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Methodenartikel

In-vitro- Methode zur Kontrolle Konzentrationen Halogenkohlenwasserstoffe in kultivierten alveolären Epithelzellen

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DOI:

10.3791/58554

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23. Oktober 2018

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1Department of Perioperative Medicine, CHU Clermont-Ferrand, 2Centre National de la Recherche Scientifique Unité Mixte de Recherche (CNRS UMR) 6293, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) U1103, Laboratoire de Génétique, Reproduction et Développement (GReD), Université Clermont Auvergne, 3Department of Pharmacology, CHU Clermont-Ferrand, 4Nurse Anesthetist School, CHU Clermont-Ferrand

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine einfache Protokoll speziell für die präzise und kontrollierte Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran in-vitro- zu erreichen, um unser Verständnis der Mechanismen der epithelialen Lungenversagen zu verbessern und Roman testen Therapien für akute Atemnotsyndrom.

Zusammenfassung

Akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist ein Syndrom der diffuse alveoläre Schädigung mit eingeschränkter alveoläre Flüssigkeit Clearance und schwere Entzündungen. Die Verwendung von halogenierten Substanzen wie Sevofluran oder Isofluran, für die Sedierung von Patienten der Intensivstation (ICU) kann verbessern Gasaustausch, alveoläre Ödem reduzieren und dämpfen Entzündungen bei ARDS. Es fehlen jedoch Daten über die Nutzung der inhalierten Mittel zur kontinuierlichen Sedierung auf der Intensivstation zu Lungenschäden vorzubeugen oder zu behandeln. Um die Auswirkungen von halogenierten Agenten auf alveolären Epithelzellen "physiologischen" Bedingungen zu untersuchen, wir beschreiben ein einfaches System für Zellkulturen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit und setzen sie an halogenierten Agenten bieten präzise kontrollierte "Luft" Brüche und "Medium" Konzentrationen für diese Mittel. Wir entwickelten eine versiegelte luftdichten Kammer in der Platten mit menschlichen alveoläre verewigt Epithelzellen einen präzisen, kontrollierten Bruchteil von Sevofluran oder Isofluran verwenden einen kontinuierlichen Gasstrom durch eine Narkose Maschine-Schaltung zur Verfügung gestellt ausgesetzt sein könnten. Zellen wurden 24 Stunden lang 4 % Sevofluran und Isofluran 1 % ausgesetzt. Gas-Massenspektrometrie wurde durchgeführt, um die Konzentration der halogenierten Wirkstoffe gelöst in das Medium zu bestimmen. Nach dem ersten waren Stunden, die Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran mittelfristig 251 mg/L und 25 mg/L, bzw.. Die Kurven der Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran aufgelöst in das Medium zeigten ähnliche Kurse im Laufe der Zeit mit einem Plateau erreicht eine Stunde nach der Exposition.

Dieses Protokoll wurde speziell entwickelt, um präzise und kontrollierte Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran in Vitro , unser Verständnis der Mechanismen, die in epithelialen Lungenschädigung bei ARDS zu verbessern und neue Therapien für test erreichen die -Syndrom.

Einleitung

Akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist ein klinisches Syndrom gekennzeichnet durch diffuse alveoläre Schädigung, Lungenödem und Linksventrikuläre respiratorische Insuffizienz. Obwohl ARDS mehr als 10 % der Intensivstation (ICU) Kinobesuche und fast 25 % der ICU-Patienten, die eine mechanische Lüftung darstellt, ist es noch ein unter anerkannten Herausforderung für Kliniker, mit einer Krankenhaus-Mortalität von 35-45 %1. Trotz intensiver Forschung ist die Identifizierung eines effektiven ARDS pharmakologische Therapie oder Prävention bisher fehlgeschlagen. Zwei wichtige Funktionen tragen zur Mortalität bei ARDS: alveoläre Flüssigkeit Clearance (AFC) (d. h. die veränderte Resorption der alveoläre Ödem Flüssigkeit aus Lufträume distal Lunge) und schwere Entzündungen2beeinträchtigt. Da ARDS Sterblichkeit hoch bleibt, gehört aktuellen Initiativen auch Primärprävention; Allerdings ist eine zentrale Herausforderung zur Identifizierung von Risikopatienten in denen ARDS voraussichtlich entwickeln wird und wer profitieren würde, wenn ARDS vereitelt werden konnten.

Flüchtigen halogenierten Anästhetika Sevofluran und Isofluran, sind weit verbreitet in Vollnarkose im OP-Saal zur Verfügung stellen. Weltweit mehr als 230 Millionen Patienten, die eine größere Operation jährlich erfordern allgemeine Anästhesie und Beatmung3, und klinische Ergebnisse und Gesundheitswesen Auslastung4 postoperative pulmonale Komplikationen beeinträchtigen . Die Verwendung von Sevofluran anstelle von Propofol wurde verbesserte Lungenentzündung bei Patienten mit Thoraxchirurgie und signifikante Abnahme der Nebenwirkungen wie ARDS und postoperativen pulmonalen Komplikationen5zugeordnet. In ähnlicher Weise hatte eine Vorbehandlung mit Isofluran schützende Wirkung auf die Atemwege Mechanik, Sauerstoffversorgung und Hämodynamik in experimentellen Tiermodellen von ARDS6,7. Obwohl weitere Studien die Auswirkungen von inhalativen Agenten auf die Ergebnisse im noncardiac Surgery gerechtfertigt sind, ist eine ähnliche Abnahme der pulmonalen Komplikationen in einer Meta-Analyse zeigt, dass inhaliert Anästhetika kürzlich beobachtet worden – als gegen eine intravenöse Anästhesie – sind signifikant assoziiert mit einem Rückgang der Sterblichkeit für Herzchirurgie8.

Prospektive Daten über den Einsatz von volatilen Agenten für die Sedierung von Intensivpatienten zur Vorbeugung oder Behandlung Lungenschäden fehlt. Jedoch mehrere Studien unterstützen die Wirksamkeit und Sicherheit von inhalativen Sevofluran jetzt für die Sedierung von Intensivpatienten und präklinische Studien haben gezeigt, dass inhalierte Sevofluran und Isofluran7,9 Gasaustausch verbessern, reduzieren alveoläre Ödem und abschwächen Entzündungen in experimentellen Modellen des ARDS. Darüber hinaus verringert Sevofluran Typ II Epithelzelle Schaden10, während Isofluran die Integrität der Alveolar-Kapillare Barriere durch Modulation der tight Junction Protein11unterhält. Allerdings sind weitere Studien notwendig, um zu überprüfen, inwieweit der experimentelle Nachweis der Orgel Schutz von inhalativen Sevofluran und Isofluran auf den Menschen übersetzt werden könnte. Eine erste Single-Center randomisierte kontrollierte-Studie (RCT) aus unserer Gruppe festgestellt, dass frühe Verwendung von inhalativen Sevofluran bei Patienten mit ARDS verbesserte Sauerstoffversorgung, verringerte Niveaus von einigen Pro-inflammatorische Marker und reduzierten Lunge epithelialen zugeordnet wurde Schaden Sie, wie die Ebenen der löslichen Form des Rezeptors für advanced Glycation Endprodukte (sRAGE) im Plasma und alveoläre Flüssigkeit12bewertet.

Zusammengenommen könnten die wohltuende Wirkung von Sevofluran und Isofluran auf Lungenschädigung verweisen auf mehrere biologischer Signalwege oder Funktionsabläufe, die abhängig von der Wut Weg sind nämlich alveoläre Flüssigkeit Clearance (AFC), epitheliale Schädigung, Translokation des nuclear Factor (NF)-κB, und Makrophagen Aktivierung. Darüber hinaus kann Sevofluran Ausdruck der Wut-Protein selbst beeinflussen. Da frühere Forschungen durch unser Research-Team und andere entscheidende Rollen für RAGE in alveoläre Entzündung und Lunge epithelialen Verletzungen/Reparatur bei ARDS unterstützt, entwarfen wir ein experimentelles Modell zum translational Verständnis der Mechanismen der Sevofluran in Lunge Schädigung und Reparatur13,14,15. Die in-vitro- Effekte von Sevofluran und Isofluran wurden in einer neuartigen menschlichen alveoläre epithelialen Primärzelle Linie speziell entwickelt, um die Luft-Blut-Schranke der peripheren Lunge, hAELVi (menschlichen alveoläre epithelialen LentiVirus Studie untersucht. verewigt), mit alveolären Typ-ähnliche Eigenschaften einschließlich funktioneller enge Kreuzungen16.

Während der Vorbereitung des Design unserer in-vitro- Untersuchungen (z. B. Kulturen der alveolären Epithelzellen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit mit der Exposition gegenüber "inhaliert" Sevofluran oder Isofluran, verstanden wir aus bisher veröffentlichten Studien, die Bruchteile von Sevofluran sind nur in der "Luft" Schnittstelle17,18,19 mit standard-Monitore (ähnlich denen in einer klinischen Einstellung) untersucht worden. Halogenierte Agent-Konzentrationen wurden in der Regel nach die minimale alveoläre Konzentration (MAC)-Werte gewählt (z. B. beim Menschen, für Sevofluran, 0.5, 1,1 und 2,2 vol%, Vertreter, 0.25, 0.5 und 1 MAC; für Isoflurane, 0.6, 0.8, und 1.3 vol% repräsentieren jeweils 0,25, 0,5 und 1 MAC)20. Sevofluran und Isofluran-Konzentrationen wurden in der Tat nie in das Kulturmedium selbst, wodurch die Gültigkeit des früheren experimentelle Modelle/Instrumenten untersucht. Darüber hinaus verwendet die meisten Experimente eine anaerobe Glas, die versiegelt wurde, nachdem die Luft Mischung mit Sevofluran im Inneren gespült hatte. Da unser Ziel war es, alveoläre Epithelzellen "physiologischen" Bedingungen zu studieren, glaubten wir, dass ein anaerober Zustand möglicherweise nicht optimal und wäre nicht kompatibel mit lange experimentelle dauern. Daher wir unser eigenes System auf Zellkulturen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit entwickelt und setzen sie auf halogenierte Agenten (Sevofluran und Isofluran) mit dem Ziel, präzise kontrollierte "Luft" Brüche und "mittlere" Konzentrationen für diese Mittel. Unserer Meinung nach ist dieser experimentellen Schritt, der bisher in der Literatur nicht beschrieben hat, vor jeder weiteren in-vitro- Untersuchungen von Sevofluran und Isofluran obligatorisch.

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Protokoll

(1) Kultur der alveolären Epithelzellen (hAELVi)

  1. Auftauen
    1. 4 mL Anbau Ready-to-Use menschlichen alveoläre epithelialen (HuAEC) Medium in ein Kunststoffrohr 15 mL Pipette und schnell Auftauen das Fläschchen in einem vorgeheizten Wasserbad (37 ° C).
    2. Übertragen Sie die aufgetauten Zellsuspension auf einer 15 mL-kunststofftube mit 4 mL des Mediums vor die Röhre bei 200 X g für 5 min zentrifugieren.
    3. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 5 mL des Mediums Anbau. Übertragen Sie anschließend die Zellen auf einem T25-Kolben.
    4. Pflegen Sie die Zellen unter Standardbedingungen (5 % CO2, 95 % befeuchteten Luft, 37 ° C)
  2. Aufteilung
    1. Überprüfen Sie den Status der Zellen mikroskopisch. Wenn die Zellen 80-90 % Zusammenfluss sind, teilen Sie die Zellen, folgende Schritte 1.2.2 durch 1.2.10.
    2. Die Anbau-Medien der Zellen mit einer sterilen Pipette abzusaugen.
    3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 4 mL des Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) und Aspirieren Sie des DPBS.
    4. Fügen Sie 1 mL Trypsin/EDTA-Lösung (TE), die Zellen vor der Inkubation bei 37 ° C für 3 Minuten, bis die Zellen beginnen sich zu lösen; Suchen Sie nach Ablösung unter dem Mikroskop.
    5. Die Zellen mit 2 mL des Kulturmediums aufschwemmen und die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren. Dann Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet wieder mit 3 mL des Mediums Anbau.
    6. Verwenden Sie Trypan blauen Farbstoff Ausschluss Test um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Nehmen Sie 30 µl Zellsuspension und 30 µl eine 0,4 % ige Lösung von Trypan blau in einem Rohr. Danach mischen Sie effektiv die Lösung 3-bis 5-Mal mit einer 100 µl Pipette. 10 µl der Lösung nehmen und legte es unter dem Deckglas der Hemocytometer.
    7. Zählen Sie die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen und die Anzahl der toten Zellen in den Bereichen der Hemocytometer (blau). Dann berechnen die Zellviabilität [%] unter Verwendung der Gleichung: Zelle überleben = 100 – (100 / Gesamt-Anzahl der Zellen x Anzahl der toten Zellen)
    8. Übertragen Sie die aliquoten mit Pellet resuspendierte Zelle auf eine neue Zelle Kultur T25 Kolben oder 6 Well-Platte. Die Zellen, die insgesamt 5 mL Anbau Medium in den T25-Kolben oder 1 mL für jedes gut die 6 Well-Platte zu erreichen fügen Sie das Anbau-Medium hinzu.
    9. Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator unter Standardbedingungen (5 % CO2, 95 % befeuchteten Luft, 37 ° C)
    10. Sobald die Zellen vollständig konfluierende, sind sie bereit für das Experiment.

2. Vorbereitung einer luftdichten Kammer

Hinweis: Der Bauplan für den luftdichten Kammer ist in Abbildung 1. dargestellt.

  1. Verwenden Sie einen hermetischen Polypropylen Karton mit einer Kapazität von 6,5 L. Länge, Breite und Höhe sind 30 x 20 x 15,5 cm, beziehungsweise. Bitte beachten Sie, dass das Volumen des Quaders ist niedriger als die theoretische Volumen aufgrund der abgerundeten Ecken.
  2. Bohren Sie ein Loch mit Durchmesser 2,5 cm auf der Unterseite der seitlichen Wand.
  3. Legen Sie ein Wellrohr mit einer grünen Markierung, die dienen als das Gas-Luft Gemisch Eingang Rohr, und mit Silikon abdichten.
  4. Eine zweite 2,5 cm Durchmesser Bohrung auf der Oberseite der gegenüberliegenden seitlichen Wand zu bohren.
  5. Legen Sie ein weiteres Wellrohr mit einem roten Kennzeichen und verbinden Sie es mit einem Aktivkohlefilter, dienen als das Gas-Luft Gemisch Ausgang Rohr, und mit Silikon abdichten.
  6. Bohren Sie ein Loch mit knapp 4 mm Durchmesser in der Mitte der mittleren Wand der Box.
  7. Legen Sie kurze Infusion Schlauch, der verbunden ist an einen Verteiler mit einem rotierenden männlichen Luer-Lock, die wird in einem Gasanalysator angeschlossen werden und mit Silikon abdichten.
  8. Platzieren Sie ein digitales Thermometer/Hygrometer in der luftdichten Kammer.

3. setzen Sie alveoläre Epithelzellen zu halogenierten Agenten (Sevofluran und Isofluran)

Hinweis: Eine schematische Zeichnung des Gerätes ist in Abbildung 2. dargestellt.

Vorsicht: Obwohl tierexperimentelle Studien keine Hinweise auf fetale Schaden oder Beeinträchtigung der Fortpflanzungsfähigkeit ergaben, und eine sehr kleine Studie beim Kaiserschnitt kein unerwünschten Auswirkungen auf die Mutter und Fötus zeigen, halogenierte die Sicherheit der Verwendung (z. B. Agenten Sevofluran oder Isofluran) während der wehen und der Geburt hat bis heute nicht nachgewiesen wurde. Während menschliche Schwangerschaften wurden darüber hinaus keine kontrollierten Daten gesammelt. Deshalb experimentieren mit Sevofluran oder Isofluran während Schwangerschaft abgeraten werden sollte.

  1. Arbeiten Sie unter einer Labor-Dunstabzugshaube.
  2. Anpassen einer Narkose Maschine-Schaltung um die Gasleitung von Lachgas durch Kohlendioxid (CO2) zu wechseln.
  3. Die maßgeschneiderte Narkose Maschine Schaltung stecken Sie die luftdichten Kammer mit dem grün markiert, gewellte Rohr. Legen Sie einen beheizten Luftbefeuchter (z. B. auf ICU Ventilatoren verwendet) in das Rohr zwischen die Narkose Maschine und luftdichten Kammer fließen Gasgemisch auf etwa 37 ° C erwärmen
  4. Installieren die luftdichten Kammer auf einer heißen Platte, Bereitstellung einer Heizung Platte Temperatur von 37° C.
  5. Setzen Sie die 6 Well-Platte mit hAELVI Zellen in der luftdichten Kammer und den Deckel verschließen.
  6. Regulieren Sie die Gas-Durchflussmengen (d. h. das Gemisch aus Luft und CO2) um die Standardbedingungen, definiert als 5 % der CO2 und 95 % der befeuchteten Luft schnell zu erhalten.
  7. Die halogenierten Agent Verdampfer zu öffnen und wählen Sie den gewünschten Prozentsatz (in der vorliegenden Studie getesteten Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran waren 4 % und 1 %, beziehungsweise).
  8. Beachten Sie die Zusammensetzung der Mischung und Sevofluran oder Isofluran Gaskonzentration als durch eine externe Gasanalysator gemessen und angezeigt auf dem Bildschirm.
  9. Sobald die Zielwerte erreicht werden, reduzieren Sie das frische Gas-Durchfluss auf 1 L/min.
  10. Die luftdichten Kammer kann mit diesem Gas-Durchfluss so lange wie nötig für das Experiment aufrechterhalten werden.

4. Messen Sie Sevofluran oder Isofluran durch Chromatographie

  1. Vorbereitung der Proben
    1. Zu verschiedenen Zeitpunkten, ganz kurz öffnen die Kammer, die untersuchten Proben zu nehmen (in der vorliegenden Studie verwendet eine 6-Well-Platte) und schließen Sie den Deckel. Halten Sie die anderen Proben im Feld. Aspirieren Sie dann 1 mL des Mediums in jeder Probe mit einer mehrbändigen einstellbare Mikropipette enthalten.
    2. Legen Sie das Medium in 10 mL Headspace Chromatographie Fläschchen, die hermetisch dicht mit einer Teflon versiegelte Kappe geschraubt werden sollten. Frieren Sie die Chromatographie-Fläschchen bei-20 ° C, wenn Sie sie nicht sofort verwenden.
    3. Bereiten Sie eine Stammlösung von Sevofluran und eine weitere Stammlösung von Isofluran, jeweils 50 g/L in Methanol. Bereiten Sie gleichzeitig eine Stammlösung Chloroform (interner Standard, IS) bei 2 g/L in Methanol. Speichern Sie alle standard-Lösungen bei-20 ° C.
    4. Bereiten Sie funktionierende Lösungen von Sevofluran und Isofluran bei 50, 500 und 5000 mg/L in hochreinem Wasser/Dimethyl Sulfoxyde (50/50; V/V). Für interne Standardisierung wird die Arbeitslösung bei 100 mg/L in Methanol fixiert.
  2. Analyse der zellulären Muster
    Hinweis: Die Extraktionsverfahren basiert auf den zuvor validierten Methode von Gaschromatographie und Massenspektrometrie von Bourdeaux Et al. 1 und verwendet die gleichen Parameter der Sensibilität und Spezifität. Sevofluran und Chloroform (IS) dienten in diesem Protokoll und Isofluran wurde im Zusammenhang mit der multiparametric Analysemethode. Kurz, für Massenspektrometrie Erwerb, wurde die Methode nach der reinen Lösung Injektion entwickelt. Dann wurde m/Z mit Referenzstandards und Literaturdaten bestätigt. Drei m/Z wurden ausgewählt, für jeden Analyten (außer IS): 1 m/Z zur Quantifizierung (die am häufigsten vorkommende und höher), für die Fülle wurde durch die Integration der Fläche unter der Kurve für die Quantifizierung berechnet und zwei m/Z zur Bestätigung. Mit drei m/Z, konnten Analyten speziell dann identifiziert werden, weil alle m/Z hatte die selben Retentionszeit, als auch weil alle Beträge in m/Z (Verwandter von Ionen-Bestätigung vs. Quantifizierung) waren die gleichen in der reinen Norm und in allen Proben. Mit diesem Erwerb Modus könnte Analyten identifiziert und quantifiziert mit guter Spezifität.
    1. Konstruieren ein 8-zackiger Kalibrierkurven mit Konzentrationsbereiche von 0,5-400 mg/L und mehrere Qualität steuert (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 und 400 mg/L).
      Hinweis: Um jede Kalibrierung zu validieren, wurden vier Qualitätskontrollen verwendet: die untere Grenze der Quantifizierung (C1 = 0,5 mg/L), zwei intermediate level (C2 = 20 mg/L und C3 = 75 mg/L) und die letzte Stufe (C4 bei 400 mg/L; obere Ebene der Quantifizierung). Alle Standards und Kontrollen wurden analysiert in kultivierten Zellen Matrizen, Matrix-Effekt zu vermeiden. Für jede Kalibrierkurve wurde eine leere Matrix analysiert, um überprüfen, ob gab es keine Interferenzen mit kultivierten zelluläre und internen Standards.
    2. Bereiten Sie eine Stammlösung von Sevofluran und eine weitere Stammlösung von Isofluran, jeweils 50 g/L in Methanol. Bereiten Sie gleichzeitig eine Stammlösung Chloroform (interner Standard, IS) bei 2 g/L in Methanol. Speichern Sie alle standard-Lösungen bei-20 ° C. Dann bereiten Sie funktionierende Lösungen von gemischten Sevofluran/Isofluran bei 50, 500 und 5000 mg/L im Reinstwasser / Dimethyl Sulfoxyde (50/50; V/V). Ist wird die Arbeitslösung bei 100 mg/L in Methanol verdünnt.
    3. Kalibrierkurven und Kontrollen Vorbereitung der Proben durch einen 50 µL der IS (100 mg/L) in 1 mL der zellularen Probe Matrizen.
    4. Bereiten Sie Beispiellösungen mit 200 µL des gesättigten Natrium-Chlorid-Wasser-Lösung in einem 10 mL-Headspace-Rohr, hermetisch verschraubt mit einer Teflon versiegelte Kappe.
  3. Gaschromatographie und Massenspektrometrie
    1. Analyseergebnisse verwenden Sie Headspace-Injektionen in einer Gaschromatographie gekoppelt mit der Masse Nachweisverfahren.
    2. Führen Sie Headspace-Röhrchen für 10 min bei 80 ° C mit Heizung Shaker. Dann zurückziehen und 1,5 mL der Gasprobe in den Gaschromatographen injizieren. Legen Sie den Parameter des Injektors bei 260 ° C mit einem Split-Fluss bei 100 mL/min, 2 min zu Beginn des Laufs Chromatographie.
    3. Verwenden Sie Split/splitless Injektor mit einem Träger-Modus programmiert-Druck. Erstens halten Sie den Gasdruck 40 kPa für 0,15 min. Dann erhöhen Sie den Preis Programm Druck bis 150 kPa bei 125 kPa/min vor dem Einstellen einer Rate von 16 kPa/min 300 kPa Druck für 5 Minuten.
    4. Simultan auf die Injektion beginnen mit einer Temperatur von 60 ° C für 1 min und Steigerung, bis eine Temperatur von 140 ° C mit einer Rate von 20 ° C/min erreicht wird. Dann steigen Sie die Temperatur wieder, bis 250 ° C erreicht ist. Die Gesamtzeit des Laufs ist 7 min.
    5. Die Chromatographie-Trennung mit einer fused-Silica Kapillaren Spalte (30 m x 1,4 µm, 0,25 mm ID) durchführen. Durchführen Sie Masse Experimente mit einem einzelnen Ion Zustandsüberwachung (SIM) und überwachen Sie Ion Quantifizierung m/Z 181 und Ion Qualifikationen m/Z 151 und 51 gleichzeitig eine Retentionszeit (RT) von 2,30 min für Sevofluran, m/Z 149 (Ion Quantifizierung), m/Z 115 und 87 (ion Qualifikationen) für Isofluran bei RT 2,8 min und m/Z 83 (Ion Quantifizierung) wie Chloroform bei RT 3.70 min..
    6. Bestimmen Sie die Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran in der Zellkultur durch ihre Flächenverhältnisse derjenigen der IS mit einem Gewicht quadratische Passform. Die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) für Sevofluran und Isofluran war bei 0,5 mg/L und die obere Grenze der Quantifizierung (ULOQ) 400 mg/L.

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Ergebnisse

Die Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran, die das Medium im Laufe der Zeit aufgelöst, sind in Tabelle 1 und Tabelle 2, ausgewiesen.

Die Kurse der Sevofluran und Isofluran Konzentrationen im Medium waren im Laufe der Zeit ähnlich. Unmittelbar nach die erforderliche Konzentration von halogenierten Agent festgelegt wurde, erhöhte Konzentrationen im Laufe der ersten Stunde. Dann wurde ein Pl...

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Diskussion

Unser Protokoll beschreibt eine einfache Methode um Zellen auf einen genauen Bruchteil eines halogenierten Anästhetikum wie Sevofluran und Isofluran verfügbar zu machen. Darüber hinaus berichten wir hier – zum ersten Mal – eine strenge Korrelation zwischen der Gas-Anteil und die Konzentration von Sevofluran und Isofluran in das Kulturmedium selbst. Dieser grundlegende Schritt ermöglicht jetzt sicher unsere luftdichten Kammer nutzen, um die Auswirkungen dieser halogenierte Stoffe in einer kultivierten Monoschicht der mens...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren erkennen Regionalrats Auvergne ("Programm Nouveau Chercheur De La Région Auvergne" 2013) und der französischen Agence Nationale De La Recherche und die Richtung Générale de L'Offre de Soins ("Programme de Recherche Translationnelle de Santé" ANR-13-PRTs-0010) für die Stipendien. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss im Studiendesign, Durchführung und Analyse oder bei der Erstellung dieses Artikels.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SevofluranBaxterVon Experimenten mit Sevofluran oder Isofluran während der Schwangerschaft sollte dringend abgeraten werden
IsofluranVirbacVon Experimenten mit Sevofluran oder Isofluran während der Schwangerschaft sollte dringend abgeraten werden
Menschliche AlveolenepithelzellenInScreenexINS-CI-1015
huAEC Medium ( gebrauchsfertig)InScreenexINS-ME-1013-500ml
Kreislauf für AnästhesiemaschineDrägerFabius
GasanalysatorDrageerVamos Plus
AnästhesiegasfilterSedanaMedicalFlurAbsord
Beheizter HumfiererFisher& PaykelMR850
Chamber Curver00012-416-00
Gaschromatographie gekoppelt mit MassendetektionThermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USATrace 1310 mit TSQ 8000evo
Quarzglassäule (30 m x 1,4 μ m, 0.25 mm ID)Restek, Lisses, FrankreichRxi-624Sil MS

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