Morphometrische Protokoll für die objektive Beurteilung der Blastozyste Verhalten während der Verglasung und wärmenden Schritte

Summary

Hier präsentieren wir ein Time-Lapse morphometrische-Protokoll, um die Intensität der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion während Previtrification Interventionen und Post-wärmende Erholung folgen. Die Anwendung des Protokolls ist möglich in in-vitro- Befruchtung Labors mit Zeitraffer Mikroskopen ausgestattet und wird bei der Entwicklung einer optimalen Blastozyste-Verglasung-Methode empfohlen.

Abstract

Dieser Artikel beschreibt die nicht-invasive Methode der Blastozyste Morphometrie basierend auf Time-Lapse Mikrofotografie für die präzise Überwachung von einer Blastozyste Lautstärke ändern während der einzelnen Phasen vor und nach der Verglasung. Die Methode kann bei der Suche nach den optimalen Zeitpunkt der Blastozyste Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Kryoprotektanten durch die Beobachtung der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion in verschiedenen Pre- und Post-Verglasung Phasen hilfreich sein. Mit dieser Methode kann die Blastozyste Verglasung Protokoll optimiert werden. Für eine bessere Demonstration von der Nützlichkeit dieser morphometrische Methode sind zwei verschiedene Blastozyste Vorbereitung Protokolle für die Verglasung im Vergleich; einmal mit einer künstlichen Blastocöl zusammenbricht und einmal ohne diese Intervention vor der Verglasung. Beide Blastozysten Volumenänderungen sind gefolgt von Time-Lapse Mikrofotografie und gemessen an Fotobearbeitungs-Software-Tools. Die Messungen sind alle 20 Sekunden in Previtrification Phasen und alle 5 Minuten in der Post-Erwärmung. Die Änderungen der Blastozyste Dimensionen pro Zeiteinheit sind in Zeile Diagrammen grafisch dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eine lange Gleichgewichtherstellung Previtrification Phase in der intakte Blastozyste zuerst verkleinert und dann langsam füllt das Blastocöl Eingabe Verglasung mit einer Flüssigkeit gefüllten Blastocöl. Die künstlich reduzierte Blastozyste bleibt in seinen geschrumpften Phase durch die gesamte Gleichgewichtherstellung Phase. Während der Phase der Vitrifikation ändert es auch nicht sein Volumen. Da die Blastozyste Morphometrie ein konstantes Volumen künstlich reduzierten Blastozysten während der Previtrification-Schritt zeigt, scheint es, dass dieser Phase kürzer sein könnte. Das beschriebene Protokoll bietet viele zusätzliche Vergleichsparameter der Blastozyste Verhalten während und nach der Kryokonservierung auf der Grundlage der Geschwindigkeit und Intensität der die Volumenänderungen, die Anzahl der partiellen Blastocöl Kontraktionen oder total Blastozyste bricht zusammen, und die Zeit, um eine totale Blastocöl Re-Erweiterung oder die Zeit zu schlüpfen.

Introduction

Kryokonservierung von Embryonen Präimplantationsdiagnostik aus dem in-vitro- Befruchtung Programm (IVF) ist heutzutage eine Routinepraxis in die meisten IVF-Labors. Langsam Embryos Einfrieren Methode begann 1985 mit der Einführung von spezifischen Kryoprotektanten und computergesteuerte Gefriergeräten, die ermöglicht die kontrollierte Kühlung von Embryonen bis-7 ° C, bei Eisnukleation (Aussaat) im induziert wurde klinisch verwendet werden die umliegenden Cryoprotective mittlere¹. Durch kontinuierliche Kühlung würde die Eiskristalle wachsen, verursachen die Hyperosmolality von der restlichen flüssigen Anteil und damit die Austrocknung u....

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der nationalen medizinischen Ethik-Kommission am 19. April 2016 (Nr. 0120-204/2016 – 2) genehmigt.

1. Aufbau der Mikroskop-Aufnahme-System

1. Schalten Sie die Heizplatte des Mikroskops.
2. Vor jeder Behandlung eine Momentaufnahme der Blastozyste unter einem inversen Mikroskop mit Kamera ausgestattet. Denken Sie daran, die Vergrößerung beachten Sie mit der Blastozyste aufgenommen wurde.

2. Auswahl und Prepreparation von Blastozysten für Verglasung

1. Wählen Sie nur voll entfalteten Tag-5 oder 6. Tag Blastozysten für die Kryokonservierung mit wen....

Results

In einer Demonstration haben wir Blastozyste Morphodynamics nur ein Previtrification und ein Post-wärmen Stadium gezeigt. Ein Unterschied in der Lautstärke der Blastozyste am Ende der Phase Gleichgewichtherstellung und zu Beginn der Wiederherstellung in Kulturmedium zeigte die Intensität der Embryo Schrumpfung, die in der Tat ist der Intensität der Embryo Konservierung gegen Eis Kristallisation.

Wie es aus A.......

Discussion

Das Protokoll für die Beobachtung der Blastozyste Morphodynamics während und nach der Kryokonservierung auch mit ähnlichen Instrumenten und Software-Tools anderer Hersteller durchgeführt werden kann. Zeitraffer-bereinigt um Embryologie Systeme ermöglichen die kontinuierliche Überwachung der Entwicklung des Embryos. Das Ziel dieser Arbeit war die Quantifizierung der Blastozyste Verhalten während der Vorbereitung der Blastozysten für Verglasung und nach deren Erwärmung einzuführen. Dies geschah durch die objektive Messung .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverses Mikroskop Eclipse TE2000-U	Nikon, Japan	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Dänemark	/
Digitalkamera DC1	Research Instruments, Origio, Dänemark	/
Digitalkamera DC2	Research Instruments, Origio, Dänemark	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Dänemark/		Software zur Mikroskopaufzeichnung
Inkubator mit 6 % CO2, 5 % O2	Bindemittel, Deutschland	/
Primo Vision	Mikroskop Vitrolife, Schweden	16600
Primo Vision Capture Software	Vitrolife, Schweden	16608	Zeitraffer-Aufnahmesoftware
Adobe Photoshop CS6 Extended Software	Adobe Systems Incorporated, USA/		Videoanalyse-Software
VirtualDub	Avery Lee	/	Videobearbeitungssoftware
Microsoft Office Excell	Microsoft, USA	/	Tabellenkalkulationseditor
PrimoVision Kulturschale	Vitrolife, Schweden	16604
G2-plus Medium	Vitrolife, Schweden	10132	Kultivierungsmedium für Embryonen im Blastozystenstadium
Humanserum Albumine	Vitrolife, Schweden	10064
Paraffinöl	Vitrolife, Schweden	10029
Medium für Gleichgewichtslösung	Irvine Scientific, Irland	90131
Medium für Verglasungslösung	Irvine Scientific, Irland	90132
Medium für Auftaulösung	Irvine Scientific, Irland	90134
Medium für Verdünnungslösung	Irvine Scientific, Irland	90135
Medium für Waschlösung	Irvine Scientific, Irland	90136
HSV Vitrifikationsrohhalme	CryoBio System, Frankreich	025246, 025249, 025250, 025248
Flüssigstickstoff	-/
Kryogefäß Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Deutschland	229286
Kryo-Tank	Cryotherm, Deutschland
Pinzetten	/	/
Scheren	/	/
Pippete zur Blastozystenmanipulation	Gynäzietik, Belgien	ID275/10	Durchmesser 275 &Mikro; m
Pipette für die Entblößung von Eizellen	Vitromed, Deutschland	V-DEN-135	Durchmesser 135 µ m
Pipettierer EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Digitaler Intervalltimer Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA	/	statistische Analysesoftware
Selbsteinstellende Abisolierzange	Knipex, Deutschland	1262180