Neuartige Methoden für intranasale Verabreichung unter Inhalation Anästhesie auszuwertende Nase zu Gehirn Drug Delivery

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir zwei neuartige Methoden der stabile intranasale Verabreichung unter Inhalation Anästhesie mit minimaler körperlicher Belastung für die Versuchstiere. Wir beschreiben auch eine Methode zur quantitativen Bewertung der Droge-Verteilung-Spiegel im Gehirn über die Nase zu Gehirn Weg mit radioaktiven [¹⁴C]-Inulin als Modell Substrat von wasserlöslichen Makromolekülen.

Zusammenfassung

Intranasale Verabreichung wurde berichtet, um einen möglichen Weg für die Nase-zu-Gehirn-Lieferung von Therapeutika werden, die die Blut - Hirn-Schranke umgeht. Allerdings gab es einige Berichte über nicht nur die Quantitative Analyse, sondern auch die optimale Verwaltung Bedingungen und Dosierung Therapien für Untersuchungen von Nase zu Gehirn Lieferung. Die geringen Fortschritte in der Forschung auf Nase, Gehirn Weg Mechanismen mit Nagetieren stellt eine erhebliche Behinderung in Bezug auf die Gestaltung von Nase zu Gehirn-Delivery-Systeme für Kandidat Drogen.

Um einige Fortschritte in dieser Hinsicht zu gewinnen, haben wir entwickelt und evaluiert zwei neuartige Methoden der stabilen intranasale Verabreichung unter Inhalation Anästhesie für Versuchstiere. Wir beschreiben auch eine Methode für die Bewertung der Droge-Verteilung-Spiegel im Gehirn über die Nase zu Gehirn Weg mit Radio-Label [¹⁴C]-Inulin (Molekulargewicht: 5.000) als Modell Substrat von wasserlöslichen Makromolekülen.

Zunächst entwickelten wir eine Pipette-basierte intranasale Verabreichung-Protokoll unter Verwendung vorübergehend öffenbare Masken, die ermöglicht, zuverlässige Verabreichung an Tiere unter stabilen Anästhesie durchführen. Mit diesem System [¹⁴C]-Inulin an das Gehirn mit wenig experimentellen Fehler übermittelt werden konnten.

Wir haben anschließend eine intranasale Verabreichung Protokoll mit umgekehrter Kanülierung seitens der Atemwege durch die Speiseröhre, die entwickelt wurde, zur Minimierung der Auswirkungen von Mucociliary Clearance (MC) entwickelt. Diese Technik führte zu einer deutlich höheren [¹⁴C]-Inulin, die quantitativ in den Riechkolben, Großhirn und Medulla Oblongata, als die Pipette Methode entdeckt wurde. Dies scheint da Eigentumsvorbehalt der Wirkstofflösung in der Nasenhöhle durch aktive Administration über eine Spritzenpumpe in Richtung gegenüber der MC in der Nasenhöhle deutlich erhöht wurde.

Abschließend können die beiden Methoden der intranasale Verabreichung entwickelt in dieser Studie voraussichtlich sehr nützliche Techniken für die Bewertung der Pharmakokinetik bei Nagetieren. Die umgekehrte Kanülierung Methode könnte insbesondere für die Bewertung des vollen Potenzials von Nase zu Gehirn Lieferung von Wirkstoffkandidaten nützlich sein.

Einleitung

Biopharmaka wie Peptide, Oligonukleotide und Antikörper werden als mögliche Anwendung als neuartiger Therapeutika für feuerfeste Zentralnervensystem Störungen haben, die derzeit keine kurative Therapie. Da die meisten Biopharmaka wasserlösliche Makromoleküle sind, ist Lieferung aus dem Blut in das Gehirn Über intravenöse oder orale Verabreichung jedoch extrem schwierig, da die Impedanz der Blut - Hirn-Schranke (BBB).

In den letzten Jahren wurde intranasale Verabreichung berichtet, einen möglichen Weg für die Nase-zu-Gehirn-Lieferung von Therapeutika, die die BBB^1,2,3,4,5vermeidet. Allerdings gab es relativ wenige Berichte über die Quantitative Analyse von Nase zu Gehirn Weg Lieferung⁶. Darüber hinaus gab es praktisch keine Berichte über etablierte optimale Verwaltung Bedingungen und Dosierung Therapien, wie Lautstärke, Zeiten, Fristen und Geschwindigkeit, für Untersuchungen von Nase zu Gehirn Lieferung. Die genannten Mängel können aus folgenden Gründen zugeschrieben werden: (i) eine optimale Methode der intranasale Verabreichung für Mäuse muss noch festgelegt werden, und (Ii) intranasale Verwaltung durch pipettieren, die in der Regel verwendet wird, zeichnet sich in der Regel durch interindividuelle Unterschiede zwischen den Tieren aufgrund Mucociliary Clearance (MC), führt dabei häufig zu Unterschätzungen von Nase zu Gehirn Realerfüllung Potenzial eines bestimmten Medikaments.

Inhalation Anästhesie mit Isofluran (Einleitung: 4 %, Wartung: 2 %) mit einer Inhalation Maske für Nager erlangt hat weit verbreiteten Einsatz, mit dem Ziel der Verringerung oder Beseitigung der Schmerzen im Zusammenhang mit Operation an Versuchstieren durchgeführt. Die Verwendung von Masken macht es relativ einfach, typische Medikamentengabe bei Versuchstieren Narkose Einatmen über die subkutane, intraperitonealen und intravenösen Routen durchführen. Die Maske muss jedoch bei der intranasale Verabreichung von den Tieren für Medikamentengabe vorübergehend entfernt werden. Mit Wartung unter 2 % Isofluran, Tiere erwachen in der Regel rasch aus der Inhalation Narkose. Wenn die Verwaltung Volumen pro Dosis groß ist, könnte dadurch die Wirkstofflösung aus der Nasenhöhle in die Speiseröhre fließen, und daher eine einzelne große Dosis müssen möglicherweise in mehrere kleinere Dosen für intranasale Verabreichung an kleine zerlegt werden Tiere. Wie intranasale Verabreichung Maske entfernen für wiederholte Anwendung und ausreichend Zeit für die nachhaltige Nasenhöhle Lieferung erfordert, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, die Mäuse bei der Verwaltung aus der Narkose erwachen würde. Dies macht es sehr schwierig, intranasale Verabreichung unter Narkose stabil durchzuführen und wahrscheinlich trägt zu der beobachteten interindividuelle Variation von Nase zu Gehirn Lieferung unter Nagetieren.

In dieser Studie entwickelten wir daher zwei neuartige Methoden der stabilen intranasale Verabreichung unter Inhalation Anästhesie, die minimalen körperliche Belastung auf Versuchstiere zu verhängen. Für die erste Methode benutzten wir eine vorübergehend öffenbare Maske, die intranasale Verabreichung während der Inhalation Anästhesie ermöglicht. Die öffenbare Teil der Maske enthält einen Silikon-Stecker, der nach Verwaltung Timing verwendet werden kann, um stabile intranasale Verabreichung mit einer Pipette zu erleichtern. Für die zweite Methode eine Kanüle wurde operativ eingefügt, um vom Ösophagus in die Nasenhöhle gelangen und eine Spritzenpumpe wurde dann dazu befestigt, so dass die Wirkstofflösung direkt und zuverlässig in die Nasenhöhle unter stabilen Inhalation zugestellt werden konnte Anästhesie. Diese Methode kann die Abgabe von Medikamenten in das Gehirn über die Nase zu Gehirn-Route verbessern, weil erheblich minimieren die Auswirkungen von MC, Droge retentively in der Nasenhöhle verbessert werden würde. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Bewertung der Droge Verteilerebenen (% der injizierten Dosis/g Gehirn) im Gehirn mit Radio-Label [¹⁴C] quantitativ-Inulin [Molekulargewicht (MW): 5.000] als Modell Substrat von wasserlöslichen Makromoleküle.

Protokoll

Dieses Tiere-Studie (#AP17P004) erfolgte gemäß den Richtlinien durch die Nihon Universität Animal Care and Use Committee (Tokio, Japan) genehmigt. Diese Studie (#17-0001) wurde von Radioisotopen-Zentrum der School of Pharmacy an der Nihon Universität zugelassen.

(1) für intranasale Verabreichung unter Inhalation Anästhesie verwendeten Tiere

1. Haus der experimentellen Mäuse in Edelstahl-Käfigen unter einem 12 h hell/dunkel-Zyklus (Licht auf 08:00 – 20:00), mit kontrollierter Temperatur auf 23 ± 1 ° C, Luftfeuchtigkeit von 50 % ± 10 %, und Ad Libitum Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten.
2. Vor dem Experimentieren betäuben Sie die Mäuse durch Einatmen von 2 % Isofluran, folgende Einleitung in einer Konzentration von 4 %. Bestätigen Sie das erforderliche Maß an Anesthetization durch das Verschwinden der Oberfläche aufrichtenden gesucht.

2. Zubereitung der Verwaltung

1. Bereiten Sie eine Lösung von [¹⁴C]-Inulin (50 μM, 0,5 μCi/mL per Mausklick) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung verdünnen und bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.

(3) intranasale Verwaltungen für Mäuse

1. Mikropipette Methode mit einer vorübergehend öffenbare Inhalationsmaske (Abbildung 1()
   Hinweis: Diese Technik ist eine Modifikation des Protokolls intranasale Verabreichung mit einer Mikropipette festgelegten Frey Et al. ³
   1. Beheben Sie Mäuse in Rückenlage auf einer Pinnwand durch Abkleben ihre Glieder unter Inhalation Betäubung mit 2 % Isofluran (Abbildung 1A).
   2. Verabreichen Sie einem Gesamtvolumen von 25 μl Lösung in 30 s Abständen über 1-2 μL Dosen alternativ in die linke und Rechte Nase verabreicht, während die Mäuse unter Inhalation Anästhesie (Abbildung 1 b und C) befestigt sind an jeder Maus.
   3. Hinweis: Abfall betäubende Gas durch aktive Beförderungsmittel (Rauch Haube, harte Abluft Biosafety Kabinett, Vakuum, etc.) aufgeräumt ist, wenn die Maske geöffnet wird und durch passive Maßnahmen (Narkose Abgas Kanister) in geschlossenem
2. Reverse Kanülierung m ethode seitens der Atemwege durch die Speiseröhre (Abbildung 2( )
   Hinweis: Diese Technik ist eine Modifikation des Protokolls intranasale Absorption für Ratten festgelegten Hirai Et al. ⁷
   1. Mäuse in Rückenlage auf einer Pinnwand durch Abkleben ihre Glieder mit 2 % Isofluran Inhalation Narkose zu beheben.
   2. Haare im Nacken ist rasiert und desinfiziert über Betadine oder Chlorhexidin Anwendung, gefolgt von einer Alkohol spülen.
   3. Setzen Sie die Luftröhre und die Speiseröhre durch den Ausbau der Haut unterhalb der Kehle mit der Pinzette nach einen kleinen Einschnitt (1,5 cm) mit einer Schere.
   4. Machen Sie einen Einschnitt (1 mm) in die Luftröhre mit einer Schere.
   5. Legen Sie eine Kanüle (Innendurchmesser: 0,58 mm, Außendurchmesser: 0,965 mm) auf eine Länge von 1,2 cm und befestigen Sie das entgegengesetzte Ende der Kanüle an der Innenseite der die Inhalationsmaske.
   6. Einen Einschnitt (1 mm) in der Speiseröhre mit einer Schere machen, legen Sie eine Kanüle (Innendurchmesser: 0,28 mm, Außendurchmesser: 0,61 mm) auf eine Länge von 1,4 cm auf den hinteren Teil der Nasenhöhle, und verbinden (Abb. 2A und B).
      Hinweis: Prozeduren 3.2.2 bis 3.2.4 wurden unter eine stereoskopische Mikroskop bei × 10 Vergrößerung durchgeführt.
   7. Legen Sie eine Nadel (27 × 1/2) auf eine 1-mL-Spritze mit einer Lösung gefüllt und an eine programmierbare Mikro-Spritzenpumpe anschließen.
   8. Verbinden Sie über Nadel an der Kanüle, die in die Speiseröhre bei 3.2.5 (Abbildung 2) eingelegt hatte.
   9. Verwalten von einem Gesamtvolumen von 25 μL [¹⁴C]-Inulin-Lösung mit einer konstanten Rate (5 μl/min) (Abbildung 2 und 2D).

4. quantitative Experiment mit Radio-Label wasserlösliche Makromoleküle ([¹⁴C]-Inulin)

1. Enthaupten Sie die experimentellen Mäuse unter Narkose und öffnen Sie ihre Schädel, mit einer Schere und von der Seite der Medulla Oblongata, während kümmert sich nicht um das Gehirn zu schädigen.
2. Extrahieren Sie sorgfältig das ganze Gehirn durch schöpfen mit einem Mikro-Spatel vom Schädel.
3. Ort ein Filterpapier befeuchtet mit Kochsalzlösung auf eine Petrischale, die auf dem Eis gespeichert ist.
4. Legen Sie die extrahierten Gehirne auf feuchtes Filterpapier.
5. Wischen Sie Blut haften an der Oberfläche des Gehirns mit einem Wattestäbchen, befeuchtet mit Kochsalzlösung, den Einfluss von [¹⁴C] mindestens zu beseitigen-Inulin im Blut auf der Oberfläche des Gehirns.
6. Sezieren Gehirne schnell, und in drei Teile unterteilen: den Riechkolben, Großhirn und Medulla Oblongata (einschließlich der Pons).
7. Legen Sie Gehirn Proben in Gewebe Lösungsvermittler bei 50 ° C für 1 h.
8. Das Gehirn Proben 10 μL der liquid funkeln cocktail hinzugefügt werden.
9. Übertragen Sie eine 25 μL Aliquot der Verwaltung-Lösung im Funkeln cocktail zu einem Funkeln Fläschchen zu bestimmen, die Radioaktivität der angewandte Lösung aufgelöst.
10. Messen der Zerfall pro Minute [¹⁴C] Radioaktivität in der Gehirn-Probe ([¹⁴C] X_Gehirn) und die angewandte Lösung ([¹⁴C] X_{IN Dosis}) in ein flüssiges Szintillationszähler ausgestattet mit einer geeigneten Crossover-Korrektur für ³H und ¹⁴C.

(5) Datenanalyse

1. Berechnen Sie die Droge Verteilerebenen (%) für die injizierte Dosis (ID %) unter Verwendung der folgenden Gleichung:
   ID % ⁄g Gehirn = ([¹⁴C] X_Gehirn/ [¹⁴C] X_Dosis) × 100,
   wo X_Gehirn (Dpm/g Gehirn) ist der Betrag von [¹⁴C] - Inulin gemessen im Hirngewebe und X_{IN Dosis} (Dpm/25 μl-Lösung) ist die Konzentration von [¹⁴C] - Inulin in der Lösung für intranasale Verabreichung verwendet.

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt die [¹⁴C]-Inulin Ebenen (ID % ⁄g Gehirn) in den Riechkolben (A), Großhirn (B) und Medulla Oblongata (C) erhalten mit den beiden Arten der intranasale Verabreichung in der vorliegenden Studie bewertet. Intranasale Verabreichung mit der Pipette Methode aktiviert [¹⁴C]-Inulin in das Gehirn mit Hilfe von öffenbare Inhalation Masken (Abbildung 1). Unter Inhalation Anästhesie offenbart die quanti...

Diskussion

Die Nase-zu-Gehirn-Abgabe von Medikamenten wird voraussichtlich eine ausgeprägte Wirkung auf Erkrankungen des zentralen Nervensystems haben, weil dieser Weg eine direkte Transportroute darstellt, die die BBB umgeht. Datum⁸wurden drei verschiedene Nase zu Gehirn Wege beschrieben. Der erste ist der Riechnerv Weg, die von der olfaktorischen Schleimhaut in der Nasenschleimhaut auf Vorderhirn über den Riechnerv übergeht. Die zweite ist den Trigeminus-Weg von der respiratorischen Schleimhaut in der Nase...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ddY Maus	Japan SLC, Inc.		Männlich, 4-6 Wochen, 20-30 g
Isofluran	Pfizer	v002139
Isofluran setup	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-OTAir, SN-489-4
Isofluran-Maske	SHINANO Manufacturing CO. LTD.		Für kleine Nagetiere
Isofluran-Maske (aufklappbarer Typ)	SHINANO Manufacturing CO. LTD.		Sonderbestellungen
Anästhesiebox	SHINANO manufacturing CO., LTD.	SN-487-85-02
Tierversuchsschere-1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
Tierversuche Schere-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-13H
Pinzette-1	FINE SCIENCE TOOLS Inc.	11272-30	Dumont #7 Dumoxel
Pinzette-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	A-12-1
Kanülenschlauch (PE-50)	Becton, Dickinson und Company.	5069773	Innendurchmesser: 0,58 mm, Außendurchmesser: 0,965 mm
Kanülenröhrchen (SP-10)	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	ID: 0,28 mm, AD: 0,61 mm
Rasierer	MARUKAN, LTD.	DC-381
Stereoskopisches	Mikroskop Olympus Corporation	SZ61
Nadel 27G 1/2 Zoll 13 mm	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
1 mL Spritze	TERUMO CORPORATION	SS-01T
Spritzenpumpe	Neurowissenschaften	NE-1000
Zellulosemembran	Toyo Roshi Kaisya, Ltd.
Mikrospatel	Shimizu Akira Inc.	91-0088
Mikropipette (0,5-10 μl)	Eppendorf AG	Z368083
Pipettenchip	Eppendorf AG	0030 000.811
Band	TimeMed Beschriftungssystem, Inc.	T-534-R	Zur Fixierung von Maus
[14C]-Inulin	American Radiolabeled Chemicals Inc.	ARC0124A	0,1 mCi/ml
EtOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-00461
Flüssigszintillationszähler	Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc	Tri-Carb 4810TR