusion Experiment kennen.
    3. Vortex mischen jedes Rohr 15 S. Wirbel die Rohre mit der Gewebeentnahme sowie die ersten Bakteriensuspension Verdünnungsreihen zu machen.
    4. Bereiten Sie drei Agarplatten, zwei für die Gewebe-Experiment (Perfusion von Bakterien und Kontrolle Perfusion der PBS) und die dritte für die anfängliche Bakteriensuspension für Perfusionen verwendet.
    5. Beschriften Sie in drei Sektoren pro Platte für die Gewebe-Experiment in der folgenden Weise 10-1, 10-3 und 10-4. Zum zählen der Anzahl der KBE in der bakteriellen Perfusates beschriften Sie die Platte wie folgt: 10-1, 10-3, 10-5 bis 10-7.
      Hinweis: Alle Angaben auf Agar Platten wie 10-1, 10-3 usw. beziehen sich auf die endgültige Anzahl der KBE/mL am nächsten Tag berechnet. Steuerplatte erfordert keine Sektoren. Vor Gebrauch sollte Blutagar Platten platziert unter der laminar Haube und geöffnet, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen.
    6. Um den Vorgang fortzusetzen, Vorbereitung der Verdünnungsreihen, übertragen Sie 100 µL Röhre #1 Rohr #2 und mischen Sie kräftig mit Vortex.
    7. 100 µL der Inhalt der Tube #1 und #2 auf die entsprechenden Sektoren 10-1 und 10-3 der Agar-Platte zu verbreiten. Ebenso verbreitet 10 µL des Rohres #2 auf dem Sektor 10-4, wiederholen Sie diesen Schritt 4 mal 4 separate Wucherungen von jedem Volumen von 10 µL zu erhalten.
      Hinweis: Aufgrund des geringen Volumens für die Beschichtung auf dem Sektor 10-4verwendet, ist es ratsam, mehrere Anzahl der Tröpfchen zu einer durchschnittlichen Anzahl von gewachsenen KBE.
    8. Um die serielle Verdünnungen der ursprünglichen Kultur vorzubereiten, übertragen Sie 100 µL Bakteriensuspension vom Schritt 2.7 auf Rohr #3 und mischen Sie kräftig mit Vortex. Tube #4 100 µL Rohr #3 hinzufügen und gut mischen, wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Röhre #5.
    9. 100 µL des Inhalts der Röhren #3, #4 und #5 bereinigte Bakteriensuspension (Schritt 2.7), bzw. auf Sektoren 10-3, 10-5, 10-7 und 10-1 der Blutagar Platte verteilt.
    10. Lassen Sie den Blutagar-Platten in der laminaren Haube an der Luft trocknen die bakterielle Spreads in der Regel für 10 Minuten. Danach legen Sie die Platten bei 37 ° C für die Inkubation über Nacht.
    11. Zählen Sie nach der Inkubation über Nacht die Bakterienkolonien um die Anzahl der KBE, aus dem die Haftung an der Gewebebiopsien sowie KBE/mL in den Start Bakteriensuspension verwendet für die Perfusion zu erhalten. Drücken Sie die Ergebnisse als KBE/cm2.

(4) Fluoreszenzmikroskopie haftende Bakterien Gewebe bei der Perfusion verpflanzen

  1. Nach Perfusion, Gewebe Stücke mit PBS waschen (siehe Punkt 3.5) und schneiden Sie den inneren Teil der ein Transplantat mit einem Schlag mit einem kleineren Durchmesser.
  2. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte und legen Sie Tröpfchen Eindeckmedium (Table of Materials).
  3. Legen Sie jedes Stück des Gewebes mit seiner perfundierten Oberfläche nach unten auf einen einzigen Tropfen Eindeckmittel.
  4. Lesen Sie einen Teller mit einem Fluoreszenz-Scanner (Table of Materials). Eingestellten Parameter des Anregung und Emission Wellenlängen entsprechend einem Fluorophore für bakterielle Kennzeichnung verwendet.

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Ergebnisse

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Besseres Verständnis die Mechanismen hinter IE Entwicklung, dieses Modell ermöglicht die Auswertung der bakteriellen und Gewebe verbundenen Faktoren zu präsentieren, in der in-Vivo -Situation der Infektion auftreten.

Im Detail, die neuartige in-vitro- Ansatz ermöglicht die bakterielle Adhäsion in Strömungsverhältnisse zu verschiedenen Transplantat Geweben quantifizieren von Vorrichtung Eindringmittel b...

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Diskussion

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Neuere klinische Beobachtungen geben besondere Aufmerksamkeit auf IE als Komplikation bei Patienten nach einer Klappenersatz des RVOT6,13. Dysfunktion der implantierten Ventil im IE ist das Ergebnis der bakteriellen Interaktion mit der endovaskuläre Prothese führt zu umfangreichen Entzündungs- und gerinnungsfördernden Reaktionen1,14. Präsentiert neue in-vitro- Modell erlaubt uns zu untersuchen, o...

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Danksagungen

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Diese Studie wurde gesponsert durch einen Zuschuss von der Research Fund KU Leuven (OT/14/097), RH gegeben. TRV war Postdoctoral Fellow der FWO Research Foundation - Flandern (Belgien; Gewährungsnummer - 12K0916N) und RH stützt sich auf die klinische Forschung Fonds UZ Leuven.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Pflaster für Rinderperikard (BP), Supple Peri-Guard PericardiumSynovis Surgical Innovations, USAPC-0404SN
Leitungen für Rinder-Jugularvenen (BJV)Contegra-Leitung; Medtronic Inc, USAM333105D001
CH kryokonserviertes HomotransplantatEuropean Homograft Bank (EHB)-
Acu-PunchAcuderm Inc, USAP850 (8 mm); P1050 (10 mm)
humanes AlbuminFlexbumin; Baxter, BelgienBE171464
LOT:16G12C
Tryptische Sojabrühe (TSB)Fluka, Steinheim, Deutschland22092-500G
Herzinfusionsbrühe (BHI)Fluka53286-500G
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).Gibco14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-Hydroxysuccinimidester (CF)Sigma-Aldrich, Deutschland21878-100MG-F
Schlauchpumpe (MODELL ISM444B)Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Deutschland631942-2
BeschallungsbadVWR Ultraschallreiniger; VWR, Radnor, Pa142-6044230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold EindeckmittelInvitrogen von ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000 (Fluoreszenzscanner)GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa29027886
Arium Pro VF - Reinstwasser - H2O MilliQ Millipore87206462
Mikroskopische Objektträger - Gewebekulturkammern (1 Well)Sarstedt94.6140.102
1-Well auf Lumox abnehmbarSarstedt94.6150.101
Edelstahl - chirurgische KlingenSwann-Morton311
Tygon Silikonschlauch, 1/8" ID x 1/4" ODCole-ParmerEW-95702-06Temperaturbereich: – 80 bis 200°; C
Sterilisieren: Mit Ethylenoxid, Gammabestrahlung oder Autoklav für 30 min, 15 psi Druck
PharMed BPT SchlauchSaint-GobainAY242012Autoklavierbar 30 min bei 121 °; C
Tygon LMT-55 SchlauchSaint Gobain Performance Plastics™
ThermostatBMG BIOMEDIZINTECHNIK300-0042230V, 90VA, 50Hz
15312022

Referenzen

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Schlagwörter

Infekti se Endokarditiskoloniebildende EinheitenScherspannungsbedingungenVorbereitung von Gewebebiopsienserielle Verd nnungsmethodeAgarplattenz hlungStaphylococcus aureus

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