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Echtzeit-Visualisierung und Analyse der Knorpelzelltransplantation Verletzungen aufgrund der mechanischen Belastung in völlig intakt murinen Knorpel Explantaten

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DOI:

10.3791/58487

⸱

7. Januar 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Arthrose, genetische Faktoren und/oder verschiedenen laden-Therapien die Verwundbarkeit der in Situ Chondrozyten auswirken.

Zusammenfassung

Homöostase der Gelenkknorpel hängt die Lebensfähigkeit der ansässigen Zellen (Chondrozyten). Leider kann mechanische Trauma weit verbreitete Knorpelzelltransplantation Tod, möglicherweise führend zu irreversiblen Ausfall des Gelenks und der Beginn der Arthrose auslösen. Darüber hinaus ist die Wartung der Knorpelzelltransplantation Rentabilität wichtig osteochondrale Transplantation Verfahren für optimale chirurgische Ergebnisse. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen synovialen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann in vergleichenden Studien verwendet werden, um zu untersuchen, die Auswirkungen der unterschiedlichen mechanischen Belastungen Regimen, verschiedenen Umweltbedingungen oder genetische Manipulationen sowie verschiedenen Stufen der Knorpel-Degeneration auf kurz- bzw. langfristigen Anfälligkeit von in-situ artikuläre Chondrozyten. Das Ziel des Protokolls eingeführt in das Manuskript soll die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche der murinen synovialen Gelenke zu beurteilen. Wichtig ist, ermöglicht diese Methode testen auf völlig intakte Knorpel ohne native Randbedingungen. Darüber hinaus ermöglicht es Echtzeit-Visualisierung von entscheidender gefärbten artikuläre Chondrozyten und einzelne Image-basierte Analyse der Zelle Verletzung durch Anwendung der kontrollierten statisch und Auswirkungen laden Therapien induziert. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass im gesunden Knorpel Explantaten die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung Ausmaß und die Auswirkungen der Belastungsintensität sensibel abhängt. Unsere Methode kann leicht angepasst, um die Auswirkungen der unterschiedlichen mechanischen Belastungen Regimen, verschiedenen Umweltbedingungen oder verschiedenen genetischen Manipulationen auf die mechanischen Anfälligkeit von in Situ artikuläre Chondrozyten zu untersuchen sein.

Einleitung

Gelenkknorpel (AC) ist eine tragende Gewebe, das bedeckt und schützt Knochen in synovialen Gelenke, eine reibungslose gemeinsame Artikulation. Gewebe-Homöostase ist abhängig von der Lebensfähigkeit der Chondrozyten, der einzige Zelltyp mit Wohnsitz in AC. Jedoch kann Exposition des Knorpels zu extremen Kräfte aufgrund Trauma (z.B., fällt, Fahrzeug-Unfall oder Sport-Verletzungen) oder Post-traumatische Gelenkinstabilität Knorpelzelltransplantation Tod, führt zu irreversiblen Ausfall des Gelenks (Arthrose) induzieren. 1. Darüber hinaus in osteochondrale Transplantation Verfahren, die darauf abzielen, lokale Defekte in Knorpelschäden zu reparieren, Transplantat einfügen-assoziierten mechanische Trauma reduziert Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit und hat nachteilige Auswirkungen auf die chirurgischen Ergebnisse2.

Knorpel Explant Modelle werden häufig verwendet, um die Anfälligkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten mechanisch induzierte Zelltod zu studieren. Diese Modelle verwenden in der Regel Explantaten von großen Tieren Studie zu den Auswirkungen des Ladens Bedingungen, Umgebungsbedingungen und anderen Faktoren auf Zelle Schwachstelle3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Diese Modelle erfordern jedoch aufgrund der Größe der native Gelenke, in der Regel Entfernung eines Steckers aus der Gelenkfläche ein intaktes Gelenk, dabei Kompromisse bei der nativen Randbedingungen. Darüber hinaus ist sie in der Regel großen mechanischen Belastungen auf Zelle Verletzung zu induzieren. Alternativ bieten murinen Knorpel Explant Modelle mehrere Vorteile gegenüber größeren Tiermodellen bei der Untersuchung der mechanischen Anfälligkeit der in Situ Chondrozyten. Diese Modelle erleichtert vor allem aufgrund ihrer kleineren Abmessungen, Prüfung von voll intakten Gelenkknorpel ohne nativen Gewebe Integrität zu verändern. Darüber hinaus laden der murinen Knorpel erfolgt über kleine Kontaktflächen, sodass Knorpelzelltransplantation Tod/Verletzung mit kleinen Lasten induziert werden kann (< 1 N). Schließlich ist die Maus Genom leicht manipuliert und ermöglicht Tests wie bestimmte Gene Auswirkungen die Anfälligkeit in Situ Chondrozyten gegen mechanische Verletzungen.

Das übergeordnete Ziel der Methode eingeführt, in diesem Manuskript ist zu quantifizieren und visualisieren-in real-time-die räumliche Ausdehnung der in Situ Zelle Tod/Verletzungen durch mechanische Belastungen auf völlig intakt Maus Knorpel-Knochen explants in Vitro. Diese Methode erfordert sorgfältige Präparation der Maus synovialen Gelenke ohne Kompromisse bei der Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit, gefolgt von mechanische Prüfung von äußerst gefärbten Explantaten mit einem Mikroskop montierte Gerät ähnlich wie eine Testplattform, die wir vor kurzem entwickelt murine Knorpel mechanischen Eigenschaften16zu quantifizieren. Während mechanische Prüfung, ist ein Großteil der (intakt) Gelenkfläche des Knochens seziert sichtbar auf einem einzigen Fluoreszenz Schliffbild, ermöglicht schnelle Analyse der Zellviabilität, nachdem eine Last angewendet wird. Eine ähnliche Analyse der Oberfläche Zellviabilität in murinen Knorpel Explantaten wurde zuvor, aber ohne gleichzeitige Anwendung der Last17durchgeführt. Mögliche Anwendungen unserer Methode sind vergleichende Studien untersuchen die Verwundbarkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten an verschiedenen kontrollierten Umwelt- und mechanischen sowie Screening von Behandlungen, die zur Verringerung der Empfindlichkeit der Chondrozyten auf mechanische Belastung.

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Protokoll

Alle tierische Arbeit wurde von der University of Rochester Ausschuss für Tier-Mittel zugelassen.

(1) Lösungen

  1. Bereiten Sie Hank es ausgewogen Salzlösung (1 X HBSS), enthält Kalzium, Magnesium und kein Phenol-rot. Einstellen Sie den pH-Wert 7,4 durch Zugabe geringer Mengen von HCl oder NaOH.
  2. Passen Sie die Osmolarität zu 303 mOsm durch Zugabe von NaCl oder deionisiertes Wasser. Verwenden Sie den Puffer während Sezierungen, Probenvorbereitung und mechanische Prüfungen.

(2) Sezierungen des distalen Femur und der proximalen Humerus mit voll intakten Gelenkknorpel

  1. Einschläfern Sie die Maus nach institutionellen Richtlinien mit einer CO2 Inhalation Kammer gefolgt von zervikale Dislokation. Aseptischen Technik im ganzen zu folgen.
    Hinweis: Mäuse zwischen 8 und 81 Wochen alt von jedem Stamm und Geschlecht können verwendet werden.
  2. Verwenden Sie die folgenden chirurgischen Werkzeuge für Sezierungen: Mikro-Schere (verwendet für die Herstellung von Inzisionen), standard sezierenden Schere (verwendet für das Schneiden von Knochen), Skalpell mit #11 Skalpellklinge (zum Schneiden von weichem Gewebe verwendet), Juwelier Zange (verwendet für die Entfernung von weichen Gewebe) und standard Pinzetten (verwendet für das Schälen der Weichteile und der Haut).
  3. Folgen Sie für Sezierungen des distalen Femur den Anweisungen unten.
    1. Positionieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage.
    2. Machen Sie einen kleinen (ca. 5 mm)-Schnitt in der Haut auf dem vorderen Teil des Knies.
    3. Erweitern des Schnittes ganz um das Knie und ziehen Sie die Haut um die Knie Gelenk und Bein Muskeln freizulegen.
    4. Ausgehend von dem proximalen Ende des Oberschenkelknochens, verwenden Sie eine Skalpellklinge (#11) entlang der distale Richtung schneiden. Positionieren Sie das Messer zwischen die Quadrizeps-Muskel-Sehnen-Einheit und die vordere Seite der femoral Welle. Erweitern Sie den Schnitt in Richtung und vorbei an der Patella und abschließend schneiden durch die Mitte der Patellasehne, wodurch die Quadrizeps-Muskel-Sehnen-Einheit.
    5. Ausgehend von dem proximalen Ende des Oberschenkelknochens, verwenden Sie eine Skalpellklinge (#11) entlang der distale Richtung schneiden. Positionieren Sie das Messer zwischen die Kniesehne-Muskel-Sehnen-Einheit und die hintere Seite der femoral Welle. Sobald der Schnitt des Kniegelenks nähert, beginnen Sie schneiden durch das Weichgewebe, Vermeidung des Kontakts zwischen dem Skalpell und der Gelenkfläche auf den distalen Kondylen des Femurs. Beenden Sie den Schnitt vorbei an das Kniegelenk.
    6. Ziehen Sie den Quadrizeps und Kniesehne Muskeln um den Oberschenkelknochen verfügbar zu machen. Schneiden Sie jede überschüssige Muskel an den lateralen und medialen Seiten des Oberschenkelknochens.
    7. Schneiden Sie die Wadenmuskulatur auf der hinteren Seite der proximalen Tibia und drehen Sie das Bein um die hintere Seite des Oberschenkelknochens zu visualisieren.
    8. Setzen Sie die distalen Kondylen des Oberschenkels und des hinteren Oberfläche der proximalen Tibia durch entfernen überschüssiges Gewebe um das Kniegelenk.
    9. Schneiden Sie die vordere und hintere Kreuzband mit einem Skalpell schneiden Weg von der femoralen Kondylen. Ziehen Sie die Tibia von Femur und schneiden Sie der Bänder um die Unterschenkel aus dem Oberschenkelknochen zu trennen.
    10. Mit standard sezierenden Schere, Schnitt durch das Femur am proximalen Ende des Knochens (8 mm oberhalb der tibiofemoralen-femorale Gelenk) aus der lateralen Seite. Nach dem Schneiden des Knochens, wischen Sie alle sichtbaren Knochenmark auf der Außenseite des Knochens zur Vermeidung von möglichen Kontaminationen von Knochenmarkzellen.
      Hinweis: Schneiden von lateralen Seite reduziert das Risiko von Rissausbreitung entlang des Knochens.
    11. Entfernen Sie umgebenden Weichteile (d.h., Bänder und überschüssige Muskel) aus dem Oberschenkelknochen mit Juwelier Pinzette und Aussetzen des Knorpels auf beide Kondylen am distalen Ende des Oberschenkelknochens. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen den Knorpel und Zange.
  4. Folgen Sie für Sezierungen des Humerus den Anweisungen unten.
    1. Positionieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage.
    2. Einen Einschnitt (~ 5 mm) in der Haut auf der hinteren Seite des Ellenbogens mit Mikro-Schere machen, den Schnitt rund um den Ellenbogen zu verlängern und ziehen Sie die Haut um die Muskeln von Arm und Schulter verfügbar zu machen.
    3. Ausgehend von dem proximalen Ende des Humerus, verwenden Sie eine Skalpellklinge (#11) entlang der distale Richtung schneiden. Positionieren Sie die Klinge zwischen den Trizeps-Muskel-Sehnen-Einheit und der hinteren Seite des Humerus. Den Schnitt am distalen Ende des Humerus zu verlängern und durch Durchtrennung der Sehne Trizeps beenden.
    4. Dann ziehen Sie den Trizeps am proximalen Ende des Humerus bis des Humeruskopfes ausgesetzt ist.
    5. Schneiden Sie das Bindegewebe um die Humeruskopfes mit einem Skalpellklinge (#11) ohne Berührung der Gelenkfläche und entfernen Sie die Gliedmaßen (Arm und Schulter) aus dem Körper zu. In regelmäßigen Abständen die Gelenkfläche des Humeruskopfes mit HBSS-Hydrat.
    6. Der Arm trennen Sie der Oberarmknochen durch erste Abbruch das proximale Ende der Ulna auf der hinteren Seite des Armes mit Zange und schneiden dann das Bindegewebe um das distale Ende des Humerus. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe am Humerus.
    7. Der Deltamuskel Tuber auf der hinteren Seite des Humerus mit standard sezierenden Schere abgeschnitten.
  5. Setzen Sie einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit HBSS Puffer seziert soll(en).

3. live (Calcein AM) / Toten (Propidium Jodid) Färbeprotokoll

  1. Fleck mit Calcein AM wie folgt.
    1. Machen Sie eine Stammlösung von Calcein AM durch Zugabe von 12,5 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in ein Fläschchen mit 50 µg von Calcein AM, was zu einer Lager Konzentration von 4 mg/mL (4,02 mM).
    2. Verdünnen Sie das Lager Calcein Lösung 1: 400 in HBSS zu einer Konzentration von 10 µg/mL (10,05 µM) von Kalzium AM (z. B. hinzufügen 1,25 µL der Stammlösung 500 µL HBSS).
    3. Zentrifugieren der verdünnten Färbelösung für 5 s bei 2.000 x g um sicherzustellen, dass alle des Farbstoffs, die gelegentlich an den Wänden des Schlauches halten kann, vermischt mit dem Puffer. Entfernen Sie den Überstand nicht. Vortex: die Lösung für die richtige Mischung zu gewährleisten.
    4. Ein 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL der verdünnten Färbelösung sezierte Probe umgesetzt. Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 30 min in einem Thermomixer beim Rühren bei 800 u/min. Sicherstellen Sie, dass die Rohre in Alu-Folie zum Schutz vor Lichteinfall bedeckt sind.
    5. Übertragen Sie das Exemplar in Calcein AM freien HBSS Puffer. An dieser Stelle ist die Probe für die mechanische Prüfung bereit.
  2. Bereiten Sie Propidium Jodid (PI) Färbelösung wie folgt vor.
    1. Bereiten Sie die PI Färbelösung durch Verdünnung der gekauften Stammlösung (1 mg/mL, 1, 5 mM) 01:25 in HBSS, 40 µg/mL (60 µM) von PI zu erreichen. Fügen Sie 40 µL der Stammlösung zum Beispiel HBSS 1000 µL hinzu.
    2. Halten Sie die PI Färbelösung in Alu-Folie abgedeckt, um es vor Lichteinfall zu schützen. Verwenden Sie die Färbelösung unmittelbar nach der mechanischen Prüfung um verletzten Zellen (siehe Abschnitt 4) zu erkennen.
      Hinweis: Man kann durchführen, die PI-Färbung vor der Verladung sowie zu strenger Beurteilung der Qualität von den Sektionen.

4. mechanische Testprotokoll

  1. Die Probe (Femur und Humerus) auf der Glas-Folie von einer benutzerdefinierten Mikroskop montierte mechanische Prüfeinrichtung zu platzieren, so dass die Gelenkfläche auf dem hinteren femoral Kondylen oder Humeruskopfes auf dem Glas (Abbildung 1 sitzt).
    Hinweis: Befestigen Sie einen 10 mm langen hölzernen Applikator (Durchmesser = 2 mm) auf der distalen Seite des Humerus mit Cyanacrylat-Klebstoff bevor sie auf dem Gerät platziert, um die Probe auf die flache Oberfläche zu stabilisieren. Für eine detaillierte Beschreibung der mechanischen Testplattform siehe ergänzende Datei 1: Abschnitt 1.
  2. Die Probe mit HBSS Hydrat und stellen Sie das Gerät mit der Probe auf dem Fluoreszenzmikroskop.
  3. Die artikuläre Chondrozyten mit Calcein AM gebeizt Bild (Anregung/Emission Wellenlängen = 495/515 nm) vor (Baseline) Anwendung der Last unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem 4 X trocknen Objektiv (NA = 0,13). Einstellungen Sie die Übernahme-um die Bildqualität zu optimieren.
  4. Gelten Sie mechanische laden auf die Probe, so dass Gelenkknorpel gegen das Deckglas komprimiert wird.
    1. Gelten Sie für die statische Aufladungeine vorgeschriebene statische Belastung (z. B.0,5 N) auf die Probe (Femur und Humerus). Halten Sie die Last für 5 min und dann entfernen.
    2. Auswirkungenbeantragen Sie eine vorgeschriebene Schlagenergie (z.B. 1 mJ) auf die Probe durch Fallenlassen einer zylindrischen Impaktor bekanntes Gewicht (z.B.0,1 N) aus einer vorgeschriebenen Höhe (z.B. 1 cm). Lassen Sie die Last 5 s nach dem Aufprall.
      Hinweis: Das Gewicht der Impaktor (mg) und der vorgeschriebenen Höhe (h) kann umgebaut werden Aufprall-Energie (E) unter Verwendung der folgenden Gleichung: E = Mgh.
  5. Inkubieren Sie das Exemplar in PI Färbelösung für 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Die artikuläre Chondrozyten mit Calcein AM gebeizt Bild und PI (Anregung/Emission Wellenlängen = 535/617 nm) unter dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2).

(5) Datenanalyse

  1. Bereich der verletzten/toten Zellen durch die angewandte mechanische Belastung-Therapie zu quantifizieren.
    1. Öffnen Sie die Aufnahmen von der Gelenkfläche erworben vor und nach Anwendung der mechanischen Belastung in ImageJ18.
    2. Kombinieren Sie die Bilder in einem Stapel.
    3. Legen Sie den Maßstab der Bilder basierend auf die Bildauflösung.
    4. Verwenden Sie das Polygon -Werkzeug, um den Bereich zu definieren, wo die Zellen Calcein-negativ (Verlust der grünen Fluoreszenz) und PI-positiv (plus rote Fluoreszenz) wurde. Diese Zellen werden als verletzt oder tot sein.
    5. Ermitteln Sie Bereich der verletzten/toten Zellen mit dem Messwerkzeug .

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Ergebnisse

Sechs verschiedene angewendet laden Protokolle (statische Aufladung: 0,1 N, 0,5 N und 1 N für 5 min; und Stoßbelastung: 1 mJ, 2 mJ und 4 mJ) reproduzierbar induzierte quantifizierbare lokalisierte Bereichen der Zelle Verletzung im femoralen und Humerus Knorpel von 8-10 Wochen alten BALB/c Mäuse (erhalten ( Abbildung 2). Wichtig ist, wurde die räumliche Ausdehnung der Knorpelzelltransplantation Verletzungen auf die Gelenkfläche schnell und einfach in ImageJ ge...

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Diskussion

Die oben beschriebenen Methoden wurden erfolgreich eingesetzt, um tragfähige und verletzten/Toten in Situ artikuläre Chondrozyten aus Maus Gelenke nach mechanischen Belastungen oder Auswirkungen vorgeschrieben zu visualisieren. Insbesondere konnten wir die mechanischen Anfälligkeit der Chondrozyten innerhalb voll intakten Gelenkknorpel aus zwei verschiedenen synovialen Gelenke zu analysieren: das Kniegelenk (distalen Oberschenkelknochen) und Schulter (Humeri). Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die rä...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten Dr. Richard Waugh und Luis Delgadillo danken für die großzügige Verwendung von ihre pH-Meter und XR. Darüber hinaus möchte die Autoren Andrea Lee danken für Ihren Beitrag an die anfängliche Entwicklung der mechanischen Testsystem. Diese Studie wurde von NIH P30 AR069655 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Calcein, AM Invitrogen von Thermo Fisher ScientificC3100MP20x50mg , Eugene, OR, USA
PropidiumiodidInvitrogen von Thermo Fisher ScientificP35661 mg/ml Lösung in Wasser, 10 ml, Eugene, OR, USA
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich2768551L DMSO, wasserfrei, ≥ 99,9%, St. Louis, MO, USA
HBSS (Calcium, Magnesium, kein Phenolrot)  Gibco by Thermo Fisher Scientific14025-092 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Chirurgische Klinge aus Feder (#11)VWR102097-822Hatfield, PA, USA
Dampfdruckosmometer, VAPROELITechGroupModell 5520Puteaux, Frankreich
pH-Messgerät BeckmanModell Phi 32 Brea, Kalifornien, Vereinigte Staaten von Amerika
Eppendorf Thermomixer Eppendorf AG Modell 5350Hamburg, Deutschland
Motorisiertes inverses ForschungsmikroskopOlypmusModell IX-81Center Valley, PA, USA
HolzapplikatorPuritan Medical Products Company, LLC8076"x100, Guilford, ME, USA
1,5 GlasdeckgläserWarner Instruments, LLC64-1696#1,5, 0,17 mm dick, 40 mm Durchmesser, Hamden, CT, USA

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