Methodenartikel

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

DOI:

10.3791/58502

⸱

29. Oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Method Development and Analytics, Agroscope, 2Swiss Tropical and Public Health Institute, 3University of Basel, 4Swiss Federal Plant Protection Service, Federal Office for Agriculture, 5OptiGene Limited, 6Fera Science Limited, 7School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 8Department of Plants and Plant Products, Agroscope

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Papier berichtet das Protokoll für eine schnelle Identifizierung Assay für Tabak Tabaci basierend auf Loop-vermittelten isothermen (Lampe)-Verstärkungstechnologie. Das Protokoll erfordert minimal Labor Ausbildung und kann, daher, an Grenzübergangsstellen für Pflanze Importe wie Seehäfen und Flughäfen vor Ort umgesetzt werden.

Zusammenfassung

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Die Mottenschildläuse Tabak Tabaci (Gennadius) ist eine invasive Schädling von erheblicher Bedeutung, Auswirkungen auf die Produktion von Gemüse und Zierpflanzen Nutzpflanzen in vielen Ländern auf der ganzen Welt. Schwere Ertragsverluste entstehen durch direkte Fütterung, und noch wichtiger, auch durch die Übertragung von mehr als 100 schädliche Pflanze pathogenen Viren. Wie für andere invasive Schädlinge erleichtert mehr internationalen Handel die Ausbreitung von B. Tabaci auf Bereiche jenseits der heimischen Bereich. Kontrollen der Anlage importieren Produkte an Grenzübergangsstellen wie Seehäfen und Flughäfen gelten daher als eine wichtige Präventionsmaßnahme. Diese letzte Verteidigungslinie gegen die Pest Invasionen ist jedoch nur wirksam, wenn schnelle Identifizierungsmethoden für verdächtige Insekten Exemplare verfügbar sind. Da die morphologische Differenzierung zwischen regulierten B. Tabaci und nahe Verwandte ohne Quarantänestatus für nicht-Taxonomen, eine schnelle Identifizierung molekularer Assay anhand der Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (schwierig ist Lampentechnologie) wurde entwickelt. Diese Publikation berichtet das ausführliche Protokoll der neuartigen Assays beschreiben schnelle DNA-Extraktion, Aufbau der Lampe Reaktion und Interpretation seiner auslesen, wodurch B. Tabaci Exemplare innerhalb einer Stunde zu identifizieren. Im Vergleich zu bestehenden Protokolle zum Nachweis von spezifischen B. Tabaci Biotope, die entwickelte Methode richtet sich an die gesamte B. Tabaci Arten Komplex in einem Assay. Außerdem soll der Test vor Ort durch Pflanzen Gesundheitsinspektoren mit minimal Labor Ausbildung direkt an Grenzübergangsstellen angewendet werden. Gründliche Überprüfung durchgeführt unter Labor- und vor-Ort-Bedingungen zeigt, dass die gemeldeten Lampe-Assay eine schnelle und zuverlässige Identifizierung Werkzeug ist, Verbesserung des Managements von B. Tabaci.

Einleitung

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Die Mottenschildläuse Tabak Tabaci (Gennadius) ist eine invasive Insekt-Schädling beeinflussen die Ausbeute an vielen wirtschaftlich wichtige Kulturpflanzen wie Zierpflanzen, Gemüse, Körnerleguminosen und Baumwolle1,2. Neben Schäden durch direkte Phloem-Fütterung schadet der Homopteran Arten Pflanzen indirekt durch die Ausscheidung von großen Mengen von Honigtau auf die Oberflächen von Blättern und Früchten, sowie durch die Übertragung von zahlreichen Pflanzen pathogenen Viren1 , 3 , 4. jüngste genetische Studien zum Vergleich von DNA-Sequenzen von mitochondriale Gene Cytochrom c Oxidase 1 (COI) ergab, dass B. Tabaci eine Art ist Komplex von mindestens 34 Morphocryptic Arten3,4. Zwei sehr invasiv und schädlichen Mitglieder innerhalb dieses Komplexes, Biotyp B aus dem Nahen Osten und der asiatischen kleinere Region sowie Biotyp Q mit Ursprung aus dem mediterranen Raum, haben weltweit durch internationalen Handel zerstreut worden Aktivitäten mit pflanzlichen Produkten, insbesondere durch den Transport von Zierpflanzen1,5,6. Wegen seines weltweit Pest die International Union for Conservation of Nature und Natural Resources (IUCN) B. Tabaci als eines der "weltweit 100 schlimmsten invasiver gebietsfremden Arten" und Mitglieder der Gattung komplexe sind regulierte Organismen durch viele Länder1,3,4.

In der Europäischen Union (EU) ist die Pflanze Gesundheit Richtlinie 2000/29/EG Anhang 1AI B. Tabaci entnehmen Sie als ein Quarantäne-Organismus, deren Einführung von nicht-EU-Ländern und deren Verbreitung innerhalb der EU sind,4verboten. Eine wichtige Präventionsmaßnahme gegen die Ausbreitung von Quarantäneorganismen ist die Prüfung von Pflanzenversand an Grenzübergangsstellen (POEs) wie z. B. Flug- und Seehäfen7,8. Im Fall ein Quarantäne-Organismus gefunden wird, die nationalen Pflanze Schutz Organisation (NPPO) verantwortlichen entweder zurückweisen oder Behandlung (einschließlich Zerstörung) der befallenen Versand9vorgeht. Inspektion der Importe oft Offiziere haben jedoch nicht die taxonomische Expertise, genau zu identifizieren, die große Auswahl an Schädlingsarten Welthandel9zugeordnet. Vor allem die Identifizierung von unreifen Lebensphasen (z. B. Eier und Larven) ohne deutliche morphologische Schlüssel ist praktisch unmöglich, für nicht-Taxonomen8,9,10. Infolgedessen um Umsetzung von Quarantänemaßnahmen mit minimaler Verzögerung zu ermöglichen, ist ein Bedarf an Alternativen und schnelle vor-Ort-Identifikation-Assays9.

Eine Kandidat-Methode ist die Loop-vermittelten isothermen DNA-Amplifikation (Lampe) Technologie, die vor kurzem gezeigt hat, eine geeignete Technologie zur Identifizierung der Pflanze Krankheitserreger11,12,13. Lampe ist sehr spezifisch, weil die Methode mindestens zwei Grundierung Paare erkennen sechs unterschiedliche DNA Ziel Sequenzen14verwendet. Aufgrund der DNA-Strang Übersprungshandlung von Bst -DNA-Polymerase werden Lampe Reaktionen unter isothermen Bedingungen14durchgeführt. Daher, im Gegensatz zu herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Tests es besteht keine Notwendigkeit für eine Thermocycler13,14. Ein weiterer Vorteil gegenüber PCR-basierten Tests ist ihre Widerstandsfähigkeit gegen potentielle Inhibitoren in der DNA-Extrakt, umgehen die Notwendigkeit für eine DNA-Reinigung Schritt13. Aufgrund des Protokolls Geschwindigkeit und Einfachheit kann die Lampe sogar unter Bedingungen vor Ort mit einem tragbaren, batteriebetriebenen Echtzeit-Erkennung Gerät8,15durchgeführt werden.

Eine Lampe-Assay wurde als Reaktion auf die Nachfrage für eine schnelle vor-Ort-Bestimmung-Methode für B. Tabaci8entwickelt. Das übergeordnete Ziel war, ein Protokoll zu entwickeln, die von Pflanzen Gesundheitsinspektoren mit begrenzten Labor Ausbildung durchgeführt werden kann. Ein starker Fokus setzte daher auf die Optimierung der Geschwindigkeit und Einfachheit des Protokolls. Während bestehende diagnostische Tests in der Regel für die Identifizierung von einem oder mehreren Biotopen von B. Tabacientwickelt wurden, die neuartige Lampe Assay deckt den gesamten B. Tabaci Arten komplexe8,16,17 ,18. Das Problem der ausgeprägte genetische innerhalb Taxon Vielfalt des Komplexes wurde durch Kombinationen von verschiedenen Primer-Sets und die Anwendung von degenerierten Primern8gelöst. Roman B. Tabaci Lampe Assay ist so konzipiert, dass die Primer ein Fragment am 3' Ende der mitochondrialen COI gen8Ziel. Dieses Gen stellt ein geeignetes Ziel für tierischen diagnostische Proben, weil es Regionen birgt konserviert ausreicht, um diagnostische Sensitivität für eine bestimmte Art, während anspruchsvolle genug zwischen eng Organismen19, 20. Darüber hinaus das COI-gen dient oft als einen genetischen Marker in Bevölkerung genetische Studien sowie eine Signatur-Sequenz in DNA-Barcoding Analysen, was zu zahlreichen DNA-Sequenz Einträge in open-Source-Datenbanken wie z. B. GenBank und BOLD21 ,22. Neben den öffentlich zugänglichen COI Sequenzen von B. TabaciCOI Sequenzen aus eng verwandten Arten (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton Aceris, Aleurodicus Dugesii, Tabak spp. [N = 3], Neomaskellia Andropogonis, Tetraleurodes Acaciaeund Trialeurodes spp. [N = 4]) wurden in die besser gekleideteres Design dieser Studie aufgenommen und verwendet, um diagnostische Sensitivität und Spezifität in Silico8 bewerten .

Aufgrund der Genauigkeit der Methode, seine Geschwindigkeit (< 1 h) und der Einfachheit des Protokolls, der Test hat gezeigt, dass geeignet für vor-Ort-Anwendung, wenn als Teil der Prozedur der Import in einem Schweizer POE8implementiert werden.

Protokoll

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1. Vorbereitungen

  1. Aliquote der DNA Extraktion Lauge vorbereiten.
    1. Produzieren einen Vorrat an DNA Extraktion Lauge mit molekularen Grade Wasser ergänzt mit 600 µM Kalilauge (KOH) und 2 µM Cresol Red.
      Achtung: KOH ist eine starke Basis in Wasser aufgelöst. Vermeiden Sie Leckagen, und Haut und Augenkontakt.
    2. 30 µL DNA Extraktion Lauge (vorbereitet in Schritt 1.1.1) in 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und speichern Sie die Aliquote bei 4 ° C.
      Hinweis: Verwenden Sie die regelmÄÑig DNA-Extraktion-Lösung innerhalb von 1 Jahr.
  2. B. Tabaci positive Amplifikationskontrolle (PAC) vorbereiten.
    1. PCR-Amplifikate der Lampe Ziel DNA-Fragment zu erzeugen.
      Hinweis: Eine Einführung in die allgemeinen PCR-Prinzipien und Praktiken wird von Lorenz23gegeben.
      1. Synthetisieren oder erhalten die Primer C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 ") und TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ') ein Fragment der mitochondrialen COI gen24,25verstärken.
      2. Einrichten der PCR-Reaktion, wie in Tabelle 1beschrieben. DNA-Extrakt zu verwenden (siehe Punkt 2.1) einer Referenz B. Tabaci Probe als DNA-Vorlage.
        Hinweis: Optional ist es möglich, die B. Tabaci DNA für die PAC mit einem kommerziellen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
      3. Programmieren einer Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 15 min bei 95 ° C; 45 Zyklen von 40 s bei 95 ° C, 15 s bei 45 ° C, Rampen über 60 s bis 60 ° C, 2 min bei 72 ° C; 7 min bei 72 ° C; bei 4 ° c zu halten
      4. Reinigen Sie das PCR-Amplifikationsprodukt mit einem kommerziellen PCR Aufräum Kit laut Protokoll des Herstellers und eluieren Sie Endprodukt in molekularen Grade Wasser.
      5. Eine kommerzielle Kit mit DNA-verschuppen Farbstoff verwenden, um die DNA-Konzentration von PCR-Amplifikationsprodukt gemäß den Anweisungen des Herstellers messen und verdünnen mit molekularen Grade Wasser zu einer Konzentration von 1 ng / µL. speichern Sie die verdünnte PCR-Amplifikation Produkt als PAC-Stammlösung bei-20 ° C.
        Hinweis: Verwenden der PAC-Stammlösung innerhalb von 1 Jahr.
      6. Ergänzen die PAC-Stammlösung (in Schritt 1.2.1.5 vorbereitet) mit 0,6 µM KOH und verdünnen mit molekularen Grade Wasser zu einer Konzentration von 5 x 10-3 ng / µL. Lagern Sie das Produkt bei 4 ° C.
        Hinweis: Verwenden Sie die PAC innerhalb von 5 Stunden für die Zubereitung von der Ready-to-Use B. Tabaci Lampe Kits im nächsten Schritt beschrieben.
  3. Vorbereitung Ready-to-Use B. Tabaci Lampe Kit (Protokoll für 20 Einheiten)
    1. Verwendung Schere 8-Röhre Lampe Streifen in zwei 4-Rohr-Lampe-Streifen schneiden.
    2. Beschriften Sie die Rohre der 4-Rohr Lampe Streifen nach dem Schema in Abbildung 1dargestellt.
    3. B. Tabaci Lampe Reaktion Mastermix (Protokoll für 80 Reaktionen) vorzubereiten.
      1. Fügen Sie 1195.1 µL der Ready-to-Use GspSSD isothermen master-Mix (mit GspSSD Polymerase, Pyrophosphatase, Magnesiumsulfat, Deoxynucleotides, Doppelstrang binden DNA bindenden Farbstoff) und 717.4 µL B. Tabaci Lampe Grundierung mischen, um eine 2 mL Microcentrifuge Schlauch. Kurz Vortex und Puls Zentrifuge.
      2. 22,5 µL B. Tabaci Lampe Reaktion Mastermix (vorbereitet in Schritt 1.3.3.1.) in jedes Rohr 4-Rohr Lampe Streifen (vorbereitet in Schritt 1.3.1) und Puls Zentrifuge zu verzichten.
    4. Vortex B. Tabaci Lampe PAC (vorbereitet in Schritt 1.2) schnell und Puls zentrifugieren. Fügen Sie dann 2,5 µL in das Röhrchen beschriftet mit "PAC" von jeder 4-Rohr-Lampe-Streifen (Abbildung 1).
    5. Enge Deckel und laden die Ready-to-Use B. Tabaci Lampe kit Einheiten bei-20 ° C.
      Hinweis: Verwenden sie innerhalb von 1 Jahr.

2. vor-Ort-Lampe Analyse

  1. DNA-Extraktion
    1. Verwenden Sie sterilen Zahnstocher um die Insekten Exemplare in 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, enthält 30 µL DNA Extraktionslösung (vorbereitet in Schritt 1.1.2) übertragen.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Insekten in die Extraktionslösung eingetaucht sind.
    2. Inkubieren Sie die Proben 5 min bei 95 ° C in einem Thermomixer (300 u/min). Kurz Vortex und Puls Zentrifuge.
  2. B. Tabaci Lampe assay
    1. Tauwetter ein Ready-to-Use B. Tabaci Lampe Kit in Schritt 1.3 vorbereitet. Vortex schnell und Puls-Zentrifuge.
      Hinweis: Mit jedem Kit ist es entweder möglich, zwei verschiedene Exemplare zu testen oder das DNA-Extrakt ein Exemplar in zweifacher Ausfertigung zu analysieren.
    2. Fügen Sie 2,5 µL Probe DNA-Extrakt (in Schritt 2.1 vorbereitet) in die Röhrchen mit der Bezeichnung "S1" und "S2" von der Ready-to-Use B. Tabaci Lampe Kit (Abbildung 1).
    3. Fügen Sie 2,5 µL reine DNA-Extraktion Lauge (vorbereitet in Abschnitt 1.1) in das Rohr mit der Bezeichnung "NAC" für die negative Amplifikationskontrolle (Abbildung 1).
    4. Wirbel der Ready-to-Use B. Tabaci Lampe kit schnell und Impuls-Zentrifuge.
    5. Einfügen der Ready-to-Use B. Tabaci Lampe kits in das Analysegerät Lampe (mit Echtzeit-Fluoreszenzmessung) oder eine Real-Time PCR-Plattform und eine isothermische DNA Verstärkung Analyse bei 65 ° C für 60 min durchführen.
    6. Messen die Schmelztemperaturen des DNA-Amplifikationsprodukte durch Erhitzen bis 98 ° C mit einem anschließenden Kühlung Schritt (Rampe Rate von 0,05 ° C/s) auf 75 ° C, während der Messung der Fluoreszenz in Echtzeit.
  3. Lampe-Assay auslesen
    1. Überprüfen Sie das Auslesen der Lampe wie folgt manuell.
      1. Wenn DNA-Erweiterungen für die Probe und der PAC gemessen wurden, keine DNA-Verstärkung für die NAC gemessen wurde, und die Anlasstemperatur die Amplifikationsprodukte waren 80,0 bis 85,5 ° C, sollten Sie die Lampe Ergebnisse als positiv (Abbildung 2).
      2. Wenn es keine DNA-Verstärkung für die Proben (z. B. Rohre beschrifteten S1 und S2) aber für PAC und NAC dann die Lampe Ergebnis als betrachten negativ (Abbildung 2).
      3. Wenn DNA Verstärkung für die Proben gemessen wurde, aber die annealing Temperaturen entsprechender Verstärkung Produkte außerhalb der Reichweite 80,0 \u2012 85,5 ° C waren und/oder PAC keine DNA-Amplifikation gab und/oder NAC eine DNA-Amplifikation gab, betrachten Sie die Lampe Ergebnis als UNGÜLTIG (Abbildung 2).
    2. Optional, überprüfen Sie die Lampe auslesen mit der Lampe Validierung Anwendung (zusätzliche Datei 1).
      1. Zielarten und definieren Sie die Anzahl der untersuchten Proben. Klicken Sie auf "Bericht erstellen" .
      2. Das Auslesen zu übertragen (DNA Verstärkung Ja/Nein, Ausglühen Temperatur Amplifikationsprodukt führt von PAC und NAC) aus der vor-Ort-Analyse Leuchtgerät oder Echtzeit-PCR-Plattform, um die entsprechenden Eingabefelder der Validierung Anwendung. Das Ergebnis der Validierung wird sofort nach Eingabe der Daten angezeigt.

Ergebnisse

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Während der Validierung des B. Tabaci Lampe Assays wurden Insekt Exemplare, die im Zuge der regulären Schweizer Import Control abgefangen analysierten8. Die Proben stammten aus acht verschiedenen Ländern (Kanarische Inseln, Dominikanische Republik, Israel, Malaysia, Marokko, Singapur, Thailand und Vietnam) und die genetische Vielfalt der B. Tabaci finden Sie unter europäischen POEs8widerzuspiegeln. Alle Lampe Ergebnisse wurden durch DNA-Barcoding8Kreuz validiert.

Von insgesamt 80 Proben analysiert von Lampe 75 Exemplare (93,8 %) waren korrekt identifiziert als B. Tabaci (wahr-positive), zwei Exemplare (2,5 %) wurden nicht als B. Tabaci (True-negative) und drei Proben (3,8 %) korrekt identifiziert wurden zu Unrecht nicht als B. Tabaci (falsch-negative) (Tabelle 2)8. Die korrigieren-Negative Ergebnisse stammen aus zwei Trialeurodes Vaporariorum Exemplare, ein nicht-regulierte Arten mit hohem Risiko zu verwechseln mit B. Tabaci auf POEs Werk Produkte8. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die folgenden Messungen der diagnostischen Genauigkeit berechnet: test Spezifität (True Negative Rate), 100 %; Testen Sie Empfindlichkeit (True Positive Rate), 96,2 %; Testen Sie Effizienz (Prozentsatz der korrekten Testergebnisse), 96,3 % (Tabelle 2)8. Bei der Beurteilung der analytischen Sensitivität (Nachweisgrenze) verstärkt die B. Tabaci Lampe Assay erfolgreich Probe DNA verdünnt, um 100 fg/µL über drei technische Wiederholungen (Tabelle 3).

Eine Teilmenge der Assays (N = 13) wurde von Pflanze Gesundheitsinspektoren mit der Ready-to-Use B. Tabaci Lampe Kits8unter Bedingungen vor Ort am Flughafen Schweizer POE Zürich durchgeführt. Beim Kreuz in das Referenzlabor validiert, fanden sich alle Ergebnisse von der vor-Ort-Prüfung korrekt zu sein (testen Sie Effizienz = 100 %)8. Bewertung der vor-Ort-Lampe-Assay-Leistung, war die durchschnittliche Zeit für Positive (Zeit bis eine positive Ergebnisse war verfügbar) 38,4 ± 10,3 min. (Mittelwert ± Standardabweichung)8. Eine repräsentative DNA Amplification Plot und die entsprechenden Glühen Ableitung aus einem B. Tabaci Lampe Analyse durchgeführt unter Bedingungen vor Ort sind in Abbildung 3A und Bgezeigt. In diesem Beispiel Beispiel eins und zwei wurden korrekt identifiziert als B. Tabaci gekennzeichnet durch DNA-Amplifikation nach ca. 30 min (Abbildung 3A) zusammen mit den erwarteten annealing Temperaturen bei ca. 82 ° C (Abb. 3 b).

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Abbildung 1: Visualisierung der Versuchsaufbau eine Ready-to-Use B. Tabaci Lampe Kit im Protokoll beschrieben. S1, Beispiel 1; S2, Beispiel 2; PAC, positive Amplifikationskontrolle; NAC, negative Amplifikationskontrolle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2: Lampe Auslesen Validierung Schema. PAC: positive Verstärkung Kontrolle; NAC: negative Amplifikationskontrolle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3: DNA-Amplifikation Grundstück (A) und Glühen Ableitung (B) eine B. Tabaci Lampe Analyse unter Bedingungen vor Ort durchgeführt. Fluoreszenz wurde in relative Intensität Einheiten gemessen. Grüne Linie, Beispiel 1; Orange Linie, Beispiel 2; blaue Linie, negative Amplifikationskontrolle (NAC); rote Linie, positive Amplifikationskontrolle (PAC). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

KomponenteLager Konz.Letzte Reaktion Konz.Volumen pro Reaktion
Taq Polymerase Master Mix2 x1 x10 ΜL
Grundierung C1-J-219520 ΜM0,4 ΜM0.4 ΜL
Grundierung TL2-N-301420 ΜM0,4 ΜM0.4 ΜL
Molekularen Klasse Wasser--8.2 ΜL
DNA-Vorlage--1 ΜL

Tabelle 1: Vorbereitung der PCR-Reaktion Mastermix für die B. Tabaci positive Amplifikationskontrolle. Komponenten und Konzentrationen benötigt zum Einrichten einer PCR-Reaktion. Das endgültige Reaktionsvolumen ist 20 µL. Primer-Sequenzen in 1.2.1.1 gezeigt werden.

NNTPNFPNTNN-FNSEN (%)SPE (%) EFF (%)
807502396,210096,3

Tabelle 2: Ergebnisse der B. tabaci Lampe-Assay-Validierung. N Anzahl der Analysen; NTP, Anzahl der wahr-Positive Ergebnisse; NFP, Anzahl der falsch-positiven Ergebnissen; NTN, Anzahl der wahr-negativen Ergebnisse; NFN, Anzahl der falsch-Negative Ergebnisse; SEN, diagnostische Sensitivität; SPE, diagnostische Spezifität, EFF, Testeffizienz.

C-DNA (fg/µL)N-PR T-P (min)
(Mittelwert ± SD)		 TA (° C)
(Mittelwert ± SD)
1 x 105 333.5 ± 2,981,3 ± 0,1
1 x 10-4 330,7 ± 1,181 ± 0.0
1 x 10-3 340,4 ± 3,981,1 ± 0,1
1 x 10-2 350,7 ± 1,681,1 ±0.1
1 x 101 0--
1 x 100 0--

Tabelle 3: analytische Empfindlichkeit (Nachweisgrenze) von der B. Tabaci Lampe Assay. Jeder Verdünnung wurde in Triplicates getestet. C-DNA, DNA-Konzentration pro Reaktion; N-PR, repliziert Anzahl positiver; TP, Zeit, bis ein positives Ergebnis zur Verfügung stand; TA, Ausglühen Temperatur; SD, Standardabweichung.

Diskussion

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Die Möglichkeit, genau erkennen potenziell schädliche Organismen ohne zeitliche Verzögerung stellt einen wichtigen Aspekt für die Verwaltung der Schädling Arten9,10,26. Abgesehen davon, dass schnelle, für die Pflanze Importprodukte, sollte eine ideale Pest Identifikation Methode einfach vor Ort bei POEs8,26durchzuführen. Dieses Papier berichtet das Protokoll eines neuartigen Lampe-Assays für die schnelle Identifizierung von B. Tabaci, ein Insekt Quarantäneorganismus häufig an den europäischen Grenzen (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt abgefangen _annual-Bericht-_2016.pdf).

Die Beweggründe für die Entwicklung des diagnostischen Tests war es, eine easy-to-Follow-Protokoll zu entwerfen, die während der Prozedur der Pflanze Import von Pflanzen Gesundheitsinspektoren mit minimal Labor Ausbildung durchgeführt werden kann. Um vor-Ort-Tests als schnell und einfach wie möglich zu machen, ist das Protokoll, die Vorbereitung eines Ready-to-Use-Kit und die tatsächliche Leistung der Lampe Assay zweigeteilt. Der erste Teil kann in einem externen Labor durchgeführt werden, so dass die Pflanze Gesundheitsinspektor DNA-Extraktion und Lampe Assay mit nur einem Pipettieren Schritt vor Ort durchführen kann.

Aber können nur ein Schritt, Pipettieren kleinere Flüssigkeitsmengen Herausforderung für Anwender mit wenig oder gar keine Laborerfahrung sein. Um dieses Problem zu beheben, wird ein Farbstoff (Cresol rot) die Extraktionslösung hinzugefügt, so dass der Bediener visuell bestätigen kann, dass die kleine Menge (d. h. 2,5 µL) der DNA mit dem jeweiligen Rohr richtig übertragen wird. Eine weitere wichtige Vereinfachung des Protokolls ist die Validierung-Anwendung, wie es eine verlässliche Interpretation der Lampe auslesen (ergänzende Datei 1) erleichtert.

Roman B. Tabaci Lampe Assay ist unter Labor- und vor-Ort-Bedingungen validiert worden, durch die Prüfung Insekt Proben während den regulären Import Regelvorgang der Schweiz8abgefangen. Insgesamt wurden 80 Exemplare aus drei Kontinenten Afrika, Eurasien und Nordamerika, von Lampe analysiert. Die 80 Exemplare waren nur drei (3,8 %) falsch identifizierten (falsch-negative)8. Bei der Analyse der Primer-Ziel-DNA-Sequenzen der falsch-negativen Proben ergab, dass sie neue B. Tabaci Haplotypen waren, die bisher nicht beschriebene8gewesen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde B. Tabaci Lampe Grundierung Satz modifizierte und erfolgreich wieder validierten8.

Eine erhebliche Einschränkung der DNA Verstärkung-basierte Methode einschließlich Lampe ist, dass sie nur vordefiniertes Ziel DNA-Sequenzen8,27identifizieren. Ein umfassendes Wissen über die genetische Variation gefunden in der Zielsequenz Grundierung ist daher entscheidend für die diagnostische Genauigkeit8,27zu gewährleisten. Diese Informationen ist jedoch oft sehr begrenzt, insbesondere bei neu auftretenden Pest Arten8. Obwohl selten, sind falsch-Negative Ergebnisse verursacht durch Mutationen in der Zielsequenz erwarteten8. Im Falle der vorliegenden B. Tabaci Lampe Assay ist eine Lösung für dieses Problem die Kombination mit einer DNA-Barcoding-basierte Technologie, eine Strategie, die im Zuge der Umsetzung dieser diagnostischen Tests im POE Zürich Flughafen8realisiert. Hier wurden alle Lampe-Negative Ergebnisse von DNA-Barcoding in einem externen Labor8neu analysiert. Für den Fall, dass ein neuer Schädling Haplotyp noch nicht beschrieben angetroffen wird, können die Lampe-Primer mit der DNA-Sequenz erzeugt in dem Barcoding Prozess8geändert werden. Dabei wird der daraus resultierende Verlust der Geschwindigkeit im Falle eines negativen Ergebnisses der Lampe für die maximale diagnostische Genauigkeit gewährleistet in diesem zweistufigen Verfahren8kompensiert.

Die Einrichtungskosten für die aktuelle Lampe Assay an einem POE sind ca. USD 25.000. Mit der zunehmenden Zahl von Lampentests für Pflanzenschädlinge (z. B. Erwinia Amylovora, Flavescence Dorée und Guignardia Citricarpa) entwickelt, erscheint eine einmalige Investition gerechtfertigt13,15, 28. jedoch konnte das Protokoll möglicherweise geändert werden, um diese Kosten noch weiter zu reduzieren. Zum Beispiel könnte für die DNA-Extraktion Schritt bei 95 ° C Thermo-Mixer hier verwendet durch eine weniger teure Wasserbad oder von diesem Schritt direkt in die Echtzeit-Lampe-Gerät ersetzt werden. Darüber hinaus die Rührschüssel Schritte auf den Wirbel wahrscheinlich durch manuell flicking die Röhren ersetzt werden könnte, und in der DNA-Transfer Schritt könnte die Pipette durch sterile Impfösen ersetzt werden.

Zukünftige Verbesserungen für eine schnelle Identifizierung von B. Tabaci und Pest Spezies könnte im Allgemeinen eine Implementierung eines vor-Ort-Sequenzierung-Ansatzes, die DNA Barcoding Analysen an POEs erlauben würde. Ein vielversprechender Kandidat System für solche Implementierung ist die Nanopore-Sequenzierung-Technologie. In der Tat wurde die Technologie im vor-Ort-DNA Barcoding Bemühen um die Artenvielfalt ein Regenwald8,29,30bewerten vor kurzem erfolgreich umgesetzt. Ein vor-Ort-DNA-Barcoding-Identifikationssystem kann vollständig ersetzen, die Notwendigkeit für die Entwicklung von zielgerichteten diagnostischen Tests und deren Validierung. Auch ermöglicht es, zusätzliche Informationen über Pest Eigenschaften wie Pestizid-Resistenz-Gene8sammeln. Dennoch bis neuartiger Sequenziertechnologien routinemäßig umgesetzt werden, B. Tabaci Lampe Assay stellt eine schnelle (< 1 h) und genaue Identifizierung Methode.

Offenlegungen

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Der Autor Michael Andreou ist Gesellschafter von OptiGene Limited, die Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Artikel verwendeten produziert. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren sind dankbar, dass Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun und Sven Moeller für die Teilnahme an der Validierung des B. Tabaci Lampe Assays.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B. tabaci LAMP GrundierungsmischungOptiGene Ltd.auf AnfrageZur Aufbereitung von
read-to-use B. tabaci LAMP Kit
Zentrifuge MiniSpinEppendorf AG5452000010Für mehrere Zentrifugationsschritte
Kresolrot (roter Farbstoff)Sigma-Aldrich Corp.114472Bestandteil
DNA-Extraktionslösung
Eppendorf ThermoMixerEppendorf AG5382000015Für die DNA-Extraktion
Genie II (Vor-Ort-LAMP-Analysegerät)OptiGene Ltd.Genie® IIFür die LAMP-Analyse
Genie Strips (8-Rohr-LAMP-Streifen)OptiGene Ltd.OP-0008-50Zur Herstellung von
read-to-use B. tabaci LAMP kit
HotStarTaq Master MixQiagen AG203443Zur Erzeugung von Positiv
Amplifikationskontrolle
Labcycler (Thermocycler)SensoQuest GmbH,
vertrieben von Witec AG		011-103Für die DNA-Extraktion
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermer MastermixOptiGene Ltd.ISO-001LNLZur Vorbereitung von
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Mini-Zentrifuge Labnet PrismLabnet International Inc.C1801Für mehrere Zentrifugationsschritte
NucleoFast 96 PCRMarcherey-Nagel GmbH743500.4Für die Aufreinigung von positiv
Amplifikationskontrolle
KaliumhydroxidlösungSigma-Aldrich Corp.319376Bestandteil
DNA-Extraktionslösung
Qbit Fluorometer 3Thermo Fisher Scientific Corp.Q33226Zur Messung der DNA-Entration
von Positivkontrollen
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32854Zur Reinigung von Positiv
zur Kontrolle der Amplifikation
Safe-Lock Röhrchen 0,5 mL (Mikrozentrifugenröhrchen)Eppendorf AG0030 121.023Für die DNA-Extraktion
Safe-Lock Röhrchen 2,0 mL (Mikrozentrifugenröhrchen)Eppendorf AG0030 120.094Zur Vorbereitung von
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Holz ZahnstocherVWR International LLC470226-594Für die DNA-Extraktion
Vortex-Genie 2 (Vortex)Scientific Industries Inc.SI-0236Für mehrere Mischschritte

Referenzen

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  1. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
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