Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzufrieren und Abschnitt Gehirngewebe von mehreren Tieren als eine zeitsparende Alternative zur Bearbeitung einzelner Gehirne. Dies senkt die Färbung Variabilität bei Immunohistochemistry und reduziert Zeit Kryoschneiden und Imaging.
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Methodenartikel
Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Histologie und Immunhistochemie sind Routineverfahren der Analyse zu visualisieren mikroskopische Anatomie und Proteine in biologischen Geweben zu lokalisieren. In Neurowissenschaften, sowie eine Fülle von anderen wissenschaftlichen Bereichen sind diese Techniken verwendet. Immunohistochemistry kann auf Schlitten montiert Gewebe- oder frei schwebenden Abschnitte erfolgen. Probenvorbereitung von Folie montiert, ist eine zeitintensive Prozess. Das folgende Protokoll für eine Technik, genannt die Megabrain reduziert den Zeitaufwand für Cryosection und Mount Hirngewebe um bis zu 90 % durch die Kombination mehrerer Gehirne in einem gefrorenen Block. Darüber hinaus reduziert diese Technik Variabilität zwischen runden, in einer großen Studie histochemische Färbung gesehen. Die aktuelle Technik wurde optimiert für die Verwendung von Nagetier Hirngewebe in nachgeschalteten immunhistochemische Analysen; jedoch kann es zu verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen angewendet werden, die Kryoschneiden verwenden.
Einleitung
Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für eine neuartige Methode, die wir Megabrain nennen, zu Cryosection mehrere Nagetier gleichzeitig für nachgeschaltete immunhistochemische Verfahren Gehirne entwickelt. Ein Megabrain ermöglicht die Herstellung der einzelnen Folien mit Gewebe aus mehreren Tieren. Diese Technik wurde optimiert, um koronalen Abschnitte aus 9 Erwachsene Ratte Hemisphären oder 5 Erwachsene voller Gehirne gleichzeitig geschnitten. Daher ist die Technik am ehesten zutreffenden in großen immunhistochemische Studien oder andere Analysen auf Schlitten montiert Hirngewebe aus einer großen Kohorte von Tieren gemacht.
Immunohist....
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Protokoll
Die Megabrain-Technik wurde optimiert, mit ganzen und Hemisected Gehirne von männlichen Erwachsenen C57Bl6 Mäuse5, juvenile Sprague-Dawley Ratten und Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten, die Transcardially durchströmt mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt waren von 4 % Paraformaldehyd6. Ähnliche Ergebnisse können in andere Stämme von Maus und Ratte, bei beiden Geschlechtern und in den verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Die Studie zur Datengenerierung für diese Handschrift juvenile Sprague-Dawley Ratten verwendet und wurde von der University of Arizona institutionelle Tierpflege und Use Commi....
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Ergebnisse
Eine positive Bilanz für diese Prozedur ist Gewebe, das liegt flach auf der Folie, ohne Bläschen oder Risse in der Ausrichtung, in der sie eingefroren waren. Gewebeschnitte werden gleichmäßig verteilt auseinander und leicht erkennbar durch gute Platzierung des Gehirns im Office-Anpassungstool und gute Schreibweise wie in Abbildung 1dargestellt. Vorausgesetzt, dass das Hirngewebe von Tieren in einem ähnlichen Alter gesammelt wurde, und das Gewebe wurde im Offi.......
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Diskussion
Während dieses Vorgangs zu berücksichtigen, dass die Temperatur der Megabrain und seine Umgebung ständig überwacht werden muss, um zu verhindern, Auftauen und wieder einfrieren des Gewebes. Das Gehirn kann nur aus dem Tiefkühler-20 ° C bis zu 3 mal als entfernt werden jedes Mal, wenn es berührt wird und Links in den Kryostaten mit wärmeren schwankende Temperaturen, das Gewebe auftaut und gefriert, wodurch eine Gelee wie Textur und krankhaftes Gewebe Integrität10. Daher ist es optimal, um die Megab.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben.
Danksagungen
PCH Mission Fördermittel unterstützt die Forschung in diesem Manuskript berichtet. Die Autoren möchte Daniel Griffiths danken für die Aufnahme der Bilder, die in den Figuren verwendet.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT Compound (12 Stück) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Einweg-Einbettungsformen | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Broad Strong Point Pinzette/Pinzette | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Szintillationsfläschchen mit Polypropylen-Kappe | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Saccharose, Polyflasche 2,5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Sowohl 15%ige als auch 30%ige Saccharosekonzentrationen müssen nachgebildet werden. |
| 2-Methylbutan (zertifiziert), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Becher in hoher Form | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand Allzweck-Flüssig-in-Glas-Teiltauchthermometer (-50 bis +50 &Grad; C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatel | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Rasierklinge | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Mikrotomklingen | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Objektträger (1" frost) - weiß | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 10x, pH 7,2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Vor Gebrauch auf 1X verdünnen |
| 15 Stück feine Pinsel Amazon | B079J12ZRV | ||
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Das in Abbildung 4 gezeigte Futter wurde von einem Labortechniker maßgefertigt, es können jedoch ähnliche Größen von anderen Unternehmen kommerziell bestellt werden. | Elektronenmikroskopie | EMS065 |
Referenzen
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
