Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Zusammenfassung

Die Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut zu gezielten peripheren Geweben ist entscheidend für den Entzündungsprozess bei Gewebeverletzungen, Tumorentstehung und Autoimmunerkrankungen. Dies wird durch einen Prozess der Aufnahme von freien Informationsfluss auf der luminalen Oberfläche des aktivierten Endothelzellen, gefolgt von ihrer Haftung und Transendothelial Migration (Seelenwanderung) in das darunter liegende Gewebe der betroffenen erleichtert. Allerdings sind die Mechanismen, die die bevorzugte und Kontext-abhängige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unterstützen noch nicht vollständig verstanden. Daher haben wir eine Methode entwickelt, die ermöglicht die Einstellung von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig visualisiert und unter Strom gemessen werden. Diese Methode, basierend auf Time-Lapse confocal Imaging ermöglicht die eindeutige Unterscheidung zwischen Anhänger und transmigrated Monozyten. Hier beschreiben wir, wie diese Methode verwendet werden kann, um gleichzeitig die Rekrutierung Kaskade von Pro-angiogenen und nicht-angiogenen Monozyten in-vitro-Studie. Darüber hinaus kann diese Methode erweitert werden, um die verschiedenen Schritte der Rekrutierung von bis zu drei Monocyte Populationen zu studieren.

Einleitung

Monozyten bilden eine phagocytic Komponente der angeborenen Immunität, die wichtig für die Bekämpfung von Krankheitserregern, Bereinigen von beschädigtem Gewebe, Angiogenese und der Pathophysiologie von vielen Krankheiten, einschließlich Krebs^1,2,3 . Monozyten sind Knochenmark gewonnenen Zellen bestehend aus heterogener Subpopulationen, die im Blut zirkulieren, aber können an den Ort der Entzündung im peripheren Gewebe durch spezifische molekulare Mechanismen rekrutiert werden. Die Rekrutierung Kaskaden von Monozyten, wie bei Leukozyten impliziert in der Regel verschiedene Schritte einschließlich der Erfassung, Rollen, krabbeln, Verhaftung, Transendothelial Migration (Seelenwanderung) und Migration durch die Gefäßwand (Basalmembran und Wandbild Zellen)⁴. Diese Schritte beinhalten vor allem Entzündungen-induzierte Moleküle auf der endothelialen luminalen Oberfläche z. B. Selectins Glykoprotein Liganden, Chemokine, Knoten und interzelluläre Adhäsionsmoleküle und ihre Rezeptoren auf Leukozyten wie Selektin-Liganden und Integrine. Handel Wege über entweder die Endothelzellen Kreuzungen (parazellulär) oder über die endotheliale Zellkörper (transzelluläre) lässt sich die endotheliale Barriere⁵überqueren von Leukozyten. Während Monozyten historisch dokumentiert worden sind, um durch die transzelluläre Route transmigrate wurden mögliche Unterschiede in ihren wandernden Weg da Monozyten nicht mehr als eine homogene Zellpopulation gelten vorgeschlagen. Es wird jetzt klar, dass Monocyte Vielfalt kann von jedem ihrer Unterschiede und Gemeinsamkeiten definiert werden, in Bezug auf ihre unverwechselbare Extravasation Kaskaden^3,6. Daher, um eindeutig zwischen Monocyte Subpopulationen unterscheiden, ist es entscheidend, zu visualisieren und Phänotyp das Verhalten der einzelnen von diesen verschiedenen Subpopulationen während der Rekrutierung verarbeiten.

Monozyten von Mensch, Schwein, Ratte und Maus waren unterteilt in phänotypischen Subpopulationen mit bestimmten zugeschriebenen Funktionen und spezielle wandernden Verhaltensweisen^7,8,9. Beispielsweise können beim Menschen, Monozyten drei Teilmengen basierend auf deren Oberflächenexpression von CD14, ein Coreceptor für bakterielle Lipopolysaccharid und CD16, den Fc-Gamma-Rezeptor III unterteilt werden. Menschliche Monocyte Subpopulationen gehören klassische CD14⁺CD16^-, Mittelstufe CD14⁺CD16⁺ und nicht-klassischen CD14^dimCD16^{+ 6,9}Zellen. Die klassische CD14⁺CD16^– Monozyten erwiesen sich vor allem entzündliche während der Pool von CD16⁺ Monozyten fanden sich kollektiv TIE2 Ausdruck und Proangiogenic Funktion¹⁰zu präsentieren. Konsequent, Endothelzellen Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen wie menschliche Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α oder Interleukin (IL-1) Beta (konventionelle Entzündung) ist ausreichend, um die komplette Einstellung von klassischen CD14 auslösen⁺CD16 ^– Monozyten. Simultane Aktionen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) A und TNF (angiogenen Faktoren angetrieben Entzündung) sind jedoch erforderlich, um die Seelenwanderung die CD16 provozieren⁺ Proangiogenic Pool von Monozyten³. Historisch gesehen, das traditionelle Transwell-System unter statischen Bedingungen, die parallelen Platten Strömungsraum und die µ-Folie Fluss Kammern wurden verwendet, um quantitativ zu analysieren, die Rekrutierung von Leukozyten eine Bevölkerung an eine Zeit in-vitro-^{11 ,12,13}. Während diese Protokolle validiert wurden, würde eine robustere Methode, die erlaubt die simultane Analyse von mehreren Monocyte Subpopulationen einsichtsvolleren betrachtet werden. Solche Methoden müssen mehrere Interaktionen und die unterschiedlichen Frequenzen jedes jeweiligen Bevölkerung ausmachen und auch bieten ein mechanistisches Verständnis für die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten für die Rekrutierung-Kaskaden, die jede Monocyte definieren Teilmenge.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode basiert auf der Time-Lapse Bildgebung der Monocyte Rekrutierung durch fließen, wodurch die wandernden Kaskaden von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig untersucht werden, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Diese Methode integriert bestimmte kritische Funktionen, die Endothelzellen Entzündung sowie die Hämodynamik des zirkulierenden Monozyten in Post-Kapillaren Venolen, am Hauptstandort der Leukozyten Rekrutierung in vivo zu imitieren. Die vorgeschlagene Methode verwendet menschliche Nabelader Endothelzellen (HUVECS), die durch ein etabliertes Protokoll der Isolation von menschlichen Nabelschnur erzeugt werden. Diese klinische Ressource hat den Vorteil des Seins leicht zugänglich als Nebenprodukt biologischer, während auch eine vernünftige Rendite von Endothelzellen, die von der Nabelader isoliert werden können. Wir auch zur Fluoreszenz-Farbstoffen und Immunfluoreszenz Unterscheidung der verschiedenen zellulären Komponenten und konfokalen Mikroskopie eindeutig definieren Monocyte Positionierung (luminalen vs. abluminalen) im Laufe der Zeit. Die hier vorgestellten Protokoll wurde gleichzeitig messen die Seelenwanderung Ebenen der Monocyte Subpopulationen entwickelt. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass diese Methodik auf um andere Leukozyten-Subpopulationen und Einstellungsverfahren zu studieren erweitert werden kann, durch Einsatz von verschiedenen Biomarker und Kennzeichnung.

Protokoll

Mit der Einwilligung von freiwilligen Spendern und in Übereinstimmung mit den schweizerischen Ethikkommissionen zur klinischen Forschung wurden menschliche Materialien verwendet.

1. Isolierung und Einfrieren der menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS)

1. Fügen Sie 5 mL der Beschichtungslösung vor Einleitung eines HUVECS Isolierung T75 Kolben (0,1 mg/mL Kollagen G und 0,2 % Gelatine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PBS-Puffer bei pH 7,4) für 30 min bei 37 ° C hinzu.
2. Reinigen Sie die Schnur mit PBS zu, wischen Sie es mit sterilen Kompressen und legen Sie sie in einen sterilen 20 cm Petrischale. Kürzen Sie die Enden der Schnur mit einer sterilen Schere.
3. Identifizieren Sie die einzigen großen Vene und zwei kleinen Arterien. Sanft fügen Sie eine Kanüle mit einem Dreiwege Hahn befestigt, um es in die Vene Extremitäten an den Enden der Schnur.
4. Ziehen Sie das Netzkabel und die Kanüle Verbindung mit einer Länge von Draht fest.
5. Durchspülen Sie die Schnur zweimal mit 20 mL RPMI Medium mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin und 250 ng/mL Amphotericin B, das Kabel Adern zu waschen. Dieser Prozess macht das Aussehen des Rückenmarks, weißer und klarer. Leeren Sie die Vene vor Zugabe der Kollagenase durch das Sammeln der RPMI mit einer Spritze an einem Ende.
6. Durchspülen die Vene mit 12 mL 1 mg/mL Kollagenase Typ ich (0,22 µm gefiltert).
7. Nahe der Absperrhahn an das Kabel endet und das Kabel bei 37 ° C für 12 min inkubieren.
8. Massieren Sie die Schnur zum Lösen von Endothelzellen aus dem Lumen der Vene.
9. Nehmen Sie 30 mL RPMI mit 10 % fetalen Kälberserum mit eine 50 mL Spritze und schließen Sie es an einem Ende der Nabelschnur.
10. Schließen Sie eine leere 50 mL Spritze an das andere Ende der Nabelschnur
11. Öffnen Sie den Absperrhahn und durchspülen der Vene von einem Ende, während umgekehrt vom anderen Ende sammeln.
    Hinweis: Die gesammelten Suspension enthält Endothelzellen.
12. Zentrifugieren Sie diese Zellsuspension bei 200 X g für 5 min.
13. Den Überstand verwerfen und erneut die Zelle Pellet mit 10 mL des kompletten M199 Medium (M199 mit 20 % FCS, 15 µg/mL Endothelzellen Wachstum ergänzt, 100 µg/mL Heparin-Natrium, Hydrocortison-0,5 µM, 10 µg/mL L-Ascorbinsäure, 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin und 250 ng/mL Amphotericin B).
14. Entfernen Sie die Beschichtungslösung aus der T75-Flasche und einmal Spülen mit PBS.
15. Samen der Zellen in den T75 Kolben aus Schritt 1.13 gesammelt und legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
16. Am nächsten Tag spülen Sie den Kolben 3 Mal mit dem kompletten M199 Medium verbleibenden Erythrozyten entfernen und ändern Sie dann das Medium alle 2 Tage bis zum Zusammenfluss.
17. Spülen Sie bei 80 – 90 % Zusammenströmen die HUVECS monomolekularen Film einmal mit 5 mL PBS und lösen Sie die Zellen mit 5 mL 0,05 % Trypsin in 1 mM EDTA bei 37 ° C für 5 min. hinzufügen 4 mL M199 und 1 mL des FCS, Trypsin-Aktion zu stoppen. Spülen Sie die Flasche um alle HUVECS zu entfernen.
18. Sammeln Sie eine Aliquote von 50 µL für Färbung des VE-Cadherin, PECAM-1 und gp38 verwendet werden, und analysieren von Durchflusszytometrie, HUVECS Reinheit zu überprüfen.
19. Sammeln Sie den Rest des HUVECS von 1.18 Schritt in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
20. Verwerfen des Überstands von Schritt 1.19, Aufschwemmen der Zelle Pellet in Lösung (FCS, enthält 10 % DMSO) bei einer Dichte von 5 x 10⁵ Zellen/mL in Cryoröhrchen Einfrieren und bei-80 ° C oder in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch einfrieren.
21. HUVECS Reinheit zu überprüfen:
    1. Die aliquoten von 50 µL der HUVECS gesammelt bei Schritt 1.18 fügen Sie 1 µL Anti-Human VE-Cadherin-FITC Antikörper, 1 µL Anti-Human PECAM1-PE Antikörper und 1 µL Anti-Human Podoplanin-APC Antikörper hinzu.
    2. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
    3. Hinzufügen von 100 µL PBS und Zentrifuge bei 400 X g für 30 s.
    4. Den Überstand verwerfen und in 100 µL PBS aufzuwirbeln. Daten können nun von Flow Cytometry Techniken erworben werden.
       Hinweis: HUVECS sind für VE-Cadherin und PECAM-1 positiv und negativ für Podoplanin.

2. HUVECS Abtauen

Hinweis: HUVECS Einsatz bei niedrigen Durchgang für Experimente (maximal 5 Passagen).

1. T75 Kolben mit 1 mL der Beschichtung-Lösung bei 37 ° C für 30 min zu beschichten.
2. Schnell aufzutauen HUVECS bei 37 ° C für 2 min und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL von kompletten M199.
3. Die Zellen bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
4. Die Zelle Pellet in 10 mL komplette M199 aufzuwirbeln.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension in beschichtetem Kolben. Legen Sie die Flasche im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂. Ändern Sie das Zellkulturmedium alle 2 Tage.

(3) HUVECS Kultur in 0,4 µ-Slide-Kammer

1. Fünf Tage vor dem Start der Flow-Experiment, Pre-Mantel der Kammern einer 0,4 µ-Folie mit 30 µL PBS mit 0,1 mg/mL Kollagen G, 0,2 % Gelatine bei 37 ° C für 30 min.
2. Waschen Sie die Kammern mit 100 µL PBS.
3. Lösen Sie die Zellen von einer 80-90 % konfluierende HUVECS einer T75 Flasche.
4. HUVECS mit 5 mL PBS spülen und mit 5 mL 0,05 % Trypsin bei 37 ° C für 5 min zu lösen.
5. Spülen Sie und sammeln Sie die Zellsuspension in kompletten M199 zählen Sie die Zellen durch die bequemste Methode. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
6. Aufschwemmen der Zelle Pellet 10⁶ Zellen/ml und 30 µL (30.000 Zellen) pro Kammer zu verteilen.
7. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂ für 1 h.
8. Jede Kammer 150 µL des kompletten M199 hinzu und Kulturzellen für 5 Tage im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂. Verändern Sie alle 2 Tage das Medium.

4. HUVECS Färbung für Monocyte-Recruitment-Assay unter Strom

1. Bereiten Sie die Kennzeichnung Medium M199 und 1 µM CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetat) gemacht und warm es bei 37 ° C für 5 min vor der Zelle Kennzeichnung.
2. Waschen HUVECS zweimal mit M199-Medium bei 37 ° c erwärmt
3. Ersetzen Sie das Medium mit 30 µL erwärmten Kennzeichnung 1 µM CMFDA-haltigem Medium, und legen Sie in den Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO₂ 10 min. lang.
4. Einmal mit kompletten M199 waschen und die Zellen mit kompletten M199 im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 30 min inkubieren.
   Hinweis: Es ist wichtig, alle Spuren des Serums vor Zugabe der Kennzeichnung Lösung entfernen, sonst kann es ändern, HUVECS Färbung.
5. Ersetzen Sie die beiden menschlichen TNF-haltigem Medium mit kompletten M199 (500 U/mL) oder eine Mischung aus menschlichen TNF (500 U/mL) mit menschlichen VEGFA (1 µg/mL) für 6 h in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.

(5) Isolation von menschlichen Pan Monozyten und Färbung von Subpopulationen

1. Verwenden Sie entweder einen buffy Mantel des konzentrierten menschliches Blut oder 20 mL frisch isolierte Menschenblut, am Tag des Experiments in EDTA-Vacutainer-Röhrchen gesammelt.
2. Verdünnen Sie das Blut im PBS-1 mM EDTA (1:1) und pipette vorsichtig 20 mL der verdünnten Blut auf 20 mL der Dichte-Gradienten-Medien. Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur mit langsamen Beschleunigung und ohne Bremse.
3. Sammeln der peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)-Thrombozyten-Schicht (zwischen Dichte Gradienten Medien und Plasma Schichten) in eine neue 50 mL-Tube mit 40 mL PBS - 1 mm EDTA. Top-bis zu 50 mL mit PBS - 1 mM EDTA.
4. Zentrifuge bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den überstand.
5. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL der Färbung Puffer (PBS - 1 mM EDTA mit 0,5 % Rinderserumalbumin BSA).
6. Zentrifuge bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den überstand.
7. Wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6.
8. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellet mit 10 mL der Färbung Puffer. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL für eine Zellzahl.
9. Überprüfen Sie PBMC Populationen zu und zählen Sie Zellen rasch mit einem Durchflusszytometer.
   Hinweis: Der charakteristische Lymphozyten und Monocyte Bevölkerung können (Abbildung 1A) beobachtet werden. Ab 50 mL frisches Menschenblut rechnen mit etwa 50-100 x 10⁶ PBMC.
10. Für die Einstellung von CD14 + versus CD14-PBMC unter Strom:
    1. Waschen Sie die Pellets dreimal mit Flow-Puffer (M199 mit 0,5 % BSA) und Aufschwemmen der mononukleären Zellen im Fluss Puffer auf 6 x 10⁶ Zellen pro mL.
    2. Aliquote von 200 µL für jede Probe zu machen. Inkubation bei 37 ° C bis 20 min vor dem Test.
    3. Jedes aliquoten 5 µL Anti-CD14-PE und Hoechst 33342 auf eine Endkonzentration von 2 µM hinzufügen. Mischen und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
    4. Zentrifugieren der aliquoten 400 X g für 30 s.
    5. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellet mit 200 µL Puffer fließen.
11. Für die Einstellung von Monocyte Subpopulationen unter Strom:
    1. Monozyten mit einer Pfanne Monocyte Isolierungskit laut Herstellerangaben zu isolieren.
       Hinweis: Das folgende Protokoll der Isolierung ist für 50 x 10⁶ Zellen. Es kann nach oben oder unten skaliert werden, solange es in den Empfehlungen des Herstellers ist.
    2. Zentrifugieren Sie die PBMC-Aufhängung bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min.
    3. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellet mit 400 µL Puffer Färbung.
    4. Fügen Sie 50 µL der Fc-Rezeptor blockierende Reagenzien und 50 µL Pan Monocyte Antikörper cocktail.
    5. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
    6. Fügen Sie 400 µL Puffer und 100 µL der magnetischen Beads konjugierten Anti-Biotin Antikörper Färbung hinzu. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
    7. Fügen Sie 2 mL Färbung Puffer und verwenden Sie eine MACS LS-Spalte, gekoppelt mit einem Magneten.
    8. Setzen Sie die LS-Säule auf den Magneten und 1 mL Puffer Färbung. Entsorgen Sie den Durchfluss.
    9. Übergeben Sie die PBMC-Suspension in der Spalte und sammeln Sie den klaren Fluss zu, obwohl Pfanne Monozyten in der neuen 15 mL Tube mit.
    10. Fügen Sie den befleckenden Puffer, um bis zu 5 mL top.
    11. Nehmen Sie eine aliquote und überprüfen Sie die Qualität der Monocyte-Isolierung mit einem Durchflusszytometer.
    12. Bestimmen Sie die Anzahl der Pfanne Monocyte.
        Hinweis: Nur Monocyte Bevölkerung kann (Abbildung 1 b)beobachtet werden.
    13. Zentrifugieren Sie den Rest der Monozyten aus Schritt 5.11.11 200 X g für 5 min.
    14. Verwerfen Sie den überstand.
    15. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Fluss Puffer (M199 mit 0,5 % BSA).
    16. Wiederholen Sie die 5.11.13, 5.11.14 zweimal, um jede Spur von EDTA zu beseitigen.
12. Monocyte Aufhängung im Fluss zu machen (M199 mit 0,5 % BSA) 6 x 10⁶ Zellen/ml Puffer.
13. Aliquote von 200 µL der Monozyten für jede Einstellung Assay zu machen.
14. Halten Sie den Aliquoten bei 37 ° C im Inkubator bis 20 min vor der Injektion.
15. Jedes aliquoten 5 µL Anti-CD16-PE Antikörper und Hoechst 33342 (letzte 2 µM) hinzufügen.
16. Mischen und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
17. Zentrifugieren der aliquoten 400 X g für 30 s.
18. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie Pellet mit 250 µL Puffer fließen.
19. Fügen Sie 30 µL der Monocyte Suspension in einer Kammer des Schlittens dienen zur Einstellung der Aufnahmeparameter auf confocal Mikroskop.
20. Halten Sie die Aliquote Monocyte Suspension davon ab, Schritt 5.18 bei 37 ° C.
    Hinweis: Diese Suspension ist bereit, in den Flow-System injiziert werden.

6. Vorbereitung des fluidischen Systems

1. Sicherstellen Sie, dass die Zelle Inkubator für die Bildgebung bei 37 ° c eingestellt
   Hinweis: Eine Abbildung des Flow-System ist in Abbildung 2dargestellt.
2. Montieren Sie den Schlauch-Teil I: einfügen ein Luer-Anschluss männlich an einem Ende ein Stück Silikon Schlauch (8 cm lang und 3 mm dick) und schließen Sie das andere Ende an einem Inline-Luer Injektion Satz. Schließen Sie den letzteren Luer-Anschluss an ein Stück Silikon Schläuche (40 cm und 3 mm dick) an einem Ende.
   Hinweis: Optional kann ein 3-Wege-Hahn verbunden mit einer 5 mL-Spritze zwischen die Inline-Luer Injektion und das Silikon Schläuche für eventuelle Luftentfernung Blase eingefügt werden.
3. Montieren Sie den Schlauch-Teil II: eine 20 mL Spritze an einem Ende mit einer Länge von Silikon Schlauch (1 m lang und 3 mm dick) zu verbinden. Legen Sie ein Luer-Anschluss männlich an das andere Ende des Schlauches.
4. Verbinden Sie Teil I und Teil II Schläuche durch das Einfügen der Luer Anschluss Männchen zu einer weiblichen Luer Lock Koppler (Abbildung 2A).
5. Setzen Sie das freie Ende der Silikonschlauch in die Becken mit den Fluss-Puffer (M199 + 0,5 % BSA) bei 37 ° c erwärmt
6. Ziehen Sie den Kolben der Spritze 20 mL, die Schläuche mit Flow-Puffer zu füllen.
7. Legen Sie die Spritze an der Pumpe und sichern.
8. Legen Sie die Pumpe in zurückziehen Modus (im Gegensatz um zu ziehen) und geben Sie die Durchflussmenge.
9. Bestimmen Sie die Durchflussmenge gemäß der IBIDI-Folie verwendet, mithilfe der folgenden Formel:
   
   Hinweis: Die Folie-Faktor ist abhängig von der IBIDI-Folie für das Experiment verwendet. Für die µ-Folie ich^0,4 Luer Lock verwendet in diesem Beispiel der Folie Faktor ist 131,6. Bestimmten Folie Faktoren finden Sie in der Unternehmens-Webseite-¹⁴. Die Fließviskosität Puffer ist 0.0072 dyn.s/cm². Schubspannung bei der Post-Kapillaren Venolen ist etwa 0,5 dyn/cm².
10. Verbinden Sie die Folie (Abb. 2 b):
    1. Klemmen Sie den Silikonschlauch rund um den weiblichen Luer Lock Koppler und trennen Sie die beiden Luer-Anschluss Männchen von der Kupplung.
    2. Verbinden sie mit den Stauseen des Schlittens, stimuliert HUVECS und füllen mit Medium enthält. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts.
    3. Nehmen Sie die Klemmen und sicherzustellen Sie, dass die Verbindung nicht undicht ist.
11. Legen Sie die Folie unter dem Mikroskop für Zeitraffer-Aufnahmen und einschalten Sie die Pumpe.

(7) Zeitraffer Bildgebung der Monocyte Rekrutierung unter Strömung durch konfokale Mikroskopie

1. Verwenden Sie ein Objektiv 40 X (siehe Tabelle der Materialien) für die Bildgebung.
2. Aktivieren der 405 nm (blue Monocyte Kerne), 488 nm (grüne Endothelzellen) und 561 nm (rot CD16 + Teilmenge) Laser.
3. Verwenden Sie die Kammer, die die Monozyten zur Einstellung der Übernahme-Parameter enthält.
   Hinweis: Um nicht transmigrated und transmigrated Monozyten zu erkennen, sind die Lochkamera und Intensität des Laser 405 nm hoch eingestellt. So sind nicht transmigrated Monozyten in der basalen Plan leicht sichtbar. Jedoch nur transmigrated Monozyten eine ungefärbten Raum um den Atomkern entspricht der neuen Fläche unter endothelial Zellen darstellen.
4. Legen Sie die Kammer unter dem Mikroskop erworben werden.
5. Wählen Sie 3 Felder Ansichten im Umkreis von 1 cm für Multi-Positions confocal Imaging.
6. Die basale und die apikalen Seiten der Endothelzellen zu definieren
7. Legen Sie einen Z-Stapel auf 10 – 12 µm Bereich (0,5 µm Schritt). Führen Sie einem Zeitraffer Erwerb alle 1 min.
8. Injizieren Sie nach 3 min der Bildgebung 200 µL Monocyte Suspension (6 x 10⁶ Zellen/mL) durch die Inline-Luer Spritzenport.
   Hinweis: Schnell werden Monozyten in der apikalen Brennebene halten und Seelenwanderung (Transit von der apikalen auf den basalen Plan) zu starten.
9. Bild für mindestens 30 Minuten. Sobald beendet, Bildgebung und beenden Sie den Fluss. Klemmen Sie den Schlauch um sie von der Folie zu trennen.
10. Befestigen Sie die Folie mit 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 10 Minuten.
11. Die Folie mit PBS waschen und Lagern der Folie bei 4 ° C zur weiteren Analyse bei Bedarf.

8. die Datenanalyse mit ImageJ

1. Die Anzahl der insgesamt anhaftende Monozyten in den einzelnen Bereichen. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro mm².
2. Zählen Sie transmigrated Monozyten, die in den basalen Plan unter Endothelzellen vorhanden und durch die Anwesenheit eines schwarzen Lochs (in den grünen Kanal) um den Kern identifiziert sind.
3. Teilen Sie die Anzahl der transmigrated Leukozyten durch die Gesamtzahl der anhaftende Leukozyten. Die Seelenwanderung Rate wird als Prozentsatz des anhaftenden Monozyten vorgestellt.
4. Zur Veranschaulichung können die apikale und basalen Seiten gleichzeitig angezeigt werden um die Ereignisse, die in jeder der diese endotheliale Fächer zu veranschaulichen.

Ergebnisse

Ermitteln des Status der HUVECS Aktivierung durch TNF induziert

Die Bio-Aktivität von inflammatorischen Zytokinen TNF können je nach Charge und die Kalorienzahl Einfrieren Auftauen Zyklus. Es ist wichtig, um den Aktivierungsstatus der HUVECS mit TNF-Behandlung zu überprüfen. Dies könnte durch Färbung einige Proben von konfluierende HUVECS für die entzündliche Induktion Selectins, ICAM-1 und VCAM-1^15,...

Diskussion

Hier berichten wir über eine Methode, die eine Studie über wie Monocyte Subpopulationen durch die entzündeten endotheliale Monolage transmigrate Detaillierung. Die besprochene Methode verwendet konfokalen Mikroskopie statt Phasenkontrast-Mikroskopie, die genutzt wird um Monocyte Rekrutierung unter Strömung^3,11,19zu untersuchen. Ein großer Vorteil der konfokalen Mikroskopie für Zeitraffer-Aufnahmen mit ist die Fähigkeit zur Seele...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gewebekulturflaschen 75 cm2	TPP	90076	Routinekultur von isolierten HUVEC
µ-Slide VI 0.4	IBIDI	80606
Zentrifugenröhrchen 15 mL	TPP	191015
Zentrifugenröhrchen 50 mL	TPP	191050
Kollagen G	Biochrom	L 7213	Zur Beschichtung von Zellkulturen Kolben
Gelatine	Sigma-Aldrich	1393	Zum Beschichten von Zellkulturkolben
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (ohne MgCl2 und CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco" s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (mit MgCl2 und CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
3-Wege-Absperrhähne	BIO-RAD	7328103
;/ml Streptomycin 10.000 μm; g/mL Fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Kollagenase Typ 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x mit Earle-Salzen, L-Glutamin, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Rinderalbuminfraktion V	ThermoFisher	15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg	Millipore	02-102
Heparin-Natrium	Sigma-Aldrich	H3149RT
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H6909
L-Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat C10H14N2Na2O8 & 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), humaner rekombinanter Klon: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE Antikörper, humaner rekombinanter Klon: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, humaner rekombinanter Klon: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-Chlormethylfluorescein-Diacetat)	ThermoFisher	C2925
Rekombinantes humanes TNFα	Peprotech	300-01A
Rekombinante humane VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 Programmierbare Spritzenpumpe	KF Technology	NE-1000
Ficoll  Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-humaner CD14-PE-Klon: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-humaner CD16-PE, humaner rekombinanter Klon: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS-Säulen	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat	ThermoFisher	H1399
Silikonschlauch	IBIDI	10841
Winkel-Luer-Anschluss	IBIDI	10802
Luer-Lock-Kupplung mit weiblicher	Kupplung IBIDI	10823
Luer-Lock-Anschluss Buchse	IBIDI	10825
Inline-Luer-Injektionsanschluss	IBIDI	10820
Ar1 konfokales Mikroskop	Nikon
40x Objektiv	Nikon	40x 0,6 CFI ELWD S Plane Fluor WD: 3,6-2,8 mm Korrektur 0-2 mm
ImageJ Software	NIH