Eine Mikro-Agar-Salz-Brücke-Elektrode für die Analyse der Proton Fluktuationsrate von rekombinanten Membranproteine

Membranproteine sind um bis zu 60 % von allen bekannten Arzneimitteln¹ausgerichtet. Elektrophysiologische Messungen der Membranproteine sind ein mächtig aber feine Tool zur Analyse des elektrogenes Transports von Substraten durch Träger Membranproteine vermittelt. Die Modulation des transmembranen Stromes durch die Anwendung von ständigen Spannungen oder Spannung Rampen ermöglicht die Beurteilung der pharmakologischen und physikalischen Eigenschaften der Träger, zum Beispiel die Aktivierung und Hemmung von Substraten oder den transport Kinetik. Von besonderem Interesse ist die Substrat-Umsatz-Nummer, die die Menge des Substrats anzeigt, die durch eine Membranprotein pro Zeiteinheit umgesiedelt ist. Es ist ein wichtiger Parameter, vergleicht man die Kinetik der verschiedenen Membranproteinen. Einrichtung ein Konzentrationsgradient geladener Substrat durch die Membran erzeugt eine elektromotorische Kraft die Umsatz-Anzahl des Substrats abgeleitet.

Mit Hilfe einer AgCl-Elektrode, entsteht die Anwesenheit von Chlorid-freie Puffer ein Diffusion-Potenzial, die Elektrode potenzielle verändert und führt zu einer Verschiebung der Strom-Spannungs-Messungen². Zwar immer vorhanden, es ist für standard Leitwert und Kapazität Messungen vernachlässigbar, da diese Parameter entweder sind abhängig von der Neigung der Strom-Spannungs-Aufnahme (Leitfähigkeit) oder der Unterschied einer einzigen Aufnahme (Kapazität), die hebt das Potenzial. Jedoch kann die Aufnahme die umgekehrte Potential, das durch den Transport des Substrats erstellt wird, durch die mögliche Verbreitung erheblich gestört werden. Müssen uns daher für genaue Messungen des umgekehrten Potentials, die Elektrode Potenziale konstant gehalten werden.

Die mögliche Verbreitung kann durch zwei Methoden minimiert werden: (i) in Anwesenheit von einem Bilayer Membran hat eine Substratkonzentration auf der einen Seite der Membran^3,4erhöht werden, oder (Ii) eine Salzbrücke gleicht die Elektrode potenzielle ⁵. die erste Methode ist stark abhängig von der Stabilität der Messungen. Die Membran muss überleben für einige Minuten durch die Zugabe von Substrat unter Rühren, bis das Substrat in der Lösung fast gleichmäßig verteilt ist. Falls die Membran zwischen Brüche, das Substrat Gefälle wird durch den freien Austausch von geladene Moleküle verändert und Messungen wieder ungenau. Die letztere Methode gleicht die mögliche Verbreitung aber ist begrenzt durch die Größe des Aufbaus. Umsetzung eines kleines aber funktionieren Salzbrücke im Mikrobereich eine elektrophysiologische Set-up ist eine⁶Herausforderung. Für die letztere Methode ist die Salzlösung in ein Microcapillary Tipp gefüllt und stabilisiert durch die Zugabe von Agarose, Verbreitung der Salzlösung die Pufferlösung zu verhindern.

In diesem Protokoll wird eine einfache Produktion eines Mikro-Agar Salzbrücke und Implementierung in eine elektrophysiologische Setup basierend auf die Pipette Set-up⁷ beschrieben. Ein Microcapillary Tipp ist eine 3 M KCl-Lösung mit 1 Mol % (w/V) Agarose enthalten und zur Überbrückung einer AgCl-Elektrode und Puffer-Lösung angepasst. Der Vorteil der Mikro-Salz-Brücke wird durch die präzisen Messungen des Membranpotentials an verschiedenen pH-Gradienten und Zeit Aufnahmen von der Elektrode Potenzialverschiebung angezeigt. Im Modellsystem von rekombinanten Proteinen rekonstituiert in Liposomen sind die Fluktuationsraten von mitochondrialen Carrier UCP1 und UCP3 unter ähnlichen Bedingungen produziert haben und im Vergleich zu früheren Ergebnisse^3,8.

1. Produktion von rekombinanten Abkuppeln Proteinen (UCPs) und die Bildung von planaren Bilayer Membranen

1. Rekombinante UCP1 und UCP3 zu produzieren, wie von Rupprecht Et Al. beschrieben ⁹ und Hilse Et al. ¹⁰
2. Planare Bilayer Membranen an den Spitzen der konventionellen entbehrlich Kunststoff Pipetten zu bilden, wie von Beck Et Al. beschrieben ⁷

2. Vorbereitung der Mikro-Agar Salz Brücke Elektrode

1. Stellen Sie eine Microcapillary-Pipette auf die passende Länge tip (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Markieren Sie die Position auf einer leeren Spitze an dem der Puffer-haltigen Tipp wird zu angebracht werden und verwenden Sie eine gleitende Bremssattel messen Sie die Länge der Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode.
      Achtung: Die Microcapillary Spitze lang genug, um für die Messungen die Pufferlösung eingeben muss.
   2. Schneiden Sie die Microcapillary-Spitze mit einem scharfen Messer oder einer Klinge und reinigen Sie die Schnittfläche mit Ethanol und Wasser.
2. Bereiten Sie die AgCl-beschichtete Elektrode.
   1. Ein Ag-Draht von ca. 8 cm in der Länge abgeschnitten und mit Ethanol und Wasser reinigen.
   2. Nehmen Sie ein Stück Schleifpapier und Glätten der Oberfläche von 1 cm Länge am Ende des Drahtes, die in Kontakt mit der Salzlösung sein sollte.
   3. Tauchen Sie die geglättete Ende in einer 3 M KCl-Lösung und streicht es elektrochemisch mit Chlorid mit DC-Versorgung bei 1,5 V für 10 s.
   4. Die Elektrode mit Wasser zu reinigen, trocknen, und passen Sie die Länge der AgCl Elektrode von der unbeschichteten Seite, so dass es dringt in die Microcapillary Spitze so tief wie möglich.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Bereiten Sie eine 3 M KCl-Salz-Lösung mit 1 % (V/V) Agarose.
   1. Wiegen Sie 4,47 g KCl und durch Rühren in einem Kolben in 20 mL Wasser auflösen.
   2. Entfernen des Rührers, Abwiegen 0,2 g Agarose, und fügen Sie es in den Kolben.
   3. Die Lösung auf 100 ° C zu schmelzen die Agarose und verhindern, dass die Gerinnung erwärmen.
      Achtung: Die Küvette wird sehr heiß. Nicht mit bloßen Händen berühren. Benutzen Sie Handschuhe für das Handling.
4. Füllen Sie Microcapillary Tipp mit der Agarose Salzlösung.
   Achtung: Die Lösung ist heiß. Schutz der Hände und arbeiten sorgfältig, um Spritzer zu vermeiden.
   1. Wenn die Agarose beginnt, Gerinnung, erwärmen Sie die Salzlösung die Agarose vollständig wieder zu schmelzen.
   2. Tränken Sie 10 µL der Agar Salzlösung in die Microcapillary Spitze. Saugen sie langsam und sorgfältig zu Luft sprudelt in der Spitze.
   3. Entfernen Sie die Spitze aus der Pipette und drücken Sie die AgCl-Elektrode von der breiten Seite der Spitze. Sicherstellen Sie, dass die Elektrode dringt in die Salzlösung.
   4. Die Elektrode auf Raumtemperatur kühlen Sie ab und stecken Sie es in den Verstärker.
5. Bereiten Sie den Puffer für die Messungen.
   1. Wiegen, 0,710 g Na₂SO₄, 0,195 g MES, 0,121 g TRIS und 0,023 g EGTA, dann ein Becherglas 100 mL destilliertes Wasser hinzu und rühren Sie die Lösung.
   2. Überprüfen Sie für den pH-Wert des Puffers mit einer pH-Elektrode und passen Sie den pH-Wert auf 7,32.
   3. Prüfen Sie die Bezugselektrode und Agar Salzbrücke Elektrode in elektrischem Kontakt.
      1. Fügen Sie 1 mL des Puffers zu einem Kunststoff-Behälter.
      2. Tauchen Sie ein in die Bezugselektrode und Agar Salzbrücke Elektrode und überprüfen Sie, ob eine Signalantwort. Wenn die Signalantwort korrekt ist, fahren Sie mit Schritt 2.7.
6. Wenn überhaupt gibt es auch ein falsches Signalantwort oder kein elektrischer Kontakt, führen Sie die folgenden Problembehandlung.
   1. Überprüfen Sie, ob die Elektrode in Kontakt mit der Salzlösung und drücken Sie die Elektrode in die Lösung.
      Hinweis: Wenn die Lösung bereits zu klebrig ist, entfernen Sie die Micro-Agar Salzbrücke und bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.
   2. Überprüfen Sie, ob Luftblasen innerhalb der Salzlösung. Wenn ja, bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.
   3. Überprüfen Sie, ob die Salzlösung in Kontakt mit der Pufferlösung. Wenn dies nicht der Fall ist, dann ein weiteres 1 mm vom Rohr-Ende der Spitze abschneiden.
      Vorsicht: Achten Sie darauf, dass die Spitze noch lange genug, um die Puffer-haltigen Spitze zu durchdringen. Wenn es noch keinen Kontakt, bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.
   4. Wenn keiner dieser Schritte helfen, bereiten Sie eine neue Microcapillary-Spitze.
7. Tauchen Sie für die Lagerung die Agar Salzbrücke Elektrode in eine 3 M KCl-Lösung.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier eingestellt werden. Für eine Pause über Nacht, Lagern Sie die Elektrode in 3 M KCl-Lösung bei 4 ° C.
8. Bereiten Sie die Puffer-haltigen Kunststoffspitze.
   Hinweis: Wenn die Elektrode über Nacht gelagert wurde, nehmen Sie es aus und lassen sie Hitze bis zu 30 min bei Raumtemperatur.
   1. Werfen Sie einen Microcapillary Tipp und biegen Sie das Rohr 2 cm vom Rand des schmalen Teil, ungefähr 90 Grad mit einem Heizdraht.
   2. Verwenden Sie ein sehr scharfes Messer oder Messer und schneiden Sie den Schlauch ca. 5 mm von der Biegung.
   3. Reinigen Sie die Oberfläche am Ende mit Ethanol und Wasser und Messen Sie den Durchmesser der Bohrung der Spitze. Berechnen Sie aus diesem Grund die Fläche der Oberfläche.
   4. Bestreichen Sie die Oberfläche der Spitze mit 85:15 (V: V) Hexan: Hexadecan.
      1. Pipette 3 µL des Lösungsmittels und entfernen Sie es von der Spitze.
      2. Warten Sie 1 min, so dass alle das restliche Lösungsmittel in der Spitze verdampft.
   5. Füllen Sie die Messspitze mit 3 µL Puffer und stecken Sie es auf die Salzbrücke Elektrode.
      Hinweis: Überprüfen Sie erneut, wenn die Salzbrücke Elektrode und die Bezugselektrode in elektrischem Kontakt mit Schritt 2.5.3.
   6. Wenn es keine elektrischen Kontakt, überprüfen Sie Folgendes:
      1. Überprüfen Sie, ob die Salzbrücke Elektrode in Kontakt mit der Pufferlösung ist. Wenn dies nicht der Fall ist, dann erhöhen Sie die Lautstärke des Puffers in der Spitze oder bereiten Sie einen längeren Microcapillary Tipp.
      2. Ist eine Luftblase, entfernen Sie die Spitze von der Mikro-Salz-Brücke-Elektrode, Nachfüllen des Puffers in der Spitze, und stecken Sie es wieder in die Elektrode.

3. Messung der elektrischen Parameter der Membran rekonstituiert mit rekombinanten Proteinen

1. Anwenden einer dreieckigen abwechselnd Spannungssignal mit maximaler Spannung U_max = 50 mV und ΔT_Rampe = 50 ms, schafft eine rechteckige Wechselstrom-Antwort. Aus den Mittelwerten der positiven und negativen Strömungen (ich₊ und ich_–) die Kapazität der Membran nach folgender Formel zu berechnen:
   
2. Gelten eine Spannungsrampe reicht von-50 mV bis + 50 mV und den aktuellen Datensatz. Eine lineare Funktion der Daten - die Steigung ist der Leitwert - fit und den x-Achse Schnittpunkt der Passung zu berechnen.
3. Die Lösung in die Kunststoffspitze entladen und ein neues mit einem Puffer mit einer erhöhten Substratkonzentration zu füllen.
   1. Wenn innerhalb der ersten 20-30 s keine Membran gebildet wird, entladen Sie das Volumen und füllen Sie ihn. Dies garantiert, dass das Konzentrationsgefälle über die Membran nicht erheblich während der Membran Bildung ändert.
   2. Nach der Bildung einer Membran Schritte 3.1 und 3.2 wieder zu richtigen Membran Bildung zu überprüfen und um die x-Achse Schnittpunkt zu erhalten.

4. Berechnung der Substrat-Fluktuationsrate

Hinweis: Siehe Vorarbeiten für Details^3,7.

1. Schätzen Sie die Menge an Protein in der Membran von der molekularen Masse von Lipid und Protein (M_Lipid und M-_Protein), Bereich der Membran und der Kopfgruppe ein Lipid (eine_Membran und ein_Lipid) und das Massenverhältnis des Proteins pro Lipid (R).
   
2. Berechnen Sie die Nernst-Potenzial für das transportierte Substrat. R ist Gaskonstante, T die Temperatur, Z die Ladung des transportierten Substrats, F der Faradays konstante und C₁ und c₂ die Konzentrationen des Substrates auf beiden Seiten der Membran.
   
3. Nutzen Sie von den Strom-Spannungs-Aufnahmen das Gegenteil potential mit dem Unterschied von der x-Achse Schnittpunkte von der linearen passt in an- und Abwesenheit des Substrats Gradienten berechnet.
4. Berechnen Sie den Anteil der Substrat Leitwert G_Substrat, um der gesamten Membran Leitwert, G_insgesamt, durch das Verhältnis der umgekehrte Potenzial, Nernst potenzielle¹¹.
   
5. Berechnen Sie das Substrat Umsatz Nummer ΔN_Substrat pro Zeit Einheit ΔT von der Substrat-Leitwert (G_Substrat), die angelegte Spannung U und die Ladung der Substrat-z:
   
6. Berechnen Sie aus dem Verhältnis der transportierten Substrat pro Zeit, um die Zahl der Proteine die Umsatz-Rate κ.
   

Um die Minimierung der möglichen Verbreitung zu überprüfen, wurde die Stabilität der Strom-Spannungs-Messungen eine intakte Membran gemessen. In Abbildung 2AVertreter-Strom-Spannungs-Aufnahmen in der Gegenwart (weiße Punkte) und Abwesenheit (schwarze Punkte) eines pH-Gradienten dargestellt. Gemäß der Nernst-Gleichung induziert der pH-Gradient eine Verschiebung in der Spannung. Von der x-Achse Schnittpunkt eine lineare Anpassung an die Daten errechnet sich die Potenzialverschiebung. Um beide Elektroden zu testen, wurde die Verschiebung der x-Achse Schnittpunkt für eine standard AgCl-Elektrode (Abbildung 2B; weiße Punkte) und ein Mikro-Agar Salzbrücke (Abbildung 2B; schwarze Punkte) analysiert. Eine Spannungsrampe wurde zehn Mal in Folge aufgezeichnet und die mittlere Verschiebung auf der x-Achse wird gegen die Zeit dargestellt. Während die Agar Salzbrücke Elektrode eine maximale Verschiebung von weniger als 5 hatte mV auch nach 300 Sekunden der Messung, die standard Elektrode variiert bis zu 30 mV in unvorhersehbaren, zufällig, Verhalten.

Als nächstes wurden beide Elektroden bei unterschiedlichen pH-Gradienten(Abbildung 3)getestet. Für die standard Elektrode wurde eine pH Steigung von 0,35 und 1,0 (weiße Punkte) erzeugt; für die Agar Salzbrücke Elektrode pH-Gradienten von 0,35, 0,7 und 1,0 (schwarze Punkte). Die Verschiebung der Potenzial wurde in drei unabhängige Messungen untersucht. Im Gegensatz zu einer Steigung von 0,35, wo die gemessenen Verschiebung nur leicht variiert, verändert die Spannung Verschiebung deutlich an der pH-Gradient der 1.0 in Ermangelung der Mikro-Agar Salzbrücke. Aus eine lineare Anpassung an die Daten ist die Steigung der Funktion 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH für die standard-Elektrode und 50,1 ± 4,6 mV/ΔpH für die Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode. Gemäß der Nernst-Gleichung ist die berechnete Potenzialverschiebung 60.7 mV/ΔpH bei T = 32 ° C.

Mit Mikro-Agar Salzbrücke, die Proton-Umsatz-Anzahl, wurde κ, mitochondriale UCP1 und UCP3 gemessen und im Vergleich zu früheren Messungen (Abb. 3B). Ähnlich wie Abbildung 3A, ΔpH = 1.0 wurde generiert und das umgekehrte Potenzial gemessen wurde. Die Menge an Protein in der Membran wurde geschätzt, nach der Formel gemäß Abschnitt 4 des Protokolls, mit einem Protein, Lipid-Verhältnis von 4 µg / (mg Lipid), eine Molekülmasse von 33.000 und 750 Da für die Protein- und Lipid, eine Membranfläche von 3,53 x 10 -4 cm2und einer Fläche pro Lipid von 7,8 x 10-15 cm2. Die κwas 5.56 ± 0,38 s-1 und 4.10 ± 0.71 s-1 für UCP1 und UCP3, bzw. zu erhalten (Abb. 3B).

Abbildung 1 : Die elektrophysiologische Set-up mit der Mikro-Agar Salzbrücke. (A) dieses Panel zeigt eine Skizze des Aufbaus. Die Microcapillary-Spitze mit der Agar-Salzlösung (in Orange dargestellt) befindet sich zwischen der Elektrode (schwarz) und die Puffer-haltigen Spitze (blau). Die Membran bildet sich an der Oberfläche am Ende der Puffer-haltigen Spitze (Pfeilrichtung). (B) dieses Panel zeigt ein Bild des elektrophysiologischen Set-up mit der Implementierung der Mikro-Agar Salzbrücke. Die Pfeile zeigen auf die Elektrode, die Mikro-Agar Salzbrücke, Bezugselektrode und den Behälter mit Pufferlösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Der Vergleich der Salzbrücke eine Mikro-Agar und einer standard AgCl Elektrode. (A) dieses Panel zeigt eine repräsentative Strom-Spannungs-Messung in der Gegenwart (graue Punkte) und Abwesenheit (weiße Punkte) eines pH-Gradienten von 1. Die Linien repräsentieren eine lineare Anpassung der Daten, aus denen Leitwert und x-Achse Kreuzung Werte erhalten werden. Die Verschiebung der Spannung wird durch die Differenz der Kreuzung Werte der beiden Aufnahmen ausgewertet. (B) dieses Panel zeigt die Verschiebung der Membran einer standard AgCl-Elektrode (weiße Punkte), ein Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode (schwarze Punkte) in der Zeit. Zehn Strom-Spannungs-Messungen hintereinander aufgenommen wurden und die mittlere Spannung Verschiebung durch Diffusion möglichen aufgetragen gegen die Zeit. In allen Versuchen wurde die Membran 45:45:10 Mol-% DOPC:DOPE:CL rekonstituiert mit 15 Mol % Arachidonsäure in einer Konzentration von 1,5 mg/mL. Der Puffer enthalten 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS und 0,6 mM EGTA bei pH = 7,34 und T = 32 ° C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Proton Umsatz UCP1 und UCP3 berechnet aus dem umgekehrten Potenzial im Beisein eines pH-Gradienten. (A) dieses Panel zeigt die Verschiebung im Potenzial einer UCP1-haltigen Membran von verschiedenen pH-Gradienten aus einer standard AgCl-Elektrode (weiße Punkte) und ein Mikro-Agar Salzbrücke Elektrode (schwarze Punkte). Die Linien repräsentieren eine lineare Anpassung der Daten. (B) dieses Panel zeigt die Proton Umsatz Anzahl der UCP1 (erste Datensatz) und UCP3 (zweite Datensatz) als berechnet aus dem Verhältnis von Spannung Verschiebung Nernst-Potential nach den Formeln in Abschnitt 4 des Protokolls. Der erste Balken eines jeden Satzes stellt Umsatzraten gemessen mit der Mikro-Agar Salzbrücke. Der zweite Balken jeder Datensatz stellt vorherigen Messungen mit einer standard AgCl-Elektrode. Werte für UCP1 und UCP3 stammen aus UrbankovaEt al. 3 und Macher Et al. 8. in allen Messungen, setzte die Membran aus 45:45:10 Mol % DOPC:DOPE:CL mit 15 Mol % AA und UCP1/UCP3 rekonstituiert. Die Konzentration von Lipid und Protein betrug 1,5 mg/mL bzw. 4 µg/mg Lipid. Der Puffer enthalten 50 mM Na2SO4, 10 mM MES, 10 mM TRIS und 0,6 mM EGTA bei pH = 7,34 und T = 32 ° C. Der pH-Wert des Puffers für die Gradienten-Messungen wurde durch Zugabe von TRIS 7,66, 8,00 oder 8,33 erhöht und änderte sich in der Lösung-haltigen Pipette. Die Werte sind der Mittelwert ± Standardabweichung der drei unabhängige Messungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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