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Wie den Anteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu quantifizieren

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DOI:

10.3791/58588

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7. Januar 2019

 , 
1Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die genetisch gekoppelten spektral unterschiedliche Photoactivatable und fluoreszierende Proteine beteiligt. Diese fluoreszierenden Proteins Chimären erlauben Quantifizierung der PA-FP-Fraktion, die photoaktiviert, fluoreszierende, d. h. die Photoaktivierungen Effizienz. Das Protokoll zeigt, dass verschiedene Modi der Photoaktivierungen verschiedenen Photoaktivierungen Effizienz ergeben.

Zusammenfassung

Photoactivatable und -Cabrio fluoreszierende Proteine (PA-FPs) haben im Leben-Zelle Fluoreszenzmikroskopie verwendet worden, für die Analyse der Dynamik der Zellen und Protein-Ensembles. Bisher keine Methode zur Verfügung, in der Masse zu quantifizieren und Live Zellen wie viele der PA-FPs ausgedrückt werden photoaktiviert zur Fluoreszenz.

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit internen Herrscher, d. h. genetisch gekoppelten fluoreszierende Proteine spektral unterschiedliche (Photoactivatable), Ratiometrically den Anteil an alle PA-FPs ausgedrückt in einer Zelle, die eingeschaltet sind, zu quantifizieren fluoreszierende. Anhand dieses Protokolls zeigen wir, dass verschiedene Modi der Photoaktivierungen verschiedene Photoaktivierungen Effizienz erzielt. Kurze Hochleistungs-Photoaktivierungen mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) führte bis zu viermal niedriger Photoaktivierungen Effizienz als Hunderte von Low-Level-Aufnahmen von CLSM angewendet oder ein kurzer Impuls von Weitfeld Beleuchtung angewendet. Während das Protokoll hier für GFP (PA-) und (PA)-Cherry veranschaulicht wurde, kann es im Prinzip jedes spektral unterschiedliche Photoactivatable oder Photoconvertible fluoreszierendes Protein-paar und jeder Versuchsanordnung angewendet werden.

Einleitung

Im Jahr 2002 wurden die ersten breit anwendbar Photoactivatable (PA-GLP-1) und Photoconvertible (Kaede2) fluoreszierende Proteine beschrieben. Diese optische Textmarker fluoreszierende Proteine ändern ihre spektralen Eigenschaften nach Bestrahlung mit UV-Licht, d. h. sie werden hell (Photoactivatable fluoreszierende Proteine, z.B. PA-FPs) oder ändern ihre Farbe (Photoconvertible FPs). Bisher wurden mehrere reversible und irreversible Photoactivatable und Photoconvertible fluoreszierende Proteinen entwickelten3,4. In Ensemble oder Bulk Studien haben optische Textmarker verwendet wurde, um die Dynamik der ganze Zellen oder Proteine und subzelluläre Kompartimente-Konnektivität zu studieren. Darüber hinaus basiert optische Textmarker aktiviert Einzelmolekül-hochauflösendes bildgebende Verfahren wie PALM5 und FPALM6.

Obwohl die Foto-chemische während der Prozesse Photoaktivierungen oder -Konvertierung sind für viele optische Textmarker und sogar kristallographische Strukturen beschrieben worden, vor und nach der Photoaktivierungen / - Konvertierung zur Verfügung7 vorgenommen wurden , 8, der zugrunde liegenden Fotophysikalische Mechanismus des Photoaktivierungen und -Konvertierung wird nicht vollständig verstanden. Darüber hinaus bisher nur grobe Schätzungen existieren der Effizienz der Photoaktivierungen und -Konvertierung, d. h. den Anteil der fluoreszierenden Proteinen ausgedrückt, d. h. eigentlich Photoconverted oder photoaktiviert, fluoreszierend sein. In-vitro- Ensemble Studien haben berichtet worden, die Verschiebung der Absorptionsspektren und die Höhe der Native Quantifizierung und aktiviert Protein in einem Gel9,10,11.

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit fluoreszierenden Proteins Chimären um den Bruchteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu beurteilen. Wenn arbeiten mit genetisch codierte fluoreszierende Proteine, die absolute Menge an Protein ausgedrückt variiert von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Eine Zelle mit dem Ausdruck einer PA-FP zeigt ein heller Signal nach Photoaktivierungen als eine andere Zelle, kann nicht unterschieden werden, wenn diese hellere Signal aufgrund der höheren Ausdruck des PA-RP oder eine effizientere Photoaktivierungen des PA-RP ist. Um die Expression in Zellen zu standardisieren, führen wir interne Herrscher von genetisch gekoppelten spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine. Durch Kopplung die genetische Information eines Photoactivatable fluoreszierenden Proteins, ein spektral unterschiedliche immer auf fluoreszierende Proteine, interne Herrscher erstellt wird, noch eine unbekannte Gesamtbetrag, sondern in einem behobenen und bekannten relativen Zeitraum ausgedrückt werden 1: 1. diese Strategie ermöglicht der quantitative Charakterisierung der verschiedenen UV-Licht Photoaktivierungen Regelungen, d. h. die Bewertung der relativen Höhe der PA-FPs, die photoaktiviert mit verschiedenen Modi der Photoaktivierungen kann, und dadurch ermöglicht Photoaktivierungen Schemata definieren, die effektiver als andere sind. Darüber hinaus ermöglicht diese Strategie im Prinzip die absolute Quantifizierung der photoaktiviert PA-FP-Fraktion. Zu diesem Zweck ist es wichtig zu erkennen, dass die vorgestellten Ensemble Studien Intensität-basierte wodurch die Analyse komplexer, da in diesem Protokoll angelegt. Parameter bestimmen die gemessene Intensität der Fluoreszenz, d. h. unterschiedliche molekulare Helligkeit, Extinktion und Emissionsspektren und Bund Effekte, müssen berücksichtigt werden, beim Vergleich von Fluoreszenz-Intensität von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen.

Die vorgestellten ratiometrischen Intensität-basierte Quantifizierung der Photoaktivierungen Effizienz ist beispielhaft für PA-GFP und PA-Kirsche in lebenden Zellen, aber prinzipiell breit anwendbar und eignet sich für jede Photoactivatable fluoreszierendes Protein unter Versuchsbedingung.

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Protokoll

(1) Plasmid Bau

  1. Zweifarben-Fusion-Sonden zu generieren. Verwenden Sie eine Säugerzelle Expressionsvektor (siehe Tabelle der Materialien) in die mCherry112 und PA-mCherry1-13 mit der Einschränkung eingefügt wurden Seiten AgeI und BsrGI.
  2. Bestellen Sie benutzerdefinierte Oligo-Nukleotide, die Monomeren Varianten eGFP und PA-eGFP mit A206K Mutation, d. h. mEGFP und PA-mEGFP14 ohne ein Stopcodon als SalI-BamHI Fragment zu verstärken. Verwenden Sie die N-terminale Primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' und die C-terminale Primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3' und legen Sie dieses SalI-BamHI -Fragment in die Site mit mehreren Klonen des Expressionsvektors. Dadurch wird den fünf Aminosäure Linker RNPPV zwischen den grünen und roten fluoreszierenden Proteins erstellt. Verweisen wir auf das Fluorophor Chimären wie GFP – Kirsche, PA-GFP — Kirsche und GFP-PA-Kirsche für den Rest dieses Artikels.
    Hinweis: Die Kopplung von Fluorophore und Schaffung der internen Herrscher Photoaktivierungen Effizienz bewerten kann erfolgen mit zwei beliebigen spektral unterschiedliche Fluorophor, z. B. Superfolder PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, etc. Viele der Photoactivatable fluoreszierende Proteine stammen aus GFP. Daher kann die Primer Sequenz oben angegebenen für viele fluoreszierende Proteine Fluorophor Chimäre in einer Säugerzelle Expressionsvektor konstruieren verwendet werden.

2. Handy-Kultur und Transfektion

  1. Verwenden Sie entweder eine standard Zelllinie wie HeLa, NRK, Cos-7 oder eine bestimmte Zell-Linie für bestimmte Photoaktivierungen Experimente verwendet werden. DMEM (ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum und 2 mM Glutamin) und Trypsin ohne Phenol rot zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), um Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
  2. Die Zellen einer konfluierende Kultur mit Trypsin zu lösen, die Anzahl der Zellen in der Zellsuspension mit einer Neubauer-Kammer und 5.000 – 10.000 Samenzellen pro Bohrloch. Alternativ können Sie 1 Tropfen aus einer 2-mL-Pipette eine 10 mL Zellsuspension aus einer konfluierende Zellkultur gewachsen in einem T-25-Zellkultur-Kolben oder 3 Tropfen aus einer 5 mL Zellsuspension aus einer konfluierende Kultur in einem T-12,5-Zellkultur-Kolben angebaut.
  3. Wachsen Zellen in 8-Brunnen Kammern mit #1.0 Abdeckung Glas (siehe Tabelle der Materialien) für live-Cell-Fluoreszenzmikroskopie.
  4. Transfizieren Zellen 24 h nach der Beschichtung mit kommerziellen Reagenzien (siehe Tabelle der Materialien) pro Verteiler Protokoll mit der GFP – Kirsche, PA-GFP – Kirsche und GFP-PA-Cherry Chimären.
  5. Bildzellen nach insgesamt 20 h post Transfektion, um Protein-Expression, Falt- und Reifung ermöglichen.

(3) Bildgebung und Photoaktivierungen

  1. Bildzellen in eine befeuchtete und beheizten Klimakammer bei 37 Grad Celsius. Die Zelle-Medien bei physiologischen pH-Puffer und CO2-unabhängige, 20 mM HEPES hinzufügen oder verwenden, CO2 -Gas, 5 % Durchfluss eingestellt.
  2. Erstes Bild Zellen mit dem Ausdruck der GFP-Cherry Konstrukt. Stellen Sie Parameter ein, die Zeit integriert Laserstärke pro Pixel in einem konfokalen Bild, d. h. Pixel Verweilzeit in Mikrosekunden, akusto-optischen durchstimmbare Filter (Aventurien) Übertragung in Prozent und digitaler Zoom definieren.
    Hinweis: Mit einer 60 X Objektiv und ein digitaler Zoom 3 x Bildgebung einer Zelle in ihrer Gesamtheit gleichzeitig ausreichender Vergrößerung ermöglicht. Legen Sie Pixel Verweilzeit 2-4 μs und Aventurien Übertragung für den 488 nm und 561 nm Laser derart, dass Bilder ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ohne jede bleichen zeigen und keine Pixel angibt Fluoreszenz Intensität Sättigung.
  3. Bild, mit dem Set Laserleistung, Aventurien Übertragung, Pixel Verweilzeit und digitaler Zoom, 15-20 Zellen mit dem Ausdruck GFP-Kirsche.
  4. Dann, mit der gleichen Set Laserleistung, Pixel Verweildauer, Aventurien Übertragung und Digitalzoom Zellen mit dem Ausdruck GFP Bild — PA-Kirsche und PA-GFP-Kirsche. Suche nach Zellen in den Grün-Kanal oder roten Kanal bzw. zum Ausdruck zu bringen. Vermeiden Sie lange der Zellen bei der Suche nach Ausdruck Zellen um die fluoreszierende Proteine nicht bleichen.
  5. Richten Sie eine Mini-Zeitreihe mit einem Pre-Aktivierung Bild und drei Post-Aktivierung-Bilder. Die Post-Aktivierung Bilder identifizieren potenzielle dunkle Übergangszuständen durch die Einwirkung von UV-Licht.
    Hinweis: In unseren Händen, Veränderungen im erkannten Fluoreszenzintensität aufgrund vorübergehender dunkle Zustände wurden < 1 % und könnte vernachlässigt, aber diese dunklen Staaten für jeden Versuchsanordnung bewertet werden sollen.
  6. Um Photoaktivierungen Effizienz zu bestimmen, d. h. der Anteil der PA-FPs, das eingeschaltet ist, Leuchtstofflampen, in den spezifischen Photoaktivierungen Experimenten, die bereits etabliert sind, gelten die gleichen Photoaktivierungen Einstellungen für 15-20 Zellen, die sind Ausdruck der internen Herrscher hier eingeführt und fahren Sie mit Bildanalyse (Abschnitt 4). Wenn am Anfang Photoaktivierungen Experimente einrichten, finden Sie hier ein paar unterschiedliche Einstellungen basierend auf unsere experimentelle Erfahrungen mit PA-GFP und PA-Cherry; ändern Sie nach Bedarf.
    1. Sofortige Photoaktivierungen von PA-GFP und PA-Kirsche mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) beantragen Sie bzw. 90 Wμ von 405 nm Laserlicht in 3 oder 5 Iterationen.
      Hinweis: Mit unserem mikroskopischen Aufbau, gemessen mit einem 38 % AOTM Getriebe und eine Verweilzeit 2 μs Pixel, wir dieser 405 nm Laserleistung in Line-Scan-Modus an der Objektivlinse. Mit diesen Einstellungen kann etwa 8 % und 16 % der PA-GFP und PA-Cherry ausgedrückt photoaktiviert fluoreszierend sein. Die gesamte Titration-Serie mit CLSM für sofortige Photoaktivierungen wurde veröffentlichten früher17.
    2. Wenn Sie einen höheren Anteil von photoaktiviert PA-GFP und PA-Cherry Fluorophore ist vorteilhaft z.B. ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, und Photoaktivierungen muss nicht sofort erfolgen, gelten Sie 40 Wμ von 405 nm Laserlicht mit 2 μs Pixel Verweilzeit und 6 % Aventurien Getriebe für 450 Iterationen. Dann, Photoaktivierungen dauert bis zu 4 min im Gegensatz zu nur 1 bis 2 Sekunden, aber Photoaktivierungen Effizienz für PA-GFP werden 29 % statt 8 %, so dass für ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis.
  7. Wenn ein Mosaik digitales Beleuchtungssystem, das Mikro-Spiegel-Arrays in einer räumlichen Lichtmodulator enthält verfügbar ist, kann 405nm Laser-Licht für Weitfeld-Photoaktivierungen verwendet werden. Dies ermöglicht eine effiziente Photoaktivierungen innerhalb von Millisekunden.
    Bemerkung: Mit 1,6 mW Laserleistung gemessen an der Objektivlinse und eine Belichtungszeit von 250 ms, kann 29 % der PA-GLP photoaktiviert fluoreszierend sein.
  8. Bild mit Parameter Set Photoaktivierungen 15-20 Zellen mit dem Ausdruck PA-GFP – Kirsche und GFP – PA-Kirsche, beziehungsweise.
  9. Da pH-Wert, reaktive Sauerstoffspezies und andere Umweltfaktoren Photoaktivierungen Effizienz beeinflussen können, kann es wichtig sein zu beurteilen Photoaktivierungen Wirkungsgrade von PA-FPs in den jeweiligen subzellulären Micromilieu wo ist das Protein des Interesses Das Hotel liegt. Durch die Kopplung der Fluorophor Chimären, das Protein des Interesses, wie die Autoren mit der Plasmamembran Protein VSVG 18, getan haben kann Photoaktivierungen Effizienz im spezifischen subzelluläre Abteil des Interesses beurteilt werden.

4. Bild-Analyse und Algorithmus ratiometrischen Intensität-basierte Quantifizierung der Photoaktivierungen Effizienz

  1. Bildanalyse erfolgt mit der open-Source-Bildverarbeitungs-Plattformen ImageJ oder Fidschi. Bestimmen der Fluoreszenzintensität Hintergrund nicht transfizierten Zellen in grün (B1) und rot (B2)-Kanal. Vermeiden Sie Perinukleäre oder alle Bereiche zeigen erhöhte Auto-Fluoreszenz.
  2. Um die Fluoreszenzintensität in transfizierten Zellen bestimmen, umreißen Sie die Zellkörper mit dem Freihand-Auswahl-Werkzeug. Wiederum zu vermeiden Perinukleäre oder anderen Bereichen Auto-Fluoreszenz zeigen.
  3. Subtrahieren Sie den Hintergrund aus der gemessene Fluoreszenzintensität in jedem Kanal.
    IchG = IGreen_measured -B1
    IR = IRed_measured – B2
  4. Verwenden der GFP-Cherry Konstrukt zu berechnen Sie das Verhältnis von rot-grün (RtoGr) und für die Spender-Abschreckung durch Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) zu korrigieren. Der FRET-Effizienz E war entschlossen, 0,3 in früheren Experimenten für die GLP-Cherry Konstrukt mit der gleichen Aminosäure Linker zwischen zwei Fluorophore18.
    RtoGr = (ichRed_measured – B2) / (ichGreen_measured – B1)
    RtoGrCorr = RtoGr * (1-E)
    Hinweis: In dieser Intensität-basierte Ansatz, Spender für mEGFP und PA-mGFP abschrecken abweichen möglich unterschiedliche spektrale Eigenschaften nicht charakterisiert. Die Rate der Bund (kET) und der Foerster-Abstand (R0) hängen die Quantenausbeute des Spenders, mEGFP und PA-mGFP nicht bestimmt worden sind.
  5. Verwenden der GFP-PA-Cherry Konstrukt zu beurteilen, den Anteil der photoaktiviert PA-Kirsche. Bestimmen der erwarteten Fluoreszenzintensität von PA-Kirsche durch Multiplikation der gemessenen ungestillten grüne Fluoreszenzintensität von der GFP-PA-Cherry konstruieren der vorherige Photoaktivierungen mit der korrigierten rot-to-grün-Ratio (RtoGrCorr ).
    IchRed_expected = (IGreen_measured -B-1) * RtoGrCorr
    Hinweis: Wie bereits erwähnt, kann die molekulare Helligkeit immer auf FP und Photoactivatable FP abweichen. Siehe Diskussion für weitere Informationen, um diese Unterschiede zu berücksichtigen.
  6. Berechnen Sie die PA-Cherry Photoaktivierungen Effizienz als einen Bruchteil der gemessenen rote Fluoreszenz-Intensität nach Photoaktivierungen und der erwarteten Fluoreszenzintensität im roten Kanal.
    (FPA-Kirsche) = (ichRed_measured – B2) / ichRed_expected
  7. Verwenden Sie die PA-GFP – Kirsche Konstrukt den Bruch des photoaktiviert PA-GFP zu beurteilen. Der erwarteten Fluoreszenzintensität der PA-GLP zu bestimmen, indem man die gemessenen rote Fluoreszenz-Intensität der PA-GLP-Cherry konstruieren der vorherige Photoaktivierungen durch das rot-zu-grün-Verhältnis (RtoGr). Hier muss die RtoGr nicht für Spender abschrecken, korrigiert werden, weil Spender abschrecken, die gleiche Menge GFP und PA-GFP unterliegen.
    IchGreen_expected = (ichRed_measured – B2) / RtoGr
  8. Berechnen Sie die PA-GFP Photoaktivierungen Effizienz als einen Bruchteil der gemessenen grüne Fluoreszenz-Intensität nach Photoaktivierungen und der erwarteten Fluoreszenzintensität in den grünen Kanal.
    (FPA-GFP) = (ichGreen_measured – B-1) / ichGreen_expected

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Ergebnisse

Die hier vorgestellten Protokoll zeigt ratiometrischen Quantifizierung der Bruchteil der fluoreszierende Proteine, photoaktiviert, fluoreszierende sein (Abbildung 1). Dieser Anteil unterscheidet sich je nach der Art der Photoaktivierungen.

Ein typisches Ergebnis mit kurzer Zeit Hochleistungs-Photoaktivierungen mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) ist in Abbildung...

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Diskussion

Bisher gab es keine Methode, um in der Masse der Bruchteil der PA-FPs ausgedrückt in lebenden Zellen zu bestimmen, photoaktiviert fluoreszierend sein. Die vorgestellte Protokoll kann für jedes Paar spektral unterschiedliche fluoreszierenden Proteins verwendet werden. Während hier für die irreversible PA-FPs PA-GFP und PA-Cherry veranschaulicht, ist dieser Ansatz grundsätzlich für Proteine sowie Photoconvertible. Die spektral unterschiedliche fluoreszierenden Proteins muss jedoch sorgfältig ausgewählt werden, spektrale Üb...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten das Dorigo-Labor und den Neurowissenschaften Imaging Service an Stanford University School of Medicine danken für die Bereitstellung von Ausrüstung und Raum für dieses Projekt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pEGFP-N1 Expressionsvektor für SäugetierzellenClontech
DMEM ohne PhenolrotThermo Fisher Scientific11054020
Trypsin ohne PhenolrotThermo Fisher Scientific15400054
L-Glutamin (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081
HEPESThermo Fisher Scientific15630080
LabTek 8-Well-Kammern #1.0Thermo Fisher Scientific12565470
Fugene 6PromegaE2691

Referenzen

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Photoaktivierbare fluoreszierende ProteineQuantifizierung fluoreszierender ProteineKonfokale Laser Scanning MikroskopieWeitfeldbeleuchtunggenetische Kopplunginterne LinealePhotoaktivierungseffizienzLive Cell ImagingFluoreszenzmikroskopiespektral unterschiedliche Proteine

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