Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

H.S. Jeffrey Man; Aravin N. Sukumar; Kyung Ha Ku; Michelle K. Dubinsky; Noeline Subramaniam; Philip A. Marsden

doi:10.3791/58478

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Methodenartikel

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

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DOI:

10.3791/58478

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21. Oktober 2018

H.S. Jeffrey Man¹^,² , Aravin N. Sukumar¹^,² , Kyung Ha Ku²^,³ , Michelle K. Dubinsky¹^,² , Noeline Subramaniam¹^,² , Philip A. Marsden¹^,²^,³^,⁴

¹Institute of Medical Science, University of Toronto, ²Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, ³Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, ⁴Department of Medicine, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier ist ein Workflow für die Kultur und Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen unter Fluid Schubspannung präsentiert. Enthalten ist eine räumliche Anordnung für die gleichzeitig Gehäuse und Überwachung mehrerer Fluss Kammern in einer kontrollierten Umgebung und die Verwendung einer exogenen Referenz-RNA für die quantitative PCR.

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen Workflow für die Analyse der Genexpression von Endothelzellen unterliegen einem stetigen Laminar-Flow mit mehreren Kammern überwachten Parallel-Platte Fluss. Endothelzellen bilden die innere zelluläre Auskleidung der Blutgefäße und die Reibungskraft des Blutflusses genannt Schubspannung chronisch ausgesetzt sind. Unter physiologischen Bedingungen, Endothelzellen Funktion in Anwesenheit von verschiedenen Schubspannung Bedingungen. So kann die Anwendung der Schubspannung in in-vitro- Modelle einen tieferen Einblick in Endothelzellen Antworten in Vivobieten. Die Parallel-Platte Strömungsraum zuvor von Lane Et Al. veröffentlicht ⁹ ist an Endothelzellen Genregulation in an- und Abwesenheit des stetigen (nicht pulsierender) Laminar-Flow zu studieren. Wichtige Anpassungen im Setup für laminare Strömung wie hier dargestellt sind eine große, engagierte Umgebung Haus gleichzeitige Fluss Schaltungen, die Überwachung der Fördermengen in Echtzeit, und die Aufnahme einer exogenen Referenz RNA für die Normalisierung der quantitative Echtzeit-PCR-Daten. Um mehrere Behandlungen/Bedingungen mit der Anwendung der Schubspannung zu beurteilen, werden mehrere Flow Schaltungen und Pumpen gleichzeitig innerhalb der gleichen beheizt und befeuchteten Inkubator verwendet. Die Durchflussmenge des jede Strömung Schaltung misst kontinuierlich in Echtzeit Schubspannung Bedingungen während der Experimente zu standardisieren. Da diese Experimente mehrere Bedingungen haben, verwenden wir auch eine exogene Referenz-RNA, die versetzt-in zur Zeit der RNA-Extraktion für die Normalisierung der RNA-Extraktion und erste Strang cDNA Synthese Effizienz ist. Diese Schritte minimieren die Variabilität zwischen den Proben. Diese Strategie ist in unserer Pipeline für die Gen-Expression-Analyse mit Schubspannung Experimente mit Parallel-Platte Strömungsraum eingesetzt, aber Teile dieser Strategie, wie die exogene RNA-Spike-in verweisen, können einfach und kostengünstig für verwendet werden andere Anwendungen.

Einleitung

Vaskuläre endotheliale Zellen bilden das zelluläre Innenfutter der Blutgefäße im geschlossenen Kreislauf der höheren Arten. Sie bilden die Schnittstelle zwischen Blut und Gewebe und zeichnen sich durch luminalen und abluminalen Oberflächen. Das Endothel ist eine vielfältige, aktive und adaptive System, die Durchblutung, Nährstoff Menschenhandel, Immunität und das Wachstum neuer Blutgefäße Schiffe¹reguliert. Im Körper gibt es endotheliale Zellen normalerweise in einem Umfeld, wo sie die Reibungskraft der Zirkulation, Schubspannung²ausgesetzt sind. Scherspannung ist ein wichtiger Regulator der Endothelzellen Gen Ausdruck