Schätzung der Nephron-Zahl in Ganznierstein mit der Acid-Maeration-Methode

Der Nphron ist sowohl die strukturelle Grund-als auch die funktionelle Einheit der Niere 1^. Strukturell besteht das Nphron aus dem Glomerulus (Kapillaren und Pokdozyten), der sich in der Kapsel des Bowman befindet, und der Nierenröhre, bestehend aus der proximalen Röhre, der Schleife von Henle, und der distalen Röhre, die sich in den Sammelkanal auslotet. Funktionell ist die Rolle des Nphrons die Filtration und Wiederabsorption von Wasser und Elektrolyten und die Abscheidung von Abfällen. In der Regel wird die Nierenkunde mit 36 Wochen der Schwangerschaft beim Menschen und kurz nach der Geburt bei mehreren Arten wie der Maus und der Ratte²abgeschlossen. Die Neffon-Stiftung bezieht sich auf die Gesamtzahl der Nätze, mit denen ein Individuum geboren wird, während die Neff-Zahl die Gesamtzahl der zu jeder Zeit nach der Geburt gemessenen Nphronen ist. Der Begriff nephron Nummer und die glomeruläre Zahl werden oft austauschbar verwendet. Da es nur einen Glomerulus pro Neffon gibt, ist die Bewertung der Glomeruli-Zahl ein wichtiger Ersatz für die Schätzung der nephronenlichen Zahl.

Die Bewertung der NPhron-Stimausbeweidung und der Nphron-Zahl ist von klinischem Interesse, da Studien einen Zusammenhang zwischen der Nphron-Ausstattung und der Verringerung der Nphron-Zahlen mit einer erhöhten Häufigkeitvon Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4^{, 5 gezeigt}haben. ^,6, 7^{,8,9, 10,11, 12,13,14}, ¹⁵. Auf der Grundlage von Befunden in Nieren bei der Autopsie beobachtete Brenner, dass hypertensive Individuen mit einer geringeren Gesamtzahl von Npresphronen als normotensive Individuen 16^dargestelltwurden. So vermutete Brenner, dass es einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der nephronen Zahl und dem Risiko, später im Leben zu Bluthochdruck zu entwickeln, gibt. Brenner vermutete auch, dass eine Reduzierung der Nphron-Zahl durch die verbliebenen Neffen kompensiert wurde. Um die normale Filtrationsrate in der Niere zu erhalten, kompensieren Restnephronen durch die Erhöhung ihrer glomerulären Oberfläche (glomeruläre Hypertrophie) und arbeiten so daran, die negativen Auswirkungen des Nuppressionsverlustes auf die Nierenfunktion abzumildern 4 ^,16.

Während die schützende in der kurzfristigen, glomerulären Hypertrophie, auf lange Sicht, führt zu einer erhöhten Natrium-und Flüssigkeitsansammlung, erhöhte extrazelluläre Flüssigkeitsvolumen, und erhöht den arteriellen Blutdruck, was zu einem Teufelskreis von weiteren Anstieg in Glomerulärer Kapillardruck, glomerulare Hyperfiltration, und Neff-Narbenbildung (Sklerose) und Verletzung^4,16.

Die Einholung von Schätzungen oder Zählungen der nephron-Zahl bietet ein paar experimentelle Vorteile: 1) sie liefert Informationen über den Prozess der Nierenentstehung, die dann mit bestimmten Genen oder Faktoren in der Embryonen-oder mütterlich-fetalen Umgebung verknüpft werden können, und 2) Es gibt einen Zusammenhang von nephron Zahl mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und so gibt es das Potenzial, dass Schätzungen der nephron Zahl verwendet werden könnten, um zukünftige Herz-Kreislauf-Risiko^{2,17,18vorherzusagen, 19 , 20 , 21 , 22}. Neben der mütterlich-fetalen Umgebung wirken mehrere Krankheiten direkt auf die Nphron-Zahl und Nierenfunktion, darunter Atherosklerose, Diabetes, Bluthochdruck undsogar normales Altern 2,9^{, 10,11,12,22},²³. Daher ist es wichtig, dass die Beurteilung der gesamten Nierennephron-Zahl sowohl die genetischen als auch die Umweltfaktoren, die die Nierenentzündung beeinflussen (d.h.die Nephon-Stiftung), und die Nphron-Zahl im Laufe des Lebens einer Person und die daraus resultierenden Auswirkungen verstehen. Auf Nierenfunktion und Herz-Kreislauf-Gesundheit.

Derzeit gibt es mehrere Methoden zur Bestimmung und Quantifizierung der nephron-Zahl, die jeweils ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen 24, 25^{, 26,27,28 ,29,30}. Zu den ausgeklügelten Methoden zur Bestimmung der gesamten Nierennephron-Zahl gehören stereologische Methoden, wie die Dissektor/Fractionator-Methode und die Magnetresonanztomographie 25^,26. Die Dissektor/Fractionator-Methode wird oft als Gold-Standard für die Bestimmung der gesamten Nierennachzahl betrachtet und ist sowohl teuer als auch zeitaufwendig. Die jüngsten Fortschritte und Verbesserungen in der Magnetresonanztomographie und-verarbeitung haben die Werkzeuge zur Verfügung gestellt, um jeden einzelnen Neffon einzeln zu zählen. Die Magnetresonanztomographie ist aber nicht nur zeitaufwendig, sondern auch extrem teuer. Darüber hinaus erfordert sowohl die Dissektor/Fractionator-Methode als auch die Magnetresonanztomographie ein fortgeschrittenes technisches Know-how, wodurch der Einsatz solcher Methoden in den meisten Forschungslabors begrenzt wird.

Die meisten Methoden zur Bestimmung der nephron-Zahl machen auf der Grundlage der Identifizierung von Glomeruli Zählungen oder Schätzungen, da sie leicht strukturell erkennbar sind. In diesem Beitrag wird die Säure-Mazerationsmethode zur Abschätzung der Neffonzahl in der ganzen Niere beschriebenund gezeigt 27. Die Säure-Mazerationsmethode ist schnell, zuverlässig und deutlich günstiger als andere Methoden, wie die Dissektor/Fractionator-Methode und die Magnetresonanztomographie. Darüber hinaus liefert die Säure-Mazerationsmethode sehr wiederholbare Schätzungen der Nphron-Zahl, die Berichten zufolge im Bereich der Magnetresonanztomographie 26 liegen.

Nachschub und Reagenzien sind für die Bestimmung der gesamten Nierennummer in einer Maus, also zwei Nieren. Modifikationen für die Verwendung der Säuremerationsmethode für Ratte werden mit Sternchen identifiziert. Alle experimentellen Protokolle, die den National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals entsprechen und vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Mississippi Medical Center genehmigt wurden.

1. Nierenisolierungsverfahren

1. Wiegen Sie die Maus (oder andere Arten) und euthanieren Sie sie mit einem Isoofluran (5%-8%) Überdosis oder Pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneale Injektion).
2. Sobald die Maus euthaniert ist, öffnen Sie ihre Bauchhöhle mit feiner chirurgischer Schere entlang der Mittellinie.
3. Den Darm vorsichtig anheben und den Reproduktionsadipsebereich auf die rechte Seite der Bauchhöhle legen. Durch grobe Trennung, isolieren Sie die linke Niere. Mit einer feinen chirurgischen Schere die linke Nierenarterie und die Vene schneiden und die linke Niere vorsichtig entfernen, indem Sie die Niere in ein entsprechend beschriftetes (Maus-Nummerierung/Identifikator) Gewichtsboot mit phosphorgepuffener Saline (PBS) legen.
4. Wiederholen Sie die Prozedur für die richtige Niere.
5. Jede Niere aus dem jeweiligen Gewichtheber nehmen und auf eine mit PBS vorbefeuchtete chirurgische Gaze legen.
6. Wenn man die Niere auf der chirurgischen Gaze verlässt, entfernen Sie schnell das anhaftende nicht-Rennengewebe (wie perirenales Fettmittel oder Nebennierendrüse), gefolgt von der Entfernung der Nierenkapsel. Wiegen Sie jede Niere einzeln, das Gewicht der linken und rechten Niere separat in einem Labornotebook.

2. Homogenisierungs-, Inkubations-und Strafverfahren

1. Sobald jede Niere gewogen ist, ziehen Sie jedes Gewichtsboot von PBS ab und legen Sie die Nieren zurück in das entsprechend beschriftete Gewichtsboot. Mit einer sauberen Rasierklinge schneiden Sie die Niere in die Hälfte, längs. Jede Niere halb nach unten legen und jede Hälfte in 2 mm oder kleinere Stücke schneiden.
2. Mit dem gleichen Rasiermesser die gehackten Nierenstücke sorgfältig sammeln und in eine beschriftete 15-mL-konische Röhre legen (Maus-Nummerierung/Kennung; links versus rechte Niere).
3. Wiederholen Sie die Prozedur für die gegenüberliegende Niere, mit einer neuen Rasierklinge. Die gehackte Niere in ein separat beschriftetes 15-mL-konische Rohr geben.
4. In einer gut belüfteten Rauchhaube 5 ml 6 M Salzsäure (HCl) zu jedem 15-mL-konischen Rohr hinzufügen.
5. Die Kappe an das konische Rohr ersetzen, das Kidney/HCl-Gemisch sanft anrühren und das 15-mL-konische Rohr in ein vorgeheiztes Wasserbad bei 37 ° C für 90 Minuten (* 120 min für Rattennebel) legen.
6. Während der Brutzeit alle 15 Minuten kurz aufrüsten, um sicherzustellen, dass alle Gewebe HCl-Säure ausgesetzt sind.
7. Eine 18-G-Nadel in eine 5-mL-Spritze (* 10-mL-Spritze für Ratte) geben und vorsichtig die Spritzenspanne entfernen. Die Spritze in ein 50-mL-konisches Rohr (Rohr #1) in eine Rauchhaube geben.
8. Die Kidney/HCl-Lösung aus dem Wasserbad entfernen und die Gewebelösung in das offene Ende der Spritze gießen und das 15-mL-konische Rohr in einem Reagenzgläser-Rack beiseite stellen. Den Kolben vorsichtig ersetzen und langsam drücken, um die Lösung durch die Nadel zu extrudieren und in die Röhre #1 zu pressen.
9. Waschen Sie das 15-mL-konische Rohr mit 5 ml PBS-Lösung. Die PBS in der 15-mL-konischen Röhre schwirren, um das restliche Nierengewebe zu lösen.
10. Auch hier den Kolben vorsichtig aus der 5-mL-Spritze mit der 18-G-Nadel entfernen und den Inhalt aus dem 15 mL-konischen Rohr in das offene Ende der Spritze gießen. Den Kolben vorsichtig ersetzen und die Spritze durch sanftes Drücken auf den Kolben, in den Schlauch #1 spülen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x (insgesamt 3x).
11. Eine 21-G-Nadel in eine neue 5-mL-Spritze (* 10-mL-Spritze für Ratte) geben und vorsichtig die Spritzenspalte entfernen. Die Spritze mit der 21-G-Nadel in ein neues 50-ML-konisches Rohr (Rohr #2) legen.
12. Den Inhalt aus der Röhre #1 in das offene Ende der Spritze mit der 21-G-Nadel gießen. Den Kolben vorsichtig einlegen und die Spritze bündeln, indem Sie den Spritzenpfall vorsichtig nach unten drücken und die extrudierte Lösung in die Rohre legen #2.
13. Waschrohr #1 mit 5 ml PBS-Lösung. Wirbeln Sie die PBS in der Röhre #1, um alle verbleibenden Nierengewebe zu lösen.
14. Auch hier den Kolben vorsichtig aus der 5-mL-Spritze mit der 18-G-Nadel entfernen und den Inhalt aus dem Rohr #1 in das offene Ende der Spritze gießen. Den Kolben vorsichtig ersetzen und die Spritze durch sanftes Drücken auf den Kolben, die in die Rohre #2 drücken. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x (insgesamt 3x).
15. Bringen Sie das Gesamtvolumen der Röhre #2 bis zu 50 mL, indem Sie zusätzliche PBS, bis zur 50-ML-Linie auf Schlauch #2.
16. Inkubat-Rohr #2, das die Nierengewebelösung in einem Röhrenständer auf einer Rocker in einem Kühlschrank enthält, der über Nacht bei 4 ° C liegt (mindestens 8-10 h).

3. Zählung von Glomeruli und Hochrechnung der Nephron-Zahl

1. Das Rohr #2 aus dem Kühlschrank nehmen und das pellende Gewebe wieder aufleben lassen, indem das Rohr mehrmals sanft umgedreht wird, um eine homogene Lösung zu schaffen. Wir empfehlen, Glomeruli nach der Verarbeitung innerhalb von 5 d zu zählen.
2. Vorsichtig aliquot 500 μL der Nierenlösung in einen einzigen Brunnen einer 12-well-Platte. Wiederholen Sie diese 2x, indem Sie jeden Aliquot in einen separaten Brunnen, so dass es drei Brunnen der Nierenlösung pro Niere, für die Analyse in Triplicat.
3. Fügen Sie 500 μL PBS zu jedem der drei Brunnen, die die Nierenlösung enthalten, für eine 1:1-Verdünnung hinzu.
4. Mit einem umgekehrten Mikroskop, zählen Sie die Anzahl der Glomeruli pro Brunnen. Das Zählen wird durch die Verwendung eines Gitters von 16 getrennten Abschnitten unterstützt, die auf dem Boden eines jeden Brunnens platziert sind. Zählen Sie die Anzahl der Glomeruli pro Gitter und addieren Sie dann die Anzahl pro Gitter, um die Gesamtzahl der Glomeruli pro Brunnen zu erhalten. Glomeruli sind durch ihre kugelförmige Struktur leicht zu erkennen. Weitere Identifikatoren waren ein rötlicher Farbton aufgrund blutgefüllter Kapillaren sowie Vor-oder Nacharteriolen, die am Körper einzelner Glomeruli haften bleiben (Abbildung 1).
5. Fügen Sie die Gesamtzahl der Glomeruli pro der drei Brunnen hinzu und teilen Sie sie dann für die durchschnittliche Anzahl von Glomeruli pro 500 μL Nierenlösung um drei. Wenn die Varianz in der durchschnittlichen Anzahl von Glomeruli pro Brunnen größer als 10% ist, wiederholen Sie das Nephron-Zählverfahren, wobei Sie die Homogene Natur der Nierenlösung genau beachten. Multiplizieren Sie die Anzahl der Glomeruli, die je gut mal 100 gezählt werden, für die durchschnittliche Anzahl der Glomeruli pro Niere. Die Gesamtzahl der NPhron kann pro Niere oder mit Nierengewicht pro mg oder g Gewebe angegeben werden.

Im Folgenden finden Sie repräsentative Schätzungen der gesamten Nierennephron-Zahl aus einem etablierten Mausmodell der Hypertonie und einem genetischen Rattenmodell der altersbedingten chronischen Nierenerkrankungen. Für diejenigen, die neu in der Säuremasisierungsmethode sind (Abbildung1), werden wesentliche Identifikationsmerkmale von Glomeruli hervorgehoben, wie zum Beispiel eine kugelförmige Struktur mit oder ohne angebrachte Vor-oder Nach-oder Rohrstrukturen.

Im ersten experimentellen Beispiel wurden bei Mäusen (männlich C57BLk 6,6 Jahre alt) 14 Tage lang, die mit Fahrzeug (Salz) oder Angiotensin II infiziert waren, die Gesamt-Npphron-Zahlen ermittelt. Bei fahrerdurchgepressten Mäusen lag die Nphron-Zahl bei 12.411 ± 248 Neffen pro Niere, wie sie mit der Säure-Mazerationsmethode ermittelt wurden (Abbildung2). Diese Schätzungen sind im Einklang mit den Bereichen der ganzen Nieren-Nphron-Zahl, die zuvor in Mäusen gemeldet wurde (Tabelle 1). Angiotensin erhöhte den Vorhofflimmern nach 14 Tagen Infusion um etwa 40 mmHg und war mit einer signifikanten Reduktion der Nphronzahl (9,122 ± 193 Nätze pro Niere) um fast 26% (Abbildung2) verbunden. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Angiotensin-II-Infusion nicht nur mit Bluthochdruck verbunden ist, sondern auch eine signifikante Verringerung der Nphron-Zahl mit einem Neffonverlust aufgrund von Sklerose oder Glomerular-Verletzungen verbunden ist.

Im zweiten experimentellen Beispiel wurden frühere Befunde der Nudienzahl in einem genetischen Rattenmodell der Nierenagenese, dem heterogenen, von der Erektion abgeleiteten Modell der einseitigen Nierenagentese (HSRA), bestätigt. Das HSRA-Modell weist unvollständige Penetrance-Phenotypen für Nieren-und Harnwege auf, wobei einige Tiere normal geboren werden (mit zwei Nieren) und andere mit einer Niere geboren werden. Bei Ratten, die mit zwei Nieren geboren wurden (männliche hA-Control; 12 Wochen alt), waren Schätzungen der Nphron-Zahl mit der Säure-Mazerationsmethode 27,288 ± 336 Nhronen pro Niere (Abbildung3). Im Gegensatz dazu wurden bei Ratten, die mit einer einsamen Niere geboren wurden (männlich hA-Solitär; 4 Wochen alt), Schätzungen der Nphron-Zahl bei 24,594 ± 883 Nphronen pro Niere signifikant niedriger eingeschätzt (Abbildung3). Schätzungen der in diesen Beispielen erzielten Nphron-Zahl entsprechen auch den zuvor in der Ratte gemeldeten Bereichen (Tabelle 1). Beachten Sie, dass diese Daten im Einklang mit früheren Befunden, in denen hA-Solitary Ratten gefunden wurden, um verminderte Nphron-Stiftung oder Zahlen (im Vergleich zu einer Kontrollniere) zu zeigen, wahrscheinlich Reflexion der zugrunde liegenden genetischen Faktoren, die mit der Geburt verbunden sind Mit einer einzigen Niere31.

Bild 1 : Schlüsselkennzeichen von Glomeruli zum Zählen und Bewerten ganzer Nierennephron-Zahl. Glomeruli sind leicht durch ihre kugelförmige Struktur zu erkennen, wie die Pfeile zeigen. Weitere Identifikatoren sind ein rötlicher Farbton aufgrund blutgefüllter Kapillaren, sowie Vor-oder Nacharteriolen (oder Röhrchen), die nach der Verarbeitung am Körper einzelner Glomeruli haften können (wie die, die am unteren Ende dieses Mikrographen). In diesem Bild sind auch Reste von Röhrchen und Blutgefäßen zu sehen. Vergrößerung = 10X; Skala bar = 100 μm . 

Bild 2 : Nephron Zählen in Mäusen. A) repräsentatives Bild von Glomeruli aus einer einzigen Maus-Kidney, die in einem 22,1-mm-Flachboden einer 12-Kulturplatte platziert ist, wie man sie mit einem umgekehrten Mikroskop sieht. Glomeruli und Nierenröhrchen werden bei mäßiger Dichte gesehen, wenn sie um den Faktor zwei verdünnt werden (0,5 mL Nierenlösung plus 0,5 mL 1x PBS). B) Wirkung eines 14-tägigen Fahrzeugs oder einer Angiotensin-II-Infusion auf die nephron-Zahl bei männlichen C57Bl/6 Mäuse, wie sie durch die glomerulare Zählung bewertet wird. Die Angiotensin-II-Infusion bei 1.000 ng/kg/min (über osmotische Minipumpe) wurde mit Bluthochdruck und einer deutlichen Reduktion der Nphron-Zahl im Vergleich zu der Nphron-Zahl bei Mäusen, die mit dem Fahrzeug infiziert sind, in Verbindung gebracht. Die Neffhron-Nummern in den fahrzeuggebliebenen Mäusen entsprechen den zuvor gemeldeten Schätzungen der Nphron-Zahl bei Mäusen (Tabelle 1). Fahrzeug: n = 3, angiotensin II: n = 3, *p < 0,05. Fehlerbalken = SE. Vergrößerung = 4X; Skala bar = 250 μm .

Bild 3 : Nephron Zählen in Ratten. A) repräsentatives Bild von Glomeruli aus einer einzigen Rattenniere, die in einem 22,1-mm-Flachboden einer 12-Kulturplatte, wie man sie mit einem umgekehrten Mikroskop sieht, beschichtet ist. Glomeruli und Nierenröhrchen sind im Vergleich zu der Maus deutlich höher als in der Maus zu sehen. B) Die Quantifizierung der Nphron-Zahl in HSRA-Control und HSRA-S Ratten zeigt, dass die Nphron-Zahl in HSRA-S im Vergleich zu HSRA-C-Ratten weniger ist und mit den bisherigen Erkenntnissen in diesem Modell31übereinstimmt. HSRA-C, Ratten, die mit zwei Nieren geboren wurden: n = 3; HSRA-S, Ratten, die mit einer einsamen Niere geboren wurden: n = 3,* p & lt;0.05. Fehlerbalken = SE. Vergrößerung = 4X; Skala bar = 250 μm .

Tabelle 1: Berichtete Bereiche der nephron-Zahl in mehreren Arten.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.