Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.
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Methodenartikel
Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Vielzahl von biologischen Prozessen umfasst Zell-Zell-Interaktionen, in der Regel vermittelt durch Proteine, die an der Schnittstelle zwischen benachbarten Zellen interagieren. Von Interesse sind nur einige Proben in der Lage, speziell solche Interaktionen direkt in lebenden Zellen zu sondieren. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test um die Bindung der Proteine an den Oberflächen von benachbarten Zellen, Zell-Zell Kontakte zu messen. Dieser Test besteht aus zwei Schritten: Mischen von Zellen mit dem Ausdruck der Proteine des Interesses mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen verschmolzen, gefolgt von Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Messungen bei Zell-Zell-Kontakte mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Wir zeigen die Machbarkeit des Assays in einem biologisch relevanten Kontext durch die Messung der Wechselwirkungen von Amyloid Vorläufer-Like Protein 1 (APLP1) über Zell-Zell-Verbindungen. Wir bieten detaillierte Protokolle über die Datenerfassung mit Fluoreszenz-basierte Techniken (Scannen Kreuzkorrelation Fluoreszenzspektroskopie, Kreuzkorrelation Anzahl und Helligkeit Analyse) und den gewünschten Gerätes Kalibrierungen. Darüber hinaus diskutieren wir wichtige Schritte in der Datenanalyse und Gewusst wie: identifizieren und beheben Sie externe, falsche Signal Variationen, wie Sie durch Immunofluoreszenz oder Zelle Bewegung.
Im Allgemeinen der vorgestellte Test gilt für alle Homo- oder Zellkulturmodells Proteinprotein Interaktion auf Zell-Zell Kontakte zwischen den Zellen der gleichen oder unterschiedlichen Typen und kann auf eine kommerzielle konfokale Laser-scanning-Mikroskop implementiert werden. Eine wichtige Voraussetzung ist die Stabilität des Systems, das muss ausreichen, um die Sonde diffusiven Dynamik der interessierenden Proteine über mehrere Minuten.
Einleitung
Viele biologische Prozesse auftreten, an den Standorten der Zell-Zell-Interaktionen, z.B. Zellezelle Adhäsion1,2,3, Zell-Zell-Fusion-4 und zelluläre Anerkennung5. Solche Ereignisse sind besonders wichtig bei der Entwicklung von mehrzelligen Lebewesen und für die Zell-Zell-Kommunikation, z. B. während Immunantworten. Diese Prozesse werden in der Regel durch Proteine vermittelt, die an der Oberfläche, d. h. an der Plasmamembran (PM) der benachbarten Zellen lokalisiert sind und spezifische Wechselwirkunge....
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Protokoll
1. Probenvorbereitung: Zell-Zell-mischen-Assay
Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt den Mischvorgang für adhärente Zellen. Er kann für Zellen in Suspension kultiviert geändert werden.
- Samen Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen auf einem 6-Well-Platte, z. B. 800.000 HEK 293T Zellen (mit einem Neubauer Kammer zählen gezählt), einen Tag vor Transfektion. Die Anzahl kann je nach Jahreszeit zwischen Aussaat und Transfektion geändert und bereinigt um andere Zelltypen. Um ein grundlegendes Experiment (z.B. Proteine des Interesses und Negativkontrolle) durchführen, bereiten Sie mindestens 4 Brunnen. Zellkulture....
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Ergebnisse
Ein erster Test für die Protein-Protein-Interaktion-Assay von Zellen mit dem Ausdruck spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine, gefolgt von sFCCS/CcN & B Messungen (Abbildung 1), d. h. mischen durchgeführt werden auf Proteine, die nicht zu erwarten ist bei der Zell-Zell-Kontakt (d. h. eine Negativkontrolle) interagieren. Daher HEK 293T Zellen mit dem Ausdruck Myristoylated-Palmitoylated-mEYFP (Myr-Palm-mEYFP) oder -mCardinal wu.......
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Diskussion
Die hier beschriebene experimentelle Vorgehensweise ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein Trans Interaktionen bei Zell-Zell-Kontakten, Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Techniken, nämlich sFCCS und CcN & B. Diese Methoden beinhalten eine statistische Analyse der Fluoreszenz-Schwankungen, die durch zwei spektral getrennte FPs verschmolzen, benutzt von Interesse an einen Kontakt von zwei benachbarten Zellen, jeweils mit dem Ausdruck einer oder der andere Fusionsproteins emittiert. Das Vorhandensein v.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) 254850309 zu gewähren. Die Autoren danken Madlen Luckner für kritische Lektüre des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM Wachstumsmedium | PAN-Biotech | P04-01548 | |
| DPBS w/o: Ca2+ und Mg2+ | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| DPBS w: Ca2+ und Mg2+ | PAN-Biotech | P04-35500 | |
| Trypsin EDTA | PAN-Biotech | P10-023100 | |
| TurboFect Transfektionsreagenz | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| HEK 293T-Zellen | DSMZ | ACC 635 | |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A20000 | |
| Rhodamin B | Sigma-Alderich | 83689-1G | |
| Plasmid DNA | Addgen | NA | Siehe Referenz 12 (Dunsing et al., MBoC 2017), für eine detaillierte Beschreibung aller Plasmide |
| 6-Well-Platte | Starlab | CC7672-7506 | |
| 35- mm Glasbodenschalen | CellVis | D35-14-1.5-N | |
| Zeiss LSM780 konfokal | Carl Zeiss | NA | |
| MATLAB Softwarepaket | MathWorks | 2015b | |
| Neubauer Zellzählkammer | Marienfeld | 640110 |
Referenzen
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
- Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
- Harris, T. J. C., Tepass, U.
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Nachdrucke und Genehmigungen
