Summary
本研究描述了氨基丙基端聚二甲基硅氧烷和聚二甲基苯基硅氧烷共聚物和软聚硅氧烷 (psu) 弹性体的合成路线。介绍了 psu 作为人工晶状体的应用。本文还介绍了体外细胞毒性的评价方法。
Abstract
本研究讨论了软聚利通尿素 (psu) 弹性体作为适应型人工晶体 (a-IOLs) 的合成方法。氨基丙基端聚二甲基硅氧烷 (pdms) 以前是通过环链平衡环链制备的, 环硅氧烷八甲基环四硅氧烷 (d 4) 和 1, bis(3-氨基丙基)-四甲基二硅氧烷 (aptmds)。通过d4和2、4、6、8-四甲基-2、4、6、8-四苯基-环四硅氧烷 (d4me,ph) 的共聚, 将苯基基团引入硅氧烷主干中。为提高聚硅氧烷的折射率, 合成了这些聚二甲基苯基硅氧烷嵌段共聚物。对于作为 a-IOL 的应用, 聚硅氧烷的折射率必须与年轻的人眼镜片的折射率相等。聚硅氧烷分子量受环硅氧烷与末端阻滞剂 aptmds 的比例控制。利用紫外-可见分光光度计对200至750纳米之间的薄膜进行透射率测量, 检测 psu 弹性体的透明度。在750纳米 (可见光谱的上端) 的透射率值是根据 pdms 分子量绘制的, > 90% 的透射率被观察到, 直到分子量为 18, 000 g·mol-1.采用模切狗骨形状试样的应力应变试验研究了 psu 弹性体的力学性能。为了评估机械稳定性, 通过反复拉伸 (10倍) 的试样到5% 和100% 的伸长率来测量机械滞后性。随着 pdms 分子量的增加, 滞后程度显著降低。使用 mts 细胞活力试验对某些选定的 psu 弹性体的体外细胞毒性进行了评估。本文所述的方法允许合成一个柔软的, 透明的, 和非细胞毒性的 psu 弹性体, 折射率大致等于年轻的人眼镜片。
Introduction
老年性白内障, 影响年龄≥ 60岁, 导致早期的自然晶状体混浊。这种与年龄有关的情况可能是由紫外线照射 1、2、3加速的氧化变化引起的。老年性白内障的常规治疗方法包括手术摘除白内障晶状体, 然后通过注射系统将人工人工晶状体 (iol) 植入空晶状体胶囊2。然而, 大多数 iol 是由丙烯酸聚合物 (疏水和亲水性丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物) 与极其刚性结构制造;因此, 眼睛失去了适应不同距离2,4的能力。因此, 使用单点人工晶体植入物的患者依赖眼镜进行近视 (例如, 在阅读报纸或书籍时)5。
据报道, 白内障手术后恢复住宿能力的方法不同。在这些方法中, 可以区分两个主要策略: 通过注入液体或凝胶状聚合物来填充空晶状体胶囊, 并开发出柔软、可折叠的 a-IOLs 6,7,8。"镜片填充" 的概念很有希望, 因为凝胶的模数可以低至天然人眼镜片 (约1-2 kpa)9;然而, 这种方法仍然是实验8, 研究只在动物眼睛上进行。
镜片胶囊已被重新填充充气硅胶气球 10充满液体硅胶或直接注射硅胶11,12, 随后通过水丝化在胶囊中固化.然而, 有关气球表面皱纹的问题, 与术前状态相比, 适应振幅较低, 以及严重继发性白内障 (前、后囊混浊) 的形成,7, 8,12,13。特别是, 长时间的治疗 (70分钟-12小时) 会增加漏入周围眼睛隔间的风险, 导致术后炎症10,14.因此, 建议使用其他材料来替代晶体透镜, 包括基于聚乙二醇二丙烯酸酯的水凝胶、丙烯酸酯改性的乙烯醇共聚物 (n-乙烯基吡咯烷酮)15、甲基丙烯酸酯聚硅氧烷16,17, 聚氧乙烯醚18, 和二异氰酸酯交联聚醇9。然而, 单体粘度 (即注射和交联后的凝胶肿胀)、极低或高折射率、机械稳定性和完整性、不可预知的术后折射、低适应范围和白内障后的形成是主要问题6、7、8、9、15、18。在商业上, 住宿能力主要是通过开发可折叠的 iol 来恢复的。这种 iol 应通过睫毛肌的收缩,通过人工晶状体囊前部的运动来提供调节。1996年、2001年和 2002年上市的 7、8 种车型已经上市。然而, 在临床研究期间, 植入 a-IOLs 的估计住宿振幅极低 (≤1.5 d), 允许无辅助读数 (3-4 d)6、7、8、19,20. 因此, 正在开发一个由两个连接光学器件 (双光学 iol) 组成的 a-IOL, 以增加舱位范围6、21。只检查了一个镜头的设计, 以检查其在人眼中的调节性能, 尽管据报道结果相互矛盾, 有 22、23、24、25。
通常情况下, 有机硅弹性体被认为是生物惰性和无毒的;因此, 有机硅弹性体在医学和医学工程中作为生物相容性材料应用的历史由来已久 (例如, 在乳房植入物、颅面植入物、关节假肢、伤口敷料、导管、排水沟和分流中)26,27. 有机硅弹性体由于其柔软性、透明度和高吸氧性, 还可用作隐形眼镜和 iol2、28、29.然而, 有机硅必须是共价交联的, 通常需要加固填料才能获得足够的机械完整性。交联是不利的, 因为它禁止随后通过热塑性塑料方法 (如注射成型) 或通过溶液处理 (如溶剂铸造) 来加工弹性体。相反, 热塑性聚氨酯表现出机械稳定性, 但在生物环境中容易降解, 特别是在使用聚酯或聚醚基大醇的情况下。因此, 将柔韧性和水解稳定性与优异的机械性能结合起来的努力集中在将羟基或氨基功能 pdms 作为软段插入聚氨酯、聚氨酯-尿素和多尿 27。为了增强极性聚氨酯或尿素硬段与高非极性 pdms 软段的兼容性, 并提高机械性能, 将不同的聚醚基大二醇与 pdms30,31 结合在一起 ,32岁。特别是, thilak gunatillake 集团对有机硅聚氨酯的发展进行了系统的研究, 该聚氨酯在起搏器绝缘或人工等长期生物医学应用中具有更好的生物稳定性和机械性能。心脏瓣膜33。他们合成了芳香族聚氨酯, 混合软段包括羟基端 pdms 和不同的聚醚, 以及脂肪族聚碳酸酯二醇。在所有合成的聚氨酯中, 聚六环氧乙烷 (phmo) 和 pdms 的结合在硬段相容性方面表现出最佳的力学性能.在随后的研究中, 他们进一步研究了 pdms-phmo 比以及二硅氧基扩链剂对有机硅聚氨酯 34,35的机械性能的影响, 36. 结果表明, 大二醇组合物 80 wt% pdms 和 20 wt% phmo, 除了一个共链扩展器, 如 1, 3-bis(4-羟基丁基)-四甲基二硅氧烷 (bhtd), 产生具有良好机械性能的聚软体聚氨酯和热塑性塑料加工性。此外, 与常用的软聚醚聚氨酯37、38、39相比, 这些有机硅聚氨酯具有增强的生物稳定性。
类似材料的生物相容性和稳定性及其在心血管应用中的用途也有40、41、42.根据这些结果, 使用二硅氧基扩链剂的硅基聚脲弹性体 (或 psu) 被认为具有较高的灵活性和柔软性, 尽管具有足够的机械强度, 以在应用后保持其形状。反复的压力。例如, hermans等人构建了一个基于聚氨酯的实验双光-iol 原型, 因为以前用于使用有机硅制造的设计极其柔软, 可以处理其中的应用载荷。被磨碎的猪眼睛 43。
本文介绍了一种基于硅氧烷的软 psu 的合成方法, 该 psu 在机械和光学性能方面得到了优化, 适用于作为适应 iol 的应用。由于硅氧烷分子量可以改变 psu 弹性体的机械性能, 因此同样的工艺也可应用于硅氧烷基 psu 的开发, 这可以在涂料和皮肤敷料中得到应用。此外, 如果使用卡宾醇端置 pdms, 该程序可用于制备基于硅氧烷的聚氨酯或聚氨酯尿素弹性体。根据用于合成的二异氰酸酯 (即脂肪或芳香族) 的类型, 可能需要改变反应条件 (包括时间、温度, 也许还有溶剂成分)。对于脂肪族二异氰酸酯如 4, 4-甲基二异氰酸酯 (环己基异氰酸酯) (h12 mdi) 或异丙酮二异氰酸酯的应用, 必须使用有机锡催化剂 (如二丁基锡扩张剂或二乙酰氧基四丁基异丙酮。例如, 羟基丙基端 pdms 和 h12 mdi 之间的反应是在催化剂存在的情况下进行的。此外, 反应温度需要提高到50-60°c。对于芳香族二异氰酸酯 (如 4, 4-甲基氰酸酯 (mdi) 的应用, 反应温度必须适度但足够增加, 因为芳香族二异氰酸酯通常对亲核基团的反应性高于比脂肪族二异氰酸酯是。利用无水四氢呋喃 (thf) 和二甲基甲酰胺(dmf) 或二甲基乙酰胺 (dmac) 的溶剂混合物作为三胺具有一定的催化活性, 可以促进 mdi 与碳醇端 pdms 的反应。
Protocol
注意: 使用前请查阅所有相关材料安全数据表 (msds)。合成中使用的几种化学物质对皮肤和眼睛以及吸入表现出急性毒性和强烈刺激。请佩戴个人防护设备 (实验室外套、安全眼镜、手套、全长裤子和闭合脚趾鞋), 并在可能的情况下, 在通风罩下或通风良好的地方处理化学品。在通风罩下执行所有的合成。五水合物四甲基氢氧化铵 (tmah):tmah 是一个强大的基础, 吞咽时剧毒, 在皮肤接触时, 会导致皮肤和眼睛严重的化学烧伤。它对空气敏感, 吸湿。将其存放在制冷和氮气下。处理 tmah 在通风良好的地方, 因为它的强烈氨般的气味。aptmds:aptmds 对空气敏感, 必须在氮气下储存。它会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。h12mdi:h12mdi 吸入时有毒, 会对皮肤和眼睛造成刺激。d4:d4可能会损害生育能力。thf:thf 是有害的, 对吸入会引起刺激, 而且可能是致癌的。氯仿 (chcl3):chcl3对吸入有害, 可能致癌, 可能会对生育能力和未出生的孩子造成损害, 其蒸气可能会导致嗜睡。
1. 催化剂和氨基端多环氧烷单体的合成
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四甲基氨基-3-氨基丙基-二甲基硅醇催化剂的合成
注: 催化剂是根据霍夫曼和 leir44报告的方法合成的。- 德加 aptmds 在真空下使用前, 并将其储存在氮气下。使用注射器的移液器约10克 aptmds。
- 加入8.13 克 (30.0 mmol) 的脱气 aptmds 和 11.88 g (66.0 mmol) tmah 到一个100毫升的三颈底部瓶。加入20毫升 thf 溶解 aptmds, 并悬挂 tmah, 以及一个大的椭圆形磁搅拌杆。
注意: tmah 是一种吸湿、腐蚀性和有毒物质, 具有强烈的氨状气味, 应密封在冰箱中。立即在通风良好的地方称重 tmah;搬运时戴防护手套和安全眼镜。aptmds 对空气敏感, 会导致皮肤灼伤和眼睛损伤。使用注射器从密封瓶中称量 aptmds;搬运时戴防护手套和安全眼镜。 - 在三颈圆底瓶上配备回流冷凝器和氮气的入口和出水口, 并使用甘油或硅油加热浴将反应混合物加热到80°c。在回流和轻微的连续氮气流动下, 将反应混合物搅拌2小时。
注: 初始的、稍微浑浊的悬架在2小时内变成一个清晰的解决方案。 - 使用真空吸尘器卸下回流冷凝器, 并将 thf 取出。然后, 在70°c 的0.1 毫巴真空下, 用 schlenk 线将略带黄色的原油干燥5小时。
注: 此步骤后, 原油产品可在10°c 的温度下存放在冰箱中, 直至次日。 - 将粗产品在50毫升的 thf 中再利用。如有必要, 使用铲子粉碎大的团聚体, 并使用真空吸尘器过滤悬浮液。用20毫升 thf 部分清洗沉淀物至少 3倍, 直到产品变成白色粉状固体。
- 在室温下在0.1 毫巴的真空下干燥产品3小时。然后, 将催化剂在氮气下的10°c 下存放在冰箱中, 直至使用。
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合成α,-bis(3 氨基丙基)-聚二甲基硅氧烷
注: 分子量 ~ 15, 500 克·mol-1 的 pdms 合成。- 在使用前, 在真空下使用德加 d4和 aptmds。使用注射器的移液器约1.5 克 aptmds。
- 将19.5 克 (65.7 mmol) 的脱气 d 4 和 0.9 g (3.6 mmol) aptmds 添加到100毫升的三颈圆底瓶中, 该烧瓶配有 ptfe 涂层离心搅拌器以及氮气入口和出口。
- 加入 ~ 26 毫克的催化剂 (从第1.1 节), 在80°c 下, 在轻微的连续氮气流动下搅拌反应混合物30分钟。
注: 可以使用甘油或硅油加热浴。 - 在反应混合物中加入 45.5 g (153.4 mmol), 使用滴漏斗 (2-3小时内), 在持续氮气流动下, 在80°c 下进一步搅拌 24小时.
注: 反应可以在一夜之间进行。 - 将反应混合物加热至 150°c, 搅拌 2小时, 使催化剂分解。然后, 让 pdms 冷却到室温。
- 将离心搅拌器与一个大的椭圆形磁搅拌杆交换, 并用两个塞子密封三颈圆底瓶。使用带有阀门的适配器, 在0.1 毫巴的真空下将 pdms 缓慢加热至 150°c, 以便使用 schlenk 线提取循环侧产品。让 pdms 冷却到室温。
注: 真空蒸馏通常发生在4-5小时。
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α、-bis(3 氨基丙基)-聚二甲基苯基硅氧烷的合成
注: 本节介绍分子量约为 15, 500 克·ml-1 和 14 mol% 甲基苯基硅氧烷的聚硅氧烷的合成工艺;此过程可与第1.2 节中描述的 pdms 合成相媲美。- 在使用前, 在真空下使用德加 d4和 aptmds。使用注射器的移液器约1.5 克 aptmds。将d4me, ph在70°c 下3-5小时放置在真空室中, 以便在使用前完全熔化和均质产品。
- 加入 d4 的 4.54 g (15.3 mmol), 14.96 克 (27.5 mmol) 的 d4me, ph, 0.9g (3.6 mmol) 的 aptmds 到一个100毫升的三颈圆底瓶, 这是一个 ptfe 涂层离心搅拌器和氮和出口。
- 加入 ~ 26 毫克的催化剂 (从第1.1 节), 在连续氮气流动下, 在80°c 下搅拌反应混合物30分钟。
- 在反应混合物中加入 45.5 g (153.4 mmol), 使用滴漏斗 (2-3小时内), 在持续氮气流动下, 在80°c 下进一步搅拌 24小时.
注: 反应可以在一夜之间进行。 - 按照步骤1.2.5 和1.2.6 继续进行合成。
2. 聚硅氧烷的分子量测定
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聚硅氧烷的理论分子量
- 根据以下公式计算聚
硅氧烷的理论分子量:
(2)
这里,是聚二甲基硅氧烷的平均分子量, m是使用过的单体 d4 和 aptmds 的质量 (g), n是摩尔中的 aptmds 量。
- 根据以下公式计算聚
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用 1h-nmr 光谱法测定聚硅氧烷的分子量
- 在 cdcl3的0.5 毫升中溶解10-20 毫克的聚硅氧烷, 记录其核磁共振谱, 并以 7.26 ppm 的速度将化学转移 [] 校准到溶剂信号。
- 根据下面的方程 , 从积分值计算聚硅氧烷的分子量。
(3)
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滴定法测定聚硅氧烷的分子量
- 在250毫升锥形烧瓶中加入 1.5-2 克聚硅氧烷, 在磁搅拌棒连续搅拌下将其溶解在50毫升的 thf 中。
- 使用溴酚蓝色使用 0.1 m hcl 的 ti高温氨基, 直到观察到颜色从蓝色变为黄色。用三个样品重复滴定, 计算分子平均量的数字。
(2)
(3)3. 聚硅氧烷-尿素弹性体的合成
注: 本节介绍基于 pdms 的硬段含量 (hs/%) 的尿素弹性体的合成过程(pdms:15, 500 克·摩尔-1)。
(2)
- 在250毫升四颈圆底反应瓶中加入 2.939克 (11.2 mmol) h12 mdi, 该片配有 ptfe 涂层的离心搅拌器、滴漏斗、氮气入口和出口, 并将其溶解在 thf 的20毫升中。
注意: h12mdi 是一种低挥发性二异氰酸酯, 会对皮肤和眼睛造成刺激。戴防护手套和安全眼镜。
注: 或者, 将h12mL 溶解在 thf 中的50毫升烧杯中, 并通过漏斗或郁金香玻璃将溶液添加到反应瓶中。然后, 用10毫升的 thf 冲洗烧杯和漏斗。- 在100毫升 thf 中溶解 45.0 g (2.9 mmol) 脱气 pdms;在 h12 mdi 溶液中,在连续搅拌和室温下氮气流动的情况下, 使用滴漏斗滴入 h12 mdi 溶液中。用50毫升的 thf 冲洗烧杯和掉漏斗, 并将这种溶液添加到反应混合物中。
- 通过ftir 光谱控制预聚物的形成。
注: 可以通过两种方式监测反应进展情况: 使用内联或离线 atr-ftir 光谱仪。- 对于内联 atr-ftir 光谱仪, 在反应开始时将连接到光谱仪的内联 atr-ftir 探头插入中心接头。使用大的椭圆形磁搅拌杆, 而不是 ptfe 涂层搅拌器。开始记录 h12 mdi 溶液的光谱, 并选择在2266厘米-1的 nco 吸收峰, 以跟踪异氰酸酯基团的转换。
- 对于离线 atr-ftir 光谱, 使用巴斯德移液器采集反应混合物的样品, 并在 atr 晶体上添加几滴。在氮气流动下蒸发溶剂, 直到薄膜停留在 atr 晶体表面。记录不同反应阶段的光谱 (在完全添加 pdms 之后和在 aptmds 的每个部分添加之后)。
- 将链扩展器 aptmds 的化学计量量的一部分添加到预聚物溶液中。
注: 添加链扩展器可以通过两种方式进行 (请参阅步骤3.1.3.1 和 3.1.3.2)。- 在5-10 毫升的 thf 中溶解扩链器的称重量, 并使用巴斯德移液器或滴落漏斗将溶液滴入反应混合物中, 然后用3毫升的 thf 再次冲洗。
- 将链状扩展器的一部分添加到注射器中, 并将扩链器滴入反应混合物中。在这种情况下, 使用橡胶隔膜塞子密封第四关节。
- 在预聚物中加入1.65 克 (6.6 mmol) 的 aptmds, 相当于计算出的 aptmds 量的80%。然后, 通过红外光谱控制反应进展。
- 然后, 在反应混合物中加入 0.21 g (0.8 mmol) (共计算量的 90%), 用 ftir 控制反应过程。
- 添加0.1 克 (0.4 mmol) aptmds (共 95%)对反应混合物进行反应, 并利用 ftir 控制反应过程。
- 最后, 在反应混合物中加入扩链器的最后一部分 (0.102 g, 0.102 mmol), 并检查 ftir 光谱中 nco 吸收带的消失。
注: 添加链扩展器的第一部分后, 粘度会增加。
- 将 psu 溶液倒进聚四氟乙烯箔覆盖的玻璃培养皿中, 并在烟罩下一夜蒸发溶剂。此外, 在80°c 的真空室中将 psu 干燥12小时。
4. 机械测试程序
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聚硅氧烷-尿素弹性体薄膜的制备
- 溶解7-8 克的小 psu 件在200-250 毫升的 chcl 3 在一个 300 毫升的锥形烧瓶, 松散密封的烧瓶使用一个玻璃塞子, 并搅拌混合物使用磁搅拌杆至少24小时。如有必要, 添加额外的溶剂部分。
注意: 氯仿大概是致癌的。吸入时, 蒸气可能会导致嗜睡。在通风良好的地方处理氯仿。 - 将均匀的溶液加入玻璃培养皿中, 并用穿孔铝箔覆盖。允许溶剂通过将 petri 培养皿放置在通风良好的地方或打开窗扇的通风罩中缓慢蒸发。
注: 将培养皿放在烟罩中时, 如果可能的话, 减少气流。溶剂的极快蒸发会导致不均匀性, 并在透明薄膜中形成不透明的污渍。 - 在真空室中在80°c 下干燥膜12小时。
- 使用小的薄铲小心地将薄膜从玻璃表面取出, 并在随后用于机械表征时将 psu 薄膜存储在透明的信封中。
- 溶解7-8 克的小 psu 件在200-250 毫升的 chcl 3 在一个 300 毫升的锥形烧瓶, 松散密封的烧瓶使用一个玻璃塞子, 并搅拌混合物使用磁搅拌杆至少24小时。如有必要, 添加额外的溶剂部分。
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应力应变测试聚硅氧基尿素弹性体薄膜
- 根据 keiper 45 (s2 型) 从 psu 薄膜中制备模切狗骨形状的标本。将被信封箔覆盖的 psu 薄膜置于形状如图 4所示的冲孔刀单元下。向下推杆, 将测试样品打出来, 并在环境温度 (23±2°c) 下存放至少72小时。
- 打开拉伸试验机和计算机。通过单击图标启动软件。选择该方法作为拉伸测试, 并检查测试机中是否安装了正确的称重传感器 (100 n)。
- 选择方法助手并检查所有测试设置是否正确。转到预测试并检查是否激活了以下设置: 原始样品长度 (l0)为 20 mm, 预紧为 0.1 mpa, 预加载速度为 5 mm/min。
- 转到测试参数并检查是否激活了以下设置: 在 1 mm/min 处确定杨氏模量的速度, 样品在 25 mm/min 处破裂的速度, 在最大 80% f 时检测样品断裂的速度,回归时杨氏模量的测定, 2% 应变时杨氏模量的开始, 6% 应变时杨氏模量的末端测定。离开方法助手并切换到软件的主窗口。
- 按下测试机上的开机按钮, 然后单击该按钮转到软件主窗口中的起始位置。
- 取下保护箔, 并在交叉偏光片下检查样品, 以排除任何内应力。使用口径测量样品厚度和样品宽度。然后, 将样品厚度和宽度的值插入到软件主窗口中的相应字段中。
- 将测试样品固定在试验机的上夹紧口之间。单击软件主窗口中的按钮零力。将测试样品的底部固定在试验机的底部夹紧下颚之间。
注: 如果夹紧爪的表面是滑的, 将试样的两端放置在细粒砂纸之间, 以防止试样在测量过程中滑动。 - 单击"开始测量" 按钮开始拉伸测试。
- 完成测量后, 继续执行步骤4.2.6 和4.2.7。在上夹紧口之间固定测试样品并选择零力之后, 选择按钮进入软件主窗口上的起始位置。然后, 在底部夹紧下颚之间固定测试样品的底部, 然后再次单击"开始测量".
- 重复步骤 4.2.6-4.2.8 一个 psu 样品至少增加 3倍, 用于杨氏模量、抗拉强度和断裂伸长率的统计评估。
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psu 弹性体薄膜的滞后试验
- 打开拉伸试验机和计算机。通过单击图标启动软件。选择该方法作为循环拉伸试验, 并检查在试验机中安装正确的称重传感器 (100 n)。
- 选择方法助手并检查所有测试设置是否正确。转到预测试并检查是否激活了以下设置: 原始样品长度 (l0)为 20 mm, 预加载为 0.05 mpa, 预加载速度达到 5 mm/min。
- 转到测试参数并检查以下设置的激活情况:10 时的周期数、100% 应变时的设定值加载次数、0% 应变时的设定值卸载速度以及 25 mmmin 时的速度. 离开方法助手和切换到软件的主窗口。
- 继续执行步骤 4.2.5-4.2.8。
- 用两个样本重复滞后测量, 进行统计评估。根据下面的公式计算每个周期的机械滞后性。
(2)
(2)5. hcam 细胞的培养程序
- 用 hacot 细胞和杜尔贝克的改良鹰介质 (dmem) 在37°c 的水浴中加热低温管。在微生物安全工作台下, 迅速将细胞悬浮液转移到10毫升锥形离心管中, 该管充满了温暖的 dmem。
- 使细胞悬浮液在 845 x g处离心6分钟。使用连接在真空泵上的一次性玻璃巴斯德移液器丢弃大部分上清液, 并通过使用 Eppendorf 移液器轻轻移液细胞团块向上和向下, 将细胞颗粒重新悬浮在剩余的液体中。
- 将重新悬浮的细胞转移到25厘米2细胞培养瓶中, 加入9毫升的 dmem, 再加上10% 的 fbs。将细胞孵育在37±1°c 和 5% co2的孵化器中。每天使用倒置显微镜控制细胞增殖。每隔三天更改一次 dmem, 直到细胞成为亚融合。
- 使用一次性玻璃巴斯德移液器取出 dmem, 在安全工作台下执行细胞通道。添加10毫升的 pbs 缓冲液来清洗细胞层。再次使用一次性玻璃巴斯德移液器取出 pbs 缓冲器。
- 在25厘米2细胞培养瓶中加入1毫升的胰蛋白酶 edta 溶液, 分离细胞并在 co2 孵化器中孵育.使用倒置显微镜检查悬浮液中是否存在细胞。
- 在细胞培养瓶中加入3毫升 dmem, 以灭活胰蛋白酶。将细胞悬浮液转移到离心管中, 并在 845 x g 处将细胞置于离心状态6分钟。使用玻璃巴斯德移液器取出大部分上清液。将剩余的 dmem 中的细胞重新注入, 加入10毫升新鲜的温暖 dmem, 并辅以10% 的 fbs。
- 将细胞悬浮液的5毫升转移到75厘米2细胞培养瓶中的每一个, 加入15毫升新鲜温暖的 dmem, 辅以10% 的 fbs。在 co2 孵化器柜中培养37±1°c 和 5% co2的 hacat 细胞,直到细胞成为亚融合。
- 按照步骤重复细胞通道 5.1.3-5.1.6 但这一次, 使用胰蛋白酶/edta 溶液的2毫升和 dmem 的6毫升来激活胰蛋白酶。
6. 使用 hucat 细胞进行 mts 细胞活力检测的程序
注: 体外细胞毒性试验是根据 wenzelewski46, 使用细胞介质提取物进行的。psu 样品和生物级聚氨酯样品使用环氧乙烷灭菌。
- 在 dmem 中37±1°c 和 5% co2 培养 hacot细胞, 在75厘米2细胞培养瓶中补充 10% fbs。使用细胞进行体外细胞毒性测试, 至少在第四通道之后。
- 在37°c 时, 将 psu 无菌样品和参考材料 (0.7 g) 加入50毫升锥形离心管, 并在37°c 下使用 dmem 提取样品, 时间为72±2小时, 提取率为 0.1g/2。对每个 psu 样本使用三个提取物。在没有 fbs 的情况下, 将 dmem 灌入50毫升锥形离心管, 制备盲样, 并进行相同的提取。
- 在提取过程的第2天, 按步骤进行细胞分离 5.1.3-5.1.5 与2毫升的胰蛋白酶 edta 和6毫升的 dmem。取一个100μl 的细胞悬浮液, 并添加100μl 的 dmem。从这种稀释的悬浮液中, 取20μl 的脂肪, 加入10μl 的0.5% 色氨酸蓝溶液来染色死细胞。
- 将细胞加氢 2分钟, 用微型移液器填充血细胞仪, 并立即计算四个腔内的细胞。计算可行和不可行细胞的数量, 以百分比评估细胞活力。
注: 或者, 也可以使用单元格计数系统对单元格进行计数。 - 种子 hcam 细胞 (第四通道) 浓度为 20 x 10 3 细胞/在200μl 的 dmem 中进入96孔微板, 并在37°c 和 5% co 2 中孵育细胞 24小时.
- 第3天, 提取后, 在每个提取物和盲样中加入10% 的 fbs, 并使用水浴加热高达37°c 的样品。从每个种子中取出 dmem, 用提取物、盲样和相应的正负对照代替培养基。对于每个 psu 提取物 (对每个 psu 样品使用三个提取物), 将液滴200μl 的提取物输送到六口井。
- 将盲样 (dmem + 10% fbs) 的移液器200μl 放入六口井中。移液器200μl 的新鲜 dmem, 辅以 10% fbs (负控制), 成六口井。将移液器200μl 的正控制 (dmem + 10% fbs + 1% sds) 放入六口井。在37°c 和 5% co 2 下, 用提取物和对照培养细胞 24小时.
注: 为了制备正控制, 请在水中制备20% 的 sds 溶液, 并用 dmem 在1:2 下将其稀释。然后, 进一步稀释它与 dmem 准备 1% sds 溶液。 - 第4天, 在孵育时间结束前不久, 准备一个没有 fbs 的 mts 和 dmem 的库存解决方案 (对于每口井, 使用20μl 的 mts 溶液 + 100μl 的 dmem)。孵育时间后, 取出提取物、盲液和控制物, 将 mts 库存溶液的移液器120μl 放入每个井中, 并进入六口无细胞的井中确定背景。在37°C 和 5% co 2 处培养细胞 4小时.
- 在 mts 溶液孵化后的第4天, 使用微板读取器测量每口井在492纳米的吸收率。从播种井的测得的吸收量中减去。假定正控件中的测量吸收值表示0% 的增殖, 并将这些吸收值设置为0。假设负控制的测量吸收值表示100% 的扩散, 并将这些值设置为100。
- 从吸收值计算细胞增殖值占负对照 (100% 增殖) 和正对照 (0% 增殖) 吸收值的百分比。评估细胞增殖高达81% 的样品提取物, 认为这种提取物不具有细胞毒性。
注: 根据供应商的信息47, 以后测量吸收率。将 10% sds 溶液的移液器25μl 插入每口井, 以停止反应, 并将微板储存在室温下的无光温度下, 并将其储存在加湿室内。
Representative Results
分别合成了 d4和 d4me、ph与 endoxrekaptmds 的环链平衡, 得到了氨基丙基端聚二甲基硅氧烷和聚二甲基苯基硅氧烷共聚物。通过调整 d4和 aptmds 之间的单体比例, 分子量在 3, 000 至 33, 000 克-mol-1 之间 (图 6)。所制备
的 pdms 的分子量, 是由1h-nmr 光谱 (图 5) 测定, 与滴定得到的值相似。这些数值与计算出的理论分子量 (高达 15, 000 g·mol-1)一致。在分子量较高的 pdms 制备过程中, 所获得的分子量略高于理论计算的分子量。环硅氧烷与 d4me、ph 的环状苯基 d4me共聚被认为是略微增加聚硅氧烷折射率的成功方法。折射率 (在37°c 时使用 abbe 折射率仪确定) 从 1.401 (未经修改的 pdms) 增加到 1.4356 (14 摩尔% 甲基苯基硅氧烷) (图 7)。以 thf 为溶剂, 采用制备的氨基丙基端 pdms、脂肪族二异氰酸酯h12mdi 和 aptmds 分两步合成了 psu 弹性体。该方法允许构建具有软段 (pdms) 和硬段 (二异氰酸酯 + 尿素) 分段结构的高分子量 psu。内联 ftir 光谱证实异氰酸酯基团与 pdms 和扩链扩展器 aptmds 中的氨基反应极为迅速 (图 3和图 8)。与聚氨酯弹性体的制备需要几个小时不同, psu 弹性体的制备非常方便。psu 弹性体的透明度和力学性能取决于 pdms 分子量。透明 psu 弹性体薄膜的透射率为 gt;90, 其分子量为 18, 000 克·mol-1.在更高的 pdms 分子量下, psu 薄膜变得越来越不透明 (图 9)。随着 pdms 分子量的增加, 可以制备出软 psu 弹性体。psu 弹性体的杨氏模量从 ~ 5.5 mpa (pdms 分子量为 3, 000 g·mol-1) 下降到 0.6 mpa (pdms 分子量≥26, 000 g·mol-1) (图 10).此外, 用高分子量 pdms 制备 psu 弹性体时, 可降低其在反复施加应力下的机械滞后性的机械滞后性。在100% 应变下, 第一周期的滞后值从 54% (pdms 分子量为 3, 000 g·mol-1) 下降到6% (pdms 分子量为 33, 000 g·mol-1) (图 11).应用的合成方法允许制备不释放细胞毒性残留的 psu 弹性体, 作为在 hacat 细胞上使用某些选定的 psu 弹性体提取物进行的细胞活力测试中所示的例子 (图 12)。
图 1: 四甲基氨基-3-氨基丙基-二甲基硅酸酯催化剂的合成。
四甲基氢氧化铵五水合物 (tmah) 和 1, Bis(3 氨基丙基)-四甲基二硅氧烷 (aptmds) 在80°c 时在 thof 中反应2小时。四甲基氨基 3-氨基丙基-二甲基硅醇酸盐催化剂在用 thf 清洗粗产品后, 作为白色固体进行处理。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 氨基丙基端聚二甲基硅氧烷 (pdms) 和聚二甲基苯基硅氧烷共聚物的合成途径.循环单体 d4' me, ph在80°c 时使用二硅氧烷内源阻滞剂 aptmds 在24小时内, 使用四甲基氨基-3-氨基丙基-二甲基硅烷酸催化剂进行平衡。这一数字已从 riehle等人处修改。48.请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 分段聚硅氧基尿素弹性体 (psu) 的两步合成.第一步, h12 mdi 与氨基丙基端聚硅氧烷反应后形成含有活性异氰酸酯基团的预聚物 (r = ch3:pdms);r = ph;共聚物)。第二步,通过剩余活性异氰酸酯基团与扩链器 aptmds 的反应, 提高聚合物分子量。由此产生的弹性体是一种分段聚合物, 由尿素硬段和有机硅软段组成。这一数字已从 riehle等人处修改。48.请点击此处查看此图的较大版本.
图 4: 应力应变试验用狗骨形状试验试样的规范.这一数字已从 keiper45 修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:1 氨基丙基端聚二甲基硅氧烷的 h-nmr 谱.在分子量计算中, 使用了亚甲基质子 d (2.69 ppm) 和 b (0.56 ppm) 和甲基质子 a (~ 0.56 ppm) 的积分值。峰 c (~ 1.5 ppm) 由 hdo 峰49覆盖, 与溶剂 cdcl3的水痕的质子交换相对应;因此, 这个峰值不用于计算分子量。该光谱中的 pdms 分子量为 ~ 16 365 g·mol-1.请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 
氨基丙基端聚二甲基硅氧烷分子量与内受体阻滞剂浓度之间的线性关系。 通过 1h-nmr 光谱、氨基末端基团的滴定和根据方程 (1) 进行理论计算来确定数值。经 riehle 等人许可, 重新打印了这一数字。48.请点击此处查看此图的较大版本.
图 7: 氨基丙基端聚二甲基苯基硅氧烷共聚物的折射率.在 20°c (黑色正方形) 和 37°c (红圈) 下, 用阿贝折射率仪测定了聚二甲基苯基硅氧烷共聚物的折射率 (ri)。ri 值随合并的甲基苯基硅氧烷单位的数量呈线性增加而增加。在0摩尔% 的 ri 值代表了那些来自未修改的 pdms 的数值, 其分子量与聚二甲基苯基-硅氧烷共聚物相当。得到了具有14% 甲基苯基硅氧烷的共聚物 1.4346 (37°c) 的最佳 ri。经 riehle等人许可, 这一数字已被转载。48.请点击此处查看此图的较大版本.
图 8: 聚二甲基硅氧烷尿素 (psu) 合成过程中异氰酸酯的转化.此图显示了在合成 psu 过程中 nco 吸收带在 2, 266 厘米1下的时间依赖性图, 其次是内联 ft-atr 光谱。添加氨基丙基端聚二甲基硅氧烷后, nco 带的高度降低, 表明 nco 端预聚物链的形成。在添加链扩展器 aptmds 后, nco 波段完全从红外光谱中消失。经 riehle等人许可, 这一数字已被转载。50.请点击此处查看此图的较大版本.
图 9: psu 弹性体薄膜在750纳米时的透射率和聚二甲基硅氧烷的分子量的依赖性.用紫外光谱法测定了 psu 薄膜的透射率。如果使用分子量在 3, 000 至 18, 000 克-mol-1 之间的 psms 合成 psu, 则 psu 在750纳米 (可见光谱的上边缘) 的透射率为gt;90。随着 pdms 分子量的增加, 薄膜的不透明度增加。经 riehle等人许可, 这一数字已被转载。48.请点击此处查看此图的较大版本.
图 10: psu 弹性体的杨氏模量与聚二甲基硅氧烷的分子量有关.通过对 psu 薄膜的应力应变测量, 确定了杨氏模量 (ym)。这些值表示为从五个重复测量中获得的平均值。误差线表示标准偏差。从 pdms 合成的 psu 的 ym 降幅最大, 从3000克到9000克-mol-1不等。在 pdms 分子量在 12, 000 至 18,000 克·mol-1 之间, ym 值在 1.5 mpa 和 1.0 mpa 之间。在分子量大于 26, 000 克·mol-1 时, ym 值 ~ 0.6 mpa.经 riehle等人许可, 这一数字已被转载。48.请点击此处查看此图的较大版本.
图 11:100% psu 弹性体的滞后性曲线.显示了 psu 弹性体在100% 伸长率下的第一周期滞后性曲线。聚合物符号是指 pdms 分子量 (例如, psu-3t 是由 pdms 制备的聚脲弹性体, 分子量为 3, 000 g·mol-1).最高的机械滞后性 (43%-54%)在低分子量 pdms 合成的 psu 弹性体中观察到, 如明显的迟滞曲线所示。随着 pdms 分子量从 14% (15, 000g·mol-1) 增加到 6% (33, 000 克·mol-1), 滞后率下降。经 riehle等人许可, 这一数字已被转载。48.请点击此处查看此图的较大版本.
图 12: 用 psu 提取物处理的 hadat 细胞体外细胞毒性试验结果.此图显示了用 psu 弹性体的细胞介质提取物处理的 hcam 细胞增殖情况。这些值表示为从每个样本的三个测试提取物中获得的平均值, 每个提取物有六个重复测量值 (总共18个重复)。误差线表示这些测量值的标准偏差。空白表示细胞介质 dmem (不含样品), 该培养基的处理类似于用于提取的细胞培养基。选择医用级聚醚聚氨酯作为参考材料。硅基聚脲弹性体 (psu-18t, 选择 PSU-18T 和 PSU-18T) 作为具有代表性的测试样本, 这些样品以 pdms 为基础, 分子量为 18, 000 克, 000 克·mol-1 (psu-18t 和 PSU-18T), 而 PSU-18T 的基础是聚甲基苯基硅氧烷共聚物, 与甲基苯基硅氧烷的比例为 14%, 分子量为 ~ 16 600 g·mol-1.用 psu 弹性体提取物处理的 hadat 细胞的平均增殖率为100% 以上。因此, psu 弹性体和参考聚氨酯的提取物不是细胞毒性的。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
采用无水、强碱性催化剂,通过环链平衡实现高分子量氨基丙基端 pdms 至关重要。其他典型应用的催化剂, 如四甲基氢氧化铵 (tmah) 或氢氧化钾 (koh), 含有水残留物, 可促进副反应;因此, 得到了具有相似分子量的双功能、单功能和非功能 pdms 链的混合物44。此外, 如果使用 tmah, 反应需要 & gt;48 h 才能完成, 并不总是进行完整的单体消耗44。
特别是, 端部阻滞剂 aptmds 的称重对于获得所需的 pdms 分子量至关重要。例如, 如果如议定书第2.1 节所述, 如果使用 0.85 g 合成 pdms, 而不是 0.9 g 的 aptmds, 这将导致理论分子量大约 & gt;900 g·mol-1.此外, 理论分子量取决于转换。如果循环侧产品没有通过真空蒸馏去除 , 将获得较高的转化值。例如, 要使用相同的合成程序 (如议定书第2.1 节), 计算出的90% 的换算率将导致理论上计算的分子量;此值为 910 g·mol-1 大于85% 的换算率.滴定法测定聚硅氧烷分子量的偏差可能与 pdms 在烧瓶中的称重有关, 特别是在使用 50 ml 滴定管进行滴定的情况下。与0.06 克聚硅氧烷的称重有关的偏差可能会导致约 650 g·mol-1 的计算差.因此, 建议使用半自动滴定仪。
pdms 的折射率可以通过纳入5、51、卤化苯基52或含硫组53来提高。在所述的 yilgör、riffr 和 mcgrath 54 所述的八丁基环四硅氧烷 (d 4ph)共聚的方式将苯基纳入 pdms 的尝试没有成功 ,可能是因为笨重的环状主干使应用催化剂不可能在选定的反应温度下分解硅氧烷键。如果在160°c 的反应温度下使用 koh, 则可以打开 d4ph环。然而, 聚硅氧烷的极高分子量, 其中大概含有大量的非功能性杂质。此外, 在这些共聚物中去除催化剂 koh 并不简单, 需要使用乙醇 hcl 进行中和步骤, 然后对催化剂进行水萃取。然后, pdms 必须溶解在有机溶剂中, 如 ch2cl2, 以分离含有机 pdms 相的水相。最后, 有机相必须在 mgso4上干燥, 然后使用旋转蒸发器54进行过滤和真空蒸馏。相反, 本手稿中介绍的方法允许通过热分解立即去除催化剂。因此, 如29种si-nmr所证实, 通过液体单体 d4me, ph 的共聚, 使苯基成功地引入 pdms主干, 而不是使用固体单体 d 4 ph, 而是成功地引入 pdms 主干。光谱50。
合成的 psu 弹性体表现为 ym 0.6-5.5 mpa 和高弹性, 伸长率高达1000%。如此高的伸长率不仅与聚合物分割结构有关, 而且与 psu 弹性体的高分子量 ( > 100, 000·mol-1)48有关.在室温下, 氨基与脂肪族异氰酸酯基团之间发生瞬时反应, 导致分子量迅速增加。这一结果通过在溶剂中进行反应得到了进一步的支持, 因为粘度的轻微增加似乎并没有显著减缓反应速度, 否则会极大地影响分子量, 以实现近乎平衡的速度化学计量比。相反, 当使用短链二醇, 如 1, 4-丁二醇, 作为扩链剂时, 由此产生的聚氨酯尿素弹性体不仅弹性较低, 而且失去了相当大的机械稳定性, 特别是在高分子量 pdms 为高分子 pdms 的情况下。用于合成。这一结果大概与弹性体的分子量相当低有关 (结果未公布), 这与所有异氰酸酯基团在多加法的最后阶段的不完全转换相对应。此外, 氨基和羟基对脂肪族二异氰酸酯的反应性差异极大地影响了体外细胞毒性试验的结果。从氨基链扩展器 aptmds 制备的 psu 弹性体提取物对 hcam 细胞没有任何细胞毒性作用 (图 12)。然而, 如果使用硅氧烷基聚氨酯-尿素弹性体的提取物, 细胞活力就会大大降低 (结果未公布), 这可能与低分子量的浸漏液和残留的未反应异氰酸酯基团有关。
该协议介绍了一种制备氨基功能聚硅氧烷的简便方法, 该方法随后可作为宏观二胺用于合成高分子量、软、弹性聚硅氧乙烯醚弹性体。由于 psu 的机械性能可以根据 pdms 分子量的不同而变化, 因此可以在其他应用领域使用这些聚合物。此外, 制备氨基功能聚硅氧烷的程序可用于引入侧基, 如乙烯基, 通过与吊坠乙烯基的循环硅氧烷共聚 (未显示结果)。这可能开辟新的应用领域, 包括制备软交联聚硅氧烷凝胶 (例如, 通过 pt 催化水解与氢功能有机硅或通过 uv 激活的硫醇烯添加硫醇烯的硫醇烯添加可吸入功能 pdms) (结果)。
Disclosures
提交人没有什么可申报的。
Acknowledgments
作者感谢联邦教育和研究部 (bmbf) 在第13fh032i3 赠款下资助这项工作。德国堡 (dfg, gepris 项目 253160297) 的财政支持得到了感谢。提交人还要感谢图宾根大学的 priska kolb 和 paul schuler 进行了1次 h-nmr 和29项 si-nmr 测量。还要感谢 csc jäkle chemie gmbh & co. kg 提供的 h12 mdi。作者要感谢来自 biotronik 的 herbert thelen 和 andrélemme 对 psu 样品进行环氧乙烷灭菌, 并感谢 lada kitaeva (reutlingen 大学) 在应力应变和迟滞测量方面提供的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Octamethylcyclotetrasiloxane (D4), 97 % | ABCR GmbH | AB111277 | presumably impairs fertility, must be degassed before use CAS: 556-67-2 |
| 1,3-Bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane, 97% | ABCR GmbH | 110832 | sensitive to air, must be stored under nitrogen CAS: 2469-55-8 |
| 2,4,6,8-Tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenylcyclotetrasiloxane | Sigma Aldrich | 40094 | technical grade CAS: 77-63-4 |
| Tetramethylammonium hydroxide pentahydrate | Alfa Aesar | L09658 | toxic if swallowed and upon skin contact, strong base, sensitive to air, hygroscopic, store under refrigeration and under nitrogen CAS: 10424-65-4 |
| 4,4¢-Methylenbis(cyclohexylisocyanate) (H12MDI) | Covestro via CSC Jäkle Chemie GmbH & Co. KG | toxic if inhaled, skin and eye irritant CAS: 5124-30-1 |
|
| Tetrahydrofuran (anhydrous) 99.8 % | Alfa Aesar | 44608 | stabilized with BHT CAS: 109-99-9 |
| Chloroform 99 % | Grüssing GmbH Analytica | 1025125000 | stabilized with ethanol, presumably carcinogenic, can impair fertility and cause damage to an unborn child CAS: 67-66-3 |
| Chloroform-d, 99.8 % | Sigma Aldrich | 151823 | CAS: 865-49-6 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) high glucose | Thermo Fisher Scientific Life Technologies GmbH | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Life Technologies GmbH | A3160801 | |
| Trypsin/EDTA, 0.25 % phenol red | Thermo Fisher Scientific Life Technologies GmbH | 25200056 | |
| Cell Titer Aqueous One Solution cell proliferation assay (MTS) | Promega GmbH | G3580 | |
| HaCaT-cells | CLS Cell Lines Service GmbH | 300493 | |
| BioComFold | Morcher GmbH | foldable accommodating intraocular lens | |
| Accommodative 1CU | Human Optics AG | foldable accommodating intraocular lens | |
| CrystaLens | Bausch and Lomb Inc. | foldable accommodating intraocular lens | |
| Silmer OH-Di10 | Siltech Corp. | Carbinol-terminated Polydimethylsiloxane | |
| Synchrony | Visiogen Inc. | dual-optic foldable accommodating intraocular lens | |
| Elast-Eon | AorTech International plc | thermoplastic PDMS-PHMO-based polyurethane for medical applications | |
| Pellethane 2363-80A | Lubrizol Life Sciences | thermoplastic polyether-based polyurethane for medical applications | |
| Zwick universal tensile testing machine model 81565 and software testXpert II | Zwick GmbH & Co. KG | tensile testing machine | |
| CASY | Roche Innovatis AG | cell counting system | |
| Multisizer | Beckman Coulter Life Sciences | cell counting system |
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