Methodenartikel

Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

DOI:

10.3791/58587

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3. Juni 2019

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet eine Fidschi-basierte, benutzerfreundliche Methodik zusammen mit einfachen Anweisungen, die erklären, wie das Verhalten von Actomyosin in einzelnen Zellen und gekrümmten Epithelgeweben zuverlässig analysiert werden kann. Es sind keine Programmierkenntnisse erforderlich, um dem Tutorial zu folgen; Alle Schritte werden halbinteraktiv über die grafische Benutzeroberfläche von Fidschi und die zugehörigen Plugins durchgeführt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila unreife Eier werden Eierkammern genannt, und ihre Struktur ähnelt primitiven Organen, die morphologische Veränderungen von einer runden zu einer ellipsoiden Form während der Entwicklung erfahren. Dieser Entwicklungsprozess wird Oogenese genannt und ist entscheidend für die Erzeugung funktioneller reifer Eier, um die nächste Fliegengeneration zu sichern. Aus diesen Gründen dienten Eierkammern als ideales und relevantes Modell, um die Entwicklung von Tierorganen zu verstehen.

Es wurden mehrere In-vitro-Culturing-Protokolle entwickelt, aber es gibt mehrere Nachteile dieser Protokolle. Zum einen werden verschiedene Abdeckungen aufgebracht, die einen künstlichen Druck auf die abgebildeten Eikammern ausüben, um sie zu immobilisieren und die abgebildete Erfassungsebene der Umfangsfläche der analysierten Eikammern zu erhöhen. Ein solcher Ansatz kann das Verhalten der dünnen Actomyosin-Maschinerie negativ beeinflussen, die die Kraft erzeugt, Eierkammern um ihre längere Achse zu drehen.

Um diese Einschränkung zu überwinden, kultiieren wir daher Drosophila-Eikammern frei in den Medien, um Actomyosin-Maschinen entlang des Umfangs von Eikammern zuverlässig zu analysieren. Im ersten Teil des Protokolls bieten wir eine manuelle Detaillierung, wie die Actomyosin-Maschinerie in einer begrenzten Erfassungsebene auf lokaler Zellskala (bis zu 15 Zellen) analysiert wird. Im zweiten Teil des Protokolls stellen wir den Benutzern ein neues Fidschi-basiertes Plugin zur Verfügung, das die einfache Extraktion einer definierten dünnen Schicht der Umfangsfläche der Eierkammern ermöglicht. Das folgende Protokoll beschreibt dann, wie Actomyosin-Signale auf der Gewebeskala (>50 Zellen) analysiert werden. Schließlich ermitteln wir die Grenzen dieser Ansätze sowohl auf der lokalen Zell- als auch auf Gewebewaage und diskutieren deren mögliche zukünftige Entwicklung und mögliche Anwendungen.

Einleitung

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Die kontinuierliche Entwicklung neuartiger Bildgebungs- und Softwaretechnologien mit Anwendungen in den Biowissenschaften hat einen enormen Einfluss auf das Verständnis der Grundprinzipien des Lebens gehabt. Eine der größten Herausforderungen ist die zuverlässige Visualisierung von Entwicklungsprozessen in Kombination mit deren Live-Bildgebung in verschiedenen Geweben. Gewebe sind Teile von Organen und Körpern, und als solche sind die meisten für die Bildgebung nicht leicht zugänglich. Daher wurden Protokolle entwickelt, die ihre Zerlegung und In-vitro-Kultivierung erlauben, um biologische Ereignisse zu visualisieren, die die In-vivo-Situation innerhalb eines lebenden Körpers ausreichend widerspiegeln.

In den letzten Jahrzehnten hat die Kultivierung und Live-Bildgebung von Drosophila-Eikammern, acinarartigen Strukturen, die primitiven Organen ähneln, immens zum Verständnis der Grundprinzipien der primitiven Organentwicklung beigetragen1 , 2 , 3. Derzeit stehen mehrere Kultivierungsprotokolle zur Verfügung, deren Verwendung von der Erfassungszeit, dem zu bildendem Zelltyp und ihrer Zugänglichkeit (z. B. innere Keimbahn vs. äußere somatische Linie)abhängt 4.

Ein gemeinsames Merkmal in all diesen Kultivierungsprotokollen ist die Notwendigkeit der Immobilisierung analysierter Eierkammern, die eine hohe kontraktile Aktivität in flüssigen Medien aufweisen. Die kontraktile Aktivität der Eierkammern wird hauptsächlich durch das Muskelblatt verursacht, das eine lange Schnur von verbundenen Eierkammern5,6,7bedeckt. Daher wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um eine ordnungsgemäße Immobilisierung junger Eierkammern zu erreichen, wobei Eikammern mit Abdeckungen6,8,9 oder flexible Decken4, 10 oder einbetten sie in Niedrigschmelzpunkt-Agarose3,11. Diese Ansätze sind beliebt, da sie aufgrund der subtilen Abflachung der Umfangsfläche der Eikammern auch die Bildgebung einer größeren visuellen Ebene ermöglichen.

In jüngster Zeit hat sich jedoch gezeigt, dass sich junge Eikammern (Stufe 1-8) um ihre vordere-hintere Achse6 drehen und dass diese Gewebebewegung von einem feinen Actomyosin-Netzwerk in der Nähe der Umfangsfläche dieser jungen Eikammern angetrieben wird. 12. Daher kann eine künstliche Veränderung der zellulären Oberfläche, die durch eine subtile Abflachung dieses Gewebes verursacht wird, einen negativen Einfluss auf das Verhalten der krafterzeugenden Actomyosin-Maschinerie haben. Der Kontrapunkt ist, dass, wenn das Eikammergewebe nicht abgeflacht wird, die mikroskopische Bildgebung von Proteinen an der Umfangsfläche von Eikammern durch die verminderte Größe der Erfassungsebene noch eingeschränkter wird.

Daher haben wir Protokolle von Prasad et al.9 und dem Labor von Celeste Berg4,10 kombiniert und weiter modifiziert, so dass bei der entwickelten Methode kein Decksch-/flexible Decke/Agarose verwendet wird. Drosophila-Eikammern sind in den Medien frei kultiviert und das hier vorgestellte Protokoll gilt nur invertiert. Das Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil konzentriert sich auf die Analyse von Actomyosin-Signalen auf der lokalen Zellskala (bis zu 15 Zellen) in Eikammern. Im zweiten Teil konzentrieren wir uns auf die Überwindung der Einschränkungen, die mit einer kleinen Ankaufsebene verbunden sind, die durch die freie Kultivierung von Eierkammern verursacht wird. In dieser Hinsicht haben wir eine neuartige Fidschi-basierte Berechnungsmethode mit einer semi-interaktiven grafischen Benutzeroberfläche entwickelt, die selektiv definierte Schichten einer umlaufenden Gewebeoberfläche extrahiert und entfaltet. Es folgt ein Protokoll, das beschreibt, wie Actomyosin auf der Gewebeskala analysiert wird (d. h. >50 Zellen). Da die selektive Extraktion einer definierten dünnen Schicht gekrümmter Epithelgewebe mit einer klassischen Z-Stack-Projektion (Abbildung 1) nicht einfach möglich war, dient diese einfach zu bedienende Methode als wichtige Voraussetzung, um die Verhalten eines dünnen Actomyosin-Netzwerks auf der Gewebeskala in Drosophila-Eikammern.

Darüber hinaus bieten wir zur Erleichterung des Protokolls Beispiel-Zeitrafferfilme (TLMs) und Beispieldateien mit fluoreszierend markiertem konventionellem Myosin-II-Verhalten (siehe Ergänzende Datei 3). Myosin II ist ein motorisch eskoproteinist und stellt den aktiven kontraktilen Teil der Actomyosin-Maschinerie dar. Um myosin II abzubilden, verwenden wir transgene Drosophila-Linien, die eine modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin II namens MRLC::GFP (siehe Tabelle der Materialien für Details)12,13enthalten. Um Zellmembranen zu visualisieren, basiert das Protokoll auf kommerziellen Farbstoffen (siehe Tabelle der Materialien). Dieses Protokoll eignet sich nicht nur für die Analyse kleiner subzellulärer MRLC::GFP-Signale12, sondern auch für alle subzellulären Partikel ähnlicher Größe um 300 M, wie sie mit Life-Act::GFP12,14beobachtet wurden.

Obwohl beide Protokolle mit in vitro kultivierten Drosophila-Eikammern präsentiert werden, kann die Erfassung von Actomyosin-Signalen auch mit anderen Geweben bei der Optimierung der Kultivierungsmedien und je nach Verfügbarkeit durchgeführt werden. von fluoreszierend markierten Proteinen mit entsprechenden kommerziellen Farbstoffen oder beispielsweise mRNA-Mikroinjektionen, um transiente Genexpressionsprofile zu erhalten. In ähnlicher Weise kann das Fidschi-basierte Protokoll zur Extraktion einer dünnen Schicht von einer Umfangsoberfläche allgemeiner auf ellipsoide und organähnliche Gewebe angewendet werden.

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Protokoll

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HINWEIS: Das folgende Protokoll enthält Anweisungen zur Analyse von Actomyosin an der lokalen Zellzelle und der Gewebeskala in Drosophila-Eikammern. Der ansatzauf lokaler Ebene ermöglicht es Benutzern, detailliertes Actomyosinverhalten in bis zu 15 Zellen pro Eikammer zu analysieren und erfordert die Erfassung von TLMs für einen kurzen Zeitraum (5–10 min) mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Bildgebung und einem invertierten konfokalen Mikroskop. Im Gegensatz dazu liefert die Gewebeskala den Anwendern Actomyosin-Informationen in 50–100 Zellen und erfordert die Erfassung von TLMs für einen langen Zeitraum (ca. 30 min) durch Low-Speed-Bildgebung und ein invertiertes Spinnscheibenmikroskop (siehe Abbildung 2 und empfohlene Parameter in jedem Maßstab in Tabelle 1). Die Entscheidung, in welchem Maßstab actomyosin Signale zu analysieren, hängt vollständig von der wissenschaftlichen Frage des Benutzers ab. Begleitete Test-TLMs sollten helfen, diese Entscheidung zu treffen.

1. Lokale Mobilfunkskala (LCS)

HINWEIS: Um in vitro kultivierte Drosophila-Eikammern zu sezieren und abzubilden, befolgen Sie das Protokoll, das in DerErgänzungsdatei 1beschrieben ist. Um erworbene TLMs zu analysieren, fahren Sie mit dem folgenden Protokoll fort. Links zu den begleitenden Testdateien von TLMs finden Sie in der Zusatzdatei 3.

  1. Datenverarbeitung von TLMs auf lokaler Mobilfunkskala (LCS)
    1. Bleichkorrektur von TLMs zum Ausgleich des Intensitätszerfalls von Fluoreszenzetiketten
      1. Stellen Sie sicher, dass eine aktuelle Fidschi-Anwendung auf dem Computer installiert ist, der verwendet wird, indem Sie die folgenden Anweisungen befolgen: Fidschi > TlM öffnen (z. B. TestMovie1.tif aus der Zusatzdatei 3).
      2. Teilen Sie die Farbkanäle auf, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilenklicken.
      3. Führen Sie eine Bleichkorrektur auf beiden Kanälen mit Bild > Anpassen > Bleichkorrektur > Einfaches Verhältnis > Hintergrundintensität 0.0.
        HINWEIS: Wenn unbefriedigende Ergebnisse erzielt werden, untersuchen Sie, welche Korrekturmethoden in diesem Plugin am besten passen (z. B. Verwenden Sie Histogram Matching anstelle eines Simple Ratio).
    2. Zellsegmentierung zum Generieren einer Zellmaske für TLMs
      1. Wenn Fidschi noch nicht geöffnet ist, öffnen Sie es erneut (und stellen Sie sicher, dass es auf dem neuesten Stand ist) nach Hilfe > Aktualisieren > Änderungen anwenden > OK.
      2. Wenn dies noch nicht geschehen ist, laden Sie das Makro TissueCellSegmentMovie.ijm (von http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm herunter. Ziehen Sie dieses Skript nach Fidschi.
      3. Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM .tiff-Datei (siehe Abschnitt 1.1.1). Teilen Sie die Kanäle der bleichkorrigierten Datei mit Bild > Farbe > Kanäle teilen.
      4. Führen Sie das hochgeladene Skript auf dem aktiven Zellmembrankanal des ausgewählten TLM aus, indem Sie das Symbol Ausführen im geöffneten Skript drücken. Stellen Sie die Gaußsche Unschärfe auf 2.500 und die Empfindlichkeit der Zellerkennung auf -1 ein, und klicken Sie auf OK. Um eine schöne Zellmaske zu erhalten, ändern Sie diese Parameter oben nicht. Legen Sie die geschätzte Rauschtoleranz zwischen 10 und 20 für TLMs fest, die mit dem 63x-Ziel erworben wurden, und klicken Sie auf OK.
        HINWEIS: Für andere Ziele können unterschiedliche Parameter erforderlich sein. Je sauberer der Hintergrund in einem TLM, desto geringer ist die geschätzte Geräuschtoleranz.
      5. Eine generierte Zellmaske wird im analysierten TLM und auch in einem neuen Fenster namens ParticleStack (G)angezeigt, und außerdem wird ein kleines Fenster namens Aktion erforderlich angezeigt. Konzentrieren Sie sich in der Zellenmaske auf dem TLM nur auf Zellen in der Mitte des TLM, und wählen Sie diejenigen aus, die vollständige und klar definierte Gliederungen im gesamten TLM bereitstellen können.
      6. Wenn ausgewählte Zellen künstliche/zusätzliche Zellumrisse enthalten, verwenden Sie das Zusammenführungswerkzeugfenster mit dem Namen Aktion Erforderlich im TLM. Befolgen Sie für letztere die Anweisungen im Fenster.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Zellumrisse gut definiert sind und realen Zellmembranen in einem TLM entsprechen, da jede Ungenauigkeit nachfolgende Analysen beeinflussen kann. Zusätzliche Optimierungen und Änderungen, wie z. B. das Entfernen unerwünschter Zellen, können später mit dem Surface-Manager-Tool (beschrieben in Abschnitt 1.1.3) durchgeführt werden.
      7. Wenn die ausgewählten Zellen in der Mitte gut den echten Zellmembranen entsprechen, speichern Sie ParticleStack als .tiff-Datei nach Datei > Speichern unter > Tiff.
    3. Laden der generierten Zellmaske in surface manager
      1. Installieren Sie Surface Manager Plugin15 in das verwendete Fidschi-Setup. Folgen Sie den Anweisungen von Viktorinova et al.16.
      2. Öffnen Sie Surface Manager mit Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D).
        HINWEIS: Im Fenster Oberflächen-Manager werden auf der rechten Seite mehrere Aktionsschaltflächen und links ein leeres Fenster angezeigt. Um alle Aktionsschaltflächen anzuzeigen, kann es erforderlich sein, das Fenster in seiner Höhe/Breite zu dehnen. Beachten Sie, dass Zeitrahmen als Z-Slices angezeigt werden.
      3. Öffnen Sie die entsprechende ParticleStack .tiff-Datei in Surface Manager, indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und das zu öffnende Bild auswählen (z. B. ParticlesStack1.tif).
      4. Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Umrissbild lesen, und legen Sie den Jacquard-Index auf 60 % fest.
        HINWEIS: Das Laden der Datei ParticlesStack1.tif kann je nach Rechenleistung des Computers bis zu mehrere Minuten dauern.
      5. Nach dem Laden wird jede Zelle mit einer S-Nummer zugewiesen und im linken Teil des Fensters Surface-Manager angezeigt.
        HINWEIS: Um Umrisse und Zellennamen für alle Zellen anzuzeigen, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Alle anzeigen und Beschriftungen anzeigen am unteren Rand des Fensters Oberflächen-Manager. Es wird empfohlen, diese Funktion zu verwenden, sobald die Zellennummern auf ihre Richtigkeit überprüft wurden.
      6. Klicken Sie auf die erste S-Nummer; die importierte Zellumrisslinie aus ParticlesStack1.tif wird auf dem TLM angezeigt. Überprüfen Sie jede importierte S-Nummer auf Die Zellenumrissqualität im gesamten TLM, und entfernen Sie unerwünschte Zellen, die falsche Zellumrisse anzeigen. Markieren Sie dazu die Zellumrisslinie und klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen.
        HINWEIS: Es ist auch möglich, ungenaue Zellumrisse zu korrigieren und neue Zellumrisse hinzuzufügen. Dies wird im Diskussionsabschnitt beschrieben.
      7. Speichern Sie alle korrigierten Zellen als RoiSet.zip-Datei, indem Sie die Schaltfläche Auf Festplatte speichern drücken.
        HINWEIS: Wenn die Sitzung unterbrochen werden muss, ist es möglich, die RoiSet-Datei später in den Surface-Manager zu laden: Öffnen Sie eine TLM in Fidschi (Datei > Öffnen) und wählen Sie eine TLM aus. Öffnen Sie Surface Manager über Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D). Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip-Datei, indem Sie auf die Schaltfläche Von Disc laden klicken und die entsprechende RoiSet.zip-Datei auswählen. Überprüfen Sie, ob die geladenen Zellenmasken dem geladenen TLM entsprechen.
    4. Korrektur für Gewebedrift in TLMs
      HINWEIS: Während der Erfassungszeit von TLMs können Drifteffekte aufgrund einer Epithelrotation oder einer unerwünschten Bewegung beobachtet werden. In beiden Fällen empfehlen wir, jede Drift zu korrigieren, um die manuelle Actomyosin-Analyse später zu vereinfachen. Die Driftkorrektur ist nur für die manuelle Actomyosin-Analyse erforderlich. Dieses Tutorial erfordert aktuelle Fidschi-Software mit dem MultiStackReg Plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installiert.
      1. Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM in Fidschi über Datei > Öffnen und wählen Sie die bleichkorrigierte Datei, die mit dem oben erwähnten Tutorial erstellt wurde.
      2. Teilen Sie die Kanäle auf, und wählen Sie die Kanäle aus, die die Zellmembranen über Bild > Farbe > Kanäle teilenidentifiziert.
      3. Verwenden Sie das folgende Protokoll, wenn die Zellumrisse nicht sichtbar glatt sind: Prozess > Filter > Gaußsche Unschärfe. Legen Sie es für ein 63-faches Ziel auf 1–2 fest, und klicken Sie auf OK und dann auf Ja. Klicken Sie auf Prozess > Binär > Konvertieren in Maske mit den Standardeinstellungen; Klicken Sie dann auf OK.
      4. Laden Sie das MultiStackReg Plugin nach Plugins > Registrierung > MultiStackReg.
      5. Stellen Sie sicher, dass Stapel 1 auf den Zellmembrankanal, Aktion 1 auf Ausrichtung und Transformation auf Übersetzung festgelegt ist. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Transformationsdatei speichern, und klicken Sie dann auf OK.
      6. Öffnen Sie das ausgewählte TLM, das MultiStackReg-Plugin und die gespeicherte Transformationsdatei mit Datei > Öffnen und wählen Sie einen TLM aus. Teilen Sie die Farbkanäle mit Bild > Farbe > Kanäle teilen.
      7. Laden Sie das MultiStackReg Plugin, indem Sie auf Plugins > Registrierung > MultiStackRegklicken. Wählen Sie Transformationsdatei als Aktion 1 laden aus.
      8. Lassen Sie Transformation als starren Körper und klicken Sie auf OK. Wählen Sie die zuvor gespeicherte Transformationsdatei aus, und klicken Sie erneut auf OK.
      9. Führen Sie die Bildkanäle zusammen, und speichern Sie den registrierten TLM als .tiff-Datei nach Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen. Speichern Sie die Datei, indem Sie auf Datei > Speichern unter > Tiffklicken.
        HINWEIS: Es gibt alternative Möglichkeiten, eine Gewebedrift in Fidschi zu korrigieren, nämlich über Plugins > Registrierung > StackReg/Correct 3D drift.
  2. Analyse von Actomyosin-Impulsen im Surface Manager bei LCS
    HINWEIS: Dieser Protokollschritt ermöglicht es Wissenschaftlern, zu identifizieren, ob Actomyosinpulse im analysierten Gewebe vorhanden sind, und das detaillierte Verhalten sowie die Richtung von Actomyosin-Signalen zu verstehen.
    1. Öffnen Sie Fidschi, und stellen Sie sicher, dass eine TLM und die entsprechende Zellenmaske im Surface-Manager geöffnet ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Fidschi installiert und auf dem neuesten Stand ist und das Surface Manager Plugin installiert ist (Schritt 1.1.3.1).
    2. Öffnen Sie einen TLM mit Datei > Öffnen und wählen Sie einen tlM zum Öffnen aus (z. B. TestMovie1_bleach.tif). Laden Sie das Surface Manager Plugin über Plugins > Segmentierung > Surface manager(3D). Laden Sie die im Tutorial erstellte gespeicherte Zellmaske (z. B. ParticlesStack1.tif) über Datei > Öffnen und wählen Sie eine Zellmaske (z. B. ParticlesStack1.tif). Laden Sie den entsprechenden Interessenbereich (ROI, z.B. TestMovie1_RoiSet.zip). Siehe Abbildung 3A.
    3. Wechseln Sie zum Kanal des Interesses in der ausgewählten TLM.
      HINWEIS: Um die Kanäle zu unterscheiden, folgen Sie dem Farbcode, der um das TLM angegeben ist.
    4. Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Statistik, um das Fenster mit dem Namen Durchschnittlicher Grauwert Slice by Slice (Abbildung3B) abzuerhalten. Beachten Sie, dass die mittleren/medianen Intensitätswerte von Actomyosin-Signalen in einem bestimmten analysierten Kanal innerhalb der definierten Zellumrisse im Laufe der Zeit sowie andere Parameter im Zusammenhang mit dem Zellbereich und der Zellform angezeigt werden.
      HINWEIS: Die Intensitätswerte sind in Arbitraty Units (A.U.); Der Zellbereich ist in Pixeln und muss in quadratische Mikrometer umgewandelt werden.
    5. Speichern Sie die erhaltenen Werte als Tabellenkalkulationsdatei. Klicken Sie auf das Statistikfenster, Datei > Speichern unter.
      HINWEIS: Es ist möglich, die erhaltenen statistischen Werte später wie folgt zu überprüfen: Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM in Fidschi und öffnen Sie den Surface-Manager. Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip in die TLM, indem Sie die Schaltfläche Laden von der Festplatte drücken und die Datei öffnen. Die gespeicherte Maske mit Zellumrissen wird hochgeladen, und die Namen der Zellen werden im linken Fenster des Oberflächen-Managers angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik für statistische Werte.
  3. Manuelle Analyse einzelner subzellulärer Actomyosinsignale bei LCS
    HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die größte Konzentration und ist zeitaufwändig. Im Allgemeinen kann ein erworbenes TLM bequem innerhalb von 1 Tag analysiert werden. Dies schließt keine Zeit für die Flugvorbereitung vor der Entesse, der Sezierung selbst und der Bildaufnahme ein.
    1. Öffnen Sie eine ausgewählte, bleichkorrigierte und registrierte (driftkorrigierte) TLM in einer aktuellen Fidschi-Anwendung. Verwenden Sie als Testbeispiel einen bleichkorrigierten und driftkorrigierten TLM (z. B. TestMovie1_bleach_reg.tif).
    2. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, um die einzelnen Actomyosin-Signale mit Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrastzu sehen.
    3. Richten Sie TLMs in der gleichen Richtung relativ zur Gewebe-/Körperachse aus. Richten Sie bei Eikammern die vordere Seite der Eikammern vor der Analyse immer links vom Bild/Submovie/TLM aus.
    4. Teilen Sie den ausgewählten Film in kurze 30 s Submovies auf und projizieren Sie jeweils jeweils Zeitprojekt. Speichern Sie nicht zeit- und zeitprojizierte Teilfilme mit entsprechenden Namen. Bewahren Sie die ursprüngliche Quelle auf.
      HINWEIS: Submovies können aus originalen TLMs erstellt werden, indem zuerst unerwünschte Frames über Image > Stacks > Slice Removergelöscht werden. Definieren Sie die zu entfernenden Slices, und legen Sie Inkrement fest. Transformieren Sie in RGB, bevor Sie den Slice-Entferner verwenden, wenn Inkrement = 1. Um einen 30s-Unterfilm zeitzuproduzieren, klicken Sie auf Bild > Stapel > Z-Projekt > Max. Intensität für die definierten Frames (Slices) und dann auf OK. Überspringen Sie jeden zweiten 30 s Submovie, um zu vermeiden, dass actomyosin Signale 2x in zwei nachfolgenden 30 s Submovies gezählt werden.
    5. Platzieren Sie ein zeitprojiziertes Bild neben dem entsprechenden 30 s-Unterfilm (Abbildung 4A,B). Identifizieren Sie die Signalleitung im zeitprojizierten Unterfilm. Identifizieren Sie die Richtung der Actomyosin-Signalbewegung (0°–360°) entlang dieser Linie im ursprünglichen Submovie, indem Sie den Submovie manuell wiedergeben. Verwenden Sie das Werkzeug Winkel (in der Fidschi-Leiste), um die Richtung der Signalbewegung relativ zur definierten Gewebeachse oder einem ähnlichen verfügbaren Werkzeug manuell zu messen.
      HINWEIS: Fidschi arbeitet nur auf einer Skala von 0°–180° (Abbildung 4C), und eine Neuberechnung der erhaltenen Werte auf einer Skala von 0°–360° ist erforderlich. Eine Signalleitung entspricht der Flugbahn einer Actomyosin-Signalbewegung im Laufe der Zeit.
    6. Um Doppelarbeit bei der Analyse von Actomyosin-Signalen zu vermeiden, markieren Sie die analysierten Signallinien innerhalb von Zellen im zeitprojizierten Submovie (Abbildung 4B,D).
    7. Analysieren Sie alle ausgewählten Zellen im 30 s-Unterfilm, und speichern Sie die erhaltenen Winkel.
      HINWEIS: Analysieren Sie nur subzelluläre zytoplasmatische Actomyosinsignale in Zellen mit genau definierten Zellumrissen in einem TLM. Schließen Sie einzelne Zellen mit weniger als 15–20 erkannten Signalen im gesamten TLM aus. Ignorieren Sie Actomyosin-Signale, die sich aufgrund ihres unbekannten Ursprungs über Zellen bewegen. Ein Beispiel für die Signalanzahl für eine analysierte Zelle im 30 s Submovie ist in Abbildung 4Ddargestellt.
    8. Fahren Sie fort, bis alle 30 s-langen Submovies eines TLM analysiert werden, und speichern Sie alle gemessenen Winkel von Actomyosin-Signalen eines TLM in einer Tabellenkalkulationsdatei.
    9. Summiert alle gemessenen Winkel über die relevante Anzahl von TLMs (abhängig vom Experiment). Zeichnen Sie den Prozentsatz der Richtung der analysierten Actomyosin-Signale, z.B. als Rosendiagramm mit einem Bereich von 0° bis 360° mit einer bevorzugten Software.
      HINWEIS: Um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, werden fünf bis zehn unabhängige Eikammern jeder Eikammerstufe empfohlen, um analysiert zu werden.

2. Gewebeskala

HINWEIS: Um in vitro kultivierte Drosophila-Eikammern zu sezieren und abzubilden, folgen Sie dem Protokoll in DerErgänzungsdatei 2. Um erworbene TLMs zu analysieren, fahren Sie mit dem folgenden Protokoll fort. Begleitete Testdateien von TLMs werden in der Zusatzdatei 3abgelegt.

  1. Selektive Oberflächenextraktion von gekrümmten Epithelgeweben
    notiz:Dieses Protokoll ermöglicht es Benutzern, selektiv eine dünne Schicht von Actomyosin in einem gekrümmten Epithelgewebe im Laufe der Zeit zu extrahieren. Dieser Protokollschritt ist benutzerfreundlich und basiert auf einer intuitiven grafischen Oberfläche. Es ist möglich, mehrere TLMs bequem zu analysieren (Auszugsfläche). Verwenden Sie TestMovie2.czi (aus demErgänzende Datei 3) als Test-TLM-Beispiel.
    1. Öffnen Sie eine aktuelle Fidschi-Anwendung (Fidschi > Hilfe > Aktualisieren > Änderungen anwenden > OK).
    2. Stellen Sie sicher, dass das Ellipsoid Surface Projection Plugin15 installiert ist. Viktorinova et al. 16.
    3. Öffnen Sie ein TLM und exportieren Sie es als XML/HDF5-Datei, indem Sie auf Plugins > BigDataViewer > Aktuelles Bild als XML/HDF5-Dateiexportieren klicken.
      HINWEIS: Es ist erforderlich, einen Exportpfad zu definieren. Die Speicherung selbst kann mehrere Minuten dauern und hängt von der TLM-Länge ab.
    4. Öffnen Sie die exportierte Datei in Ellipsoid Surface Projection, indem Sie auf Plugins > BigDataViewer > Ellipsoid Surface Projection > XML-Datei auswählenklicken.
      HINWEIS: Es wird ein neues Fenster mit sagittalen Ansichten der Eikammer und einem Dialog angezeigt, der den Benutzer durch die Verarbeitung führt. Details zum Navigieren in der Slice-Ansicht finden Sie unter https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. Das Dialogfenster mit dem Namen Ovarprojektion hat mehrere Registerkarten. Definieren Sie in der ersten Dialog-Registerkarte mit dem Namen Begrenzungsrahmen die x- und y-Ränder einer Eikammer im TLM zusammen mit der z-Breite des Begrenzungsrahmens (d. h. die Tiefe einer Z-Stack/Ei-Kammer) und drücken Sie den Satz ( Abbildung5A).
    6. Um Rahmen zu definieren, ziehen Sie die Schaltflächen neben x, y und z, oder definieren Sie die Zahlenkoordinaten in den Feldern x, y und z. Stellen Sie sicher, dass die Ränder großzügig genug sind, um den Teil der Eikammer, der von Interesse ist, in die Oberflächenextraktion zu bringen. Die ausgewählten Teile der Eierkammer sind rosa hervorgehoben.
    7. Wechseln Sie zur Registerkarte "Blobs suchen" im Fenster Ovarienprojektion. Definieren Sie das Sigma und den minimalen Spitzenwert; Drücken Sie dann die Berechnung, um die Actomyosin-Signale zu identifizieren (Abbildung 5B), die als grüne Blobs angezeigt werden. Wiederholen Sie diesen Schritt mit verschiedenen Parametern, bis genügend Flecken (ca. 100) gefunden werden.
      HINWEIS: Sigma 1-u20123 mit minimalem Spitzenwert 20-u2012100 funktioniert am besten, um Actomyosin-Signale der Stufe-6 bis -8-Ei-Kammern zu identifizieren. Die Identifizierung von Actomyosin-Signalen ist ein entscheidender Schritt und hängt von der Signalqualität und ihrer Größe ab. Es ist wichtig, die korrekte Größe der vorhandenen Blobs zu bestätigen. Keine sichtbaren grünen Flecken/Blobs im Bild bedeutet, dass der nächste Schritt nicht funktioniert. Durchsuchen Sie die ausgewählten Z-Ebenen, um Blobs anzuzeigen.
    8. Um das Ellipsoid zu entwerfen, fahren Sie mit der Registerkarte "Ellipsoidanpassen" fort. Legen Sie Zufallsstichproben auf 10.000, Außen-/Innenschnittentfernung auf 1-u201210 fest, und klicken Sie dann auf Berechnen (Abbildung 5C).
      HINWEIS: Je geringer der Abstand, desto genauer ist das gewünschte Ellipsoid. Danach wird die Registerkarte "Projektion" automatisch geöffnet und ermöglicht die Definition der Oberflächenextraktion. Die Einstellungen müssen optimiert werden.
    9. Fahren Sie mit der Registerkarte Projektion (Abbildung 5D) fort. Richten Sie einen minimalen und maximalen Projektionsabstand ein (d. h. die Breite des gewünschten Ellipsoids). Es ist erforderlich, einen minimalen und maximalen Projektionsabstand festzulegen, so dass der rosa definierte Ellipsoidbereich die gesamte Außenschicht der Eikammer umfasst. Definieren Sie den Slice-Abstand (1 wird empfohlen).
      HINWEIS: Beispiele für eine falsche und optimale Ellipsoidpassung, die zu falschen und optimalen Projektionsparametern führt, sind in Abbildung 6A,Cdargestellt. Die dünne Umfangsschicht des Interesses kann später definiert werden. Stellen Sie sicher, dass der rosa Bereich des Ellipsoids mit der definierten Breite auf der Eikammer sichtbar ist, bevor Sie die Berechnung drücken. Es ist wichtig, dass das gewünschte Ellipsoid (rosa Single Line) gut auf die Ellipsoidoberfläche einer Eikammer passt, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Wenn die Ellipsoidpassung nicht gut ist, ordnen Sie verschiedene Einstellungen an, bis die gewünschte Oberflächenextraktion erreicht ist.
      1. Legen Sie eine Ausgabebreite (ca. 800) und eine Höhe (ca. 400) des Ellipsoids fest. Legen Sie fest, ab welchem Zeitpunkt die Oberflächenextraktion erstellt werden soll (d. h. definieren Sie die Länge der TLM-Extraktion). Wählen Sie entweder eine kugelförmige oder eine zylindrische Projektion aus. Flip Z und Y bei Bedarf ausrichten.
      2. Drücken Sie die Berechnung, um eine Oberflächenextraktion für beide Kanäle in neuen Fenstern namens Imagezu erhalten. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der erhaltenen Bildfenster an, um die projizierten Actomyosin-Signale sehen zu können, indem Sie auf Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast klicken.
        HINWEIS: Ein Beispielvergleich einer Projektion, die aus einer falschen und optimalen Ellipsoidpassung resultiert, ist in Abbildung 6B,Ddargestellt.
    10. Wenn die Oberflächenextraktion gut aussieht, speichern Sie die Bilder (beide Kanäle separat) als .tiff. Speichern Sie außerdem die Log-Fensterdatei, um zu künftig darauf hinzuweisen, wie die Oberfläche dieser bestimmten Eikammer extrahiert wurde.
      HINWEIS: Dies ist eine besonders wichtige Information, wenn die extrahierte dünne Schicht in ihre ursprüngliche entfaltete Form zurückversetzt werden soll (nur für Entwickler).
    11. Führen Sie die Kanäle mit einem bevorzugten Farbcode in Fidschi zusammen.
      HINWEIS: Projizieren Sie bei Bedarf ausgewählte Z-Stack-Layer mit Actomyosin-Signalen. Die Projektion ausgewählter Z-Stack-Layer ist erforderlich, wenn sich der Erfassungsfokus im Laufe der Zeit in einem TLM leicht ändert. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, projizieren Sie höchstens ein bis zwei Z-Stack-Layer.
    12. Speichern Sie die Ergebnisse als .tiff-Dateien.
      HINWEIS: Repräsentative Beispiele für dünne Schichten (selektive Basal- und Apikaloberfläche), die das Myosin II (MRLC::GFP) Signal aus dem Follikelepithel der Kontroll- und Fett2-mutierten Eikammern darstellen, finden sich in Abbildung 8.
  2. Datenverarbeitung einer selektiv extrahierten Gewebeoberfläche
    1. Bleach-korrektur die TLMs, um den Intensitätszerfall der Fluoreszenzetiketten auszugleichen.
      1. Öffnen Sie Fidschi. Öffnen Sie einen TLM (z. B. TestMovie2_extraction.tif aus der Zusatzdatei 3) mit Datei > Öffnen. Wählen Sie das Bild aus, um es zu öffnen.
      2. Teilen Sie die Farbkanäle auf und konvertieren Sie sie ggf. in 16-Bit-Bilder, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilenklicken. Konvertieren Sie die Kanäle in 16-Bit-Bilder (aus 32-Bit-Bildern) mit Bild > Typ > 16-Bit.
      3. Führen Sie eine Bleichkorrektur auf beiden Kanälen mit Bild > Anpassen > Bleichkorrektur > Einfaches Verhältnis > Hintergrundintensität 0.0.
        HINWEIS: Wenn unbefriedigende Ergebnisse erzielt werden, ist es erforderlich zu untersuchen, welche Korrekturmethoden in diesem Plugin am besten passen (z. B. Verwenden Sie Histogram Matching anstelle eines Simple Ratio).
      4. Führen Sie die Kanäle aus den beiden bleichkorrigierten Bildern zusammen, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle zusammenführenklicken. Speichern Sie das zusammengeführte Bild als .tiff-Datei, indem Sie auf Datei > Speichern unter > Tiffklicken.
        HINWEIS: Passen Sie bei Bedarf den Kontrast und die Helligkeit der Kanäle an.
    2. Zellsegmentierung zum Generieren einer Zellmaske für TLMs
      1. Wenn Fidschi noch nicht geöffnet ist, öffnen Sie es erneut (und stellen Sie sicher, dass es auf dem neuesten Stand ist, indem Sie auf Hilfe > Aktualisieren > Änderungen anwenden > OK) klicken.
      2. Wenn dies noch nicht der Fall ist, laden Sie das Makro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm) herunter.
      3. Ziehen Sie dieses Skript nach Fidschi. Öffnen Sie die bleichkorrigierte Datei (z. B. TestMovie2_bleach.tif aus der Zusatzdatei 3, siehe auch 2.2.1).
      4. Teilen Sie die Kanäle der bleichkorrigierten Datei auf, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilenklicken. Passen Sie den Membrankanal an, um klare Zellumrisse zu gewährleisten, indem Sie auf Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrastklicken.
      5. Führen Sie das hochgeladene Skript auf dem aktiven Zellmembrankanal des ausgewählten TLM aus, indem Sie das Symbol Ausführen im geöffneten Skript drücken. Setzen Sie Gaußsche Unschärfe auf 1.500. Legen Sie die Empfindlichkeit für die Zellerkennung auf -1 fest, und klicken Sie auf OK. Legen Sie die geschätzte Rauschtoleranz für TLMs, die mit dem 40-fachen Ziel erworben wurden, auf 8 € fest, und klicken Sie auf OK.
        HINWEIS: Um eine schöne Zellmaske zu erhalten, ändern Sie diese Parameter oben nicht. Für andere Ziele können unterschiedliche Parameter erforderlich sein. Je sauberer der Hintergrund in einem TLM, desto geringer ist die geschätzte Geräuschtoleranz.
      6. Eine generierte Zellmaske erscheint im analysierten TLM und auch in einem neuen Fenster namens ParticleStack (G). Darüber hinaus wird ein kleines Fenster mit dem Namen Aktion erforderlich angezeigt. Konzentrieren Sie sich in der Zellenmaske auf dem TLM nur auf Zellen in der Mitte des TLM, und wählen Sie diejenigen aus, die vollständige und klar definierte Gliederungen im gesamten TLM bereitstellen können.
      7. Wenn ausgewählte Zellen künstliche/zusätzliche Zellumrisse enthalten, verwenden Sie das Zusammenführungswerkzeugfenster mit dem Namen Aktion erforderlich im TLM. Befolgen Sie für letztere die Anweisungen im Fenster.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Zellumrisse gut definiert sind und realen Zellmembranen in einem TLM entsprechen, da jede Ungenauigkeit nachfolgende Analysen beeinflussen kann. Zusätzliche Optimierungen und Änderungen, wie z. B. das Entfernen unerwünschter Zellen, können später mit dem Surface-Manager-Tool (im Tutorial unten beschrieben) durchgeführt werden.
      8. Wenn ausgewählte Zellen in der Mitte gut den echten Zellmembranen entsprechen, speichern Sie den ParticleStack als .tiff-Datei nach Datei > Speichern unter > Tiff. Führen Sie das Laden der generierten Zellmaske und die Actomyosin-Analyse in Surface Manager wie zuvor in den Abschnitten 1.1.3 und 1.2 (auch in den Abschnitten 2.2.3 und 2.3) beschrieben.
    3. Laden der generierten Zellmaske in surface manager
      1. Wenn das Surface Manager Plugin bereits im verwendeten Fidschi-Setup installiert ist, fahren Sie mit Schritt 2 fort. Wenn nicht, folgen Sie Viktorinova et al.16. Für Entwickler ist nur der Quellcode auch15verfügbar.
      2. Öffnen Sie Surface Manager, indem Sie auf Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D)klicken.
        HINWEIS: Im Fenster Oberflächen-Manager werden auf der rechten Seite mehrere Aktionsschaltflächen und links ein leeres Fenster angezeigt. Um alle Aktionsschaltflächen anzuzeigen, kann es erforderlich sein, das Fenster in seiner Höhe/Breite zu dehnen. Beachten Sie, dass Zeitrahmen als Z-Slices angezeigt werden.
      3. Öffnen Sie die entsprechende ParticleStack.tif-Datei in Surface Manager über Datei > Öffnen und wählen Sie das zu öffnende Bild aus (z. B. ParticleStack2.tif aus der Zusatzdatei 3).
      4. Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Umrissbild lesen, und legen Sie den Jacquard-Index auf 60 % fest.
        HINWEIS: Das Laden einer ParticleStack.tif-Datei kann je nach Computerleistung bis zu mehrere Minuten dauern.
      5. Nach dem Laden wird jede Zelle mit einer S-Nummer zugewiesen und im linken Teil des Surface-Manager-Fensters angezeigt (Abbildung 7A).
        HINWEIS: Um Umrisse und Zellennamen für alle Zellen anzuzeigen, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Alle anzeigen und Beschriftungen anzeigen am unteren Rand des Fensters Oberflächen-Manager. Es wird empfohlen, diese Funktion zu verwenden, sobald die Zellennummern auf ihre Richtigkeit überprüft wurden.
      6. Klicken Sie auf die erste S-Nummer; Die importierte Zellumrisslinie aus ParticleStack.tif wird auf dem TLM angezeigt. Überprüfen Sie jede importierte S-Nummer auf Die Zellenumrissqualität im gesamten TLM, und entfernen Sie unerwünschte Zellen, die falsche Zellumrisse anzeigen. Markieren Sie dazu die Zellumrisslinie und klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen.
        HINWEIS: Es ist auch möglich, ungenaue Zellumrisse zu korrigieren und neue Zellumrisse hinzuzufügen. Dies wird im Diskussionsabschnitt beschrieben.
      7. Speichern Sie alle korrigierten Zellen als RoiSet.zip-Datei, indem Sie die Schaltfläche Auf Festplatte speichern drücken.
        HINWEIS: Wenn die Sitzung unterbrochen werden muss, ist es möglich, die RoiSet.zip-Datei später in den Surface-Manager zu laden: Öffnen Sie eine TLM in Fidschi über Datei > Öffnen und wählen Sie eine TLM. Öffnen Sie Surface Manager wie folgt: Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D). Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip, indem Sie auf die Schaltfläche Von Disc laden klicken und die entsprechende RoiSet.zip-Datei auswählen (z. B. TestMovie2_RoiSet.zip). Überprüfen Sie, ob die geladenen Zellenmasken dem geladenen TLM entsprechen.
  3. Analyse von Actomyosin-Impulsen im Surface Manager
    HINWEIS: Öffnen Sie Fidschi, und stellen Sie sicher, dass eine TLM und die entsprechende Zellenmaske im Surface-Manager geöffnet ist. Stellen Sie sicher, dass Fidschi installiert und auf dem neuesten Stand ist und das Surface Manager Plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) installiert ist.
    1. Öffnen Sie einen TLM mit Datei > Öffnen und wählen Sie einen tlM zum Öffnen aus (z. B. TestMovie2_bleach.tif). Laden Sie das Surface Manager Plugin über Plugins > Segmentierung > Surface manager(3D). Laden Sie die im Tutorial erstellte gespeicherte Zellmaske (z. B. ParticlesStack2.tif) über Datei > Öffnen und wählen Sie eine Zellmaske (z. B. ParticlesStack2.tif). Laden Sie den entsprechenden ROI (z. B. TestMovie2_RoiSet.zip).
    2. Wechseln Sie zum Kanal des Interesses in der ausgewählten TLM.
      HINWEIS: Um zwischen den Kanälen zu unterscheiden, folgen Sie dem Farbcode, der um das TLM angegeben ist.
    3. Klicken Sie im Oberflächen-Manager auf die Schaltfläche Statistik, um das Fenster mit dem Namen Durchschnittlicher Grauwert Slice by Slice (Abbildung7B )zu erhalten. Beachten Sie, dass die mittleren/medianen Intensitätswerte von Actomyosin-Signalen in einem bestimmten analysierten Kanal innerhalb der definierten Zellumrisse im Laufe der Zeit sowie andere Parameter im Zusammenhang mit dem Zellbereich und der Zellform angezeigt werden.
      HINWEIS: Die Intensitätswerte sind in A.U.; Der Zellbereich ist in Pixeln und muss in quadratische Mikrometer umgewandelt werden.
    4. Speichern Sie die erhaltenen Werte als Tabellenkalkulationsdatei: Klicken Sie auf das Statistikfenster, Datei > Speichern unter.
      HINWEIS: Es ist möglich, die erhaltenen statistischen Werte später wie folgt zu überprüfen. Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM in Fidschi. Öffnen Sie den Surface-Manager. Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip in die TLM, indem Sie die Schaltfläche Laden von der Festplatte drücken und die Datei öffnen. Die gespeicherte Maske mit Zellumrissen wird hochgeladen, und die Namen der Zellen werden im linken Fenster des Oberflächen-Managers angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik für statistische Werte.
      HINWEIS: In Bezug auf eine manuelle Analyse einzelner subzellulärer Actomyosinsignaleist es nicht möglich, eine manuelle Analyse subzellulärer Actomyosinsignale auf der Gewebeskala durchzuführen. Für die Analyse einzelner Actomyosinsignale auf der Halbgewebeskala ist eine Optimierung erforderlich, wie im Diskussionsteil hervorgehoben.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, das Verhalten von Actomyosin-Netzwerken in Epithelgeweben zu untersuchen. Dies ist nur möglich, wenn eine detaillierte Analyse des Actomyosin-Verhaltens auf der lokalen Zellskala (einige Zellen) mit einer ähnlichen Analyse auf der Gewebeskala (viele Zellen) kombiniert wird. Epithelgewebe sind jedoch oft gekrümmt und die Extraktion einer dünnen Schicht dieser Gewebe war bisher nicht leicht möglich, wie in Drosophila-Eikammern (

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische Schritte und Fehlerbehebung bei der Zerlegung und Kultivierung von Eierkammern

Wenn zu viele Fliegen in eine kleine Durchstechflasche gelegt werden, kann das Fliegenfutter nach 2–3 Tagen schlammig werden, da große Mengen an Fütterungslarven und erwachsenen Fliegen im Fliegenfutter gefangen werden. In einem solchen Fall, kippen Sie den Rest dieser Fliegen in eine neue Durchstechflasche mit frischem Essen und verkleinern ihre Anzahl. Insbesondere schließen Sie Frauen a...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren sind Miriam Osterfield sehr dankbar, dass sie ihre Ratschläge zur In-vitro-Lebensbildgebung von Eierkammern nach einem Ansatz des Celeste Berg Labors4gegeben hat. Wir danken auch Sebastian Tosi für das Fidschi-Skript, das die Zellsegmentierung ermöglicht.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Schneider MediumGibco21720-024[+]-Glutamin
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122 [ +] 10.000 Einheiten/ml Penicillin [+] 10.000 &Mikro; g/mL Streptomycin
Fötales RinderserumSigma  F135Hitzeinaktivierte
Insulinlösung HumanSigma  I9278
50 mL Falcon RöhrchenEppendorfsteriler
Millex-GV FilterMilliporeSLGV033NS33 mm
Glasboden-MikrotiterschalenMatTek CorporationP35G-1,5-14-C35 mm Petrischale, 14 mm Mikrowelle, Nr. 1,5 Deckglas
PinzetteA. Dumont & #55
CellMask Deep Red (Zellmembranfarbstoff)InvitrogenC10046
FM4-64 (Zellmembranfarbstoff)ThermoFisher/InvitrogenT13320
Objektträger für DepressionsdissektionFisher Scientific12-560B
Mikroskopische Geräte
Steromikroskopz.B. ZeissStemi SV 6
Inverses Konfokalmikroskopz.B. Zeiss/Olympus
Spinning Disc Mikroskopz.B. Zeiss/Andor
Mikroskopisches Glas/Deckglasz.B. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus Tool
Wironit NadelhalterHammacher9160020
Kaktus stachelEchinocactus grusonii/Fasskaktus
Drosophila im Manuskript verwendete Stämme
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFPFür Details siehe Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Natur 2010, Bd. 468, S. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103CDetails siehe Viktorinova et al.: Die Epithelrotation geht der planaren Symmetriebrechung von Actomyosin voraus und schützt das Epithelgewebe vor Zellverformungen. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Ausgabe 11, S. e1007107.
Für

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511(2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

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