Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll, um den Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MicroRNA (MiRNAs) bewerten in Plasma-Proben von Krebspatienten. Insbesondere haben wir einen im Handel erhältlichen Bausatz für zirkulierende MiRNA Extraktion und reversen Transkription verwendet. Zu guter Letzt haben wir eine Gruppe von 24 ausgewählten MiRNAs, die unter Verwendung der benutzerdefinierten Platten in Echtzeit vorab gefleckte Sonde analysiert.

Zusammenfassung

Es ist wachsendes Interesse an flüssigen Biopsie für Diagnose, Prognose und therapeutische Begleitung, die Notwendigkeit zuverlässiger und nützlicher Biomarker für die klinische Praxis zu schaffen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu extrahieren, rückwärts zu transkribieren und bewerten die Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MiRNAs aus Plasma-Proben von Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC). Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierende RNAs von 18-25 Nukleotide in der Länge, die den Ausdruck der Zielgene translationalen Ebene Regeln und spielen eine wichtige Rolle, einschließlich der Pro und Anti-angiogenen Funktion in die Physiopathologie des verschiedenen Organen. MiRNAs sind stabil in biologischen Flüssigkeiten wie Serum und Plasma, das macht sie ideal zirkulierende Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose und Behandlung Entscheidungen und Überwachung. Zirkulierenden MiRNA Extraktion erfolgte mittels eine schnelle und effektive Methode, die sowohl organische als auch Spalte basierenden Methoden beinhaltet. Für MiRNA Retrotranscription verwendeten wir ein Multi-Schritt-Verfahren, das Polyadenylation auf 3' und der Ligatur eines Adapters auf 5' von den Reifen MiRNAs, gefolgt von zufälligen MiRNA Vorverstärkung hält. Wir wählten einen 24-MiRNA benutzerdefinierten Bereich durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) getestet werden und die MiRNA-Sonden auf Array benutzerdefinierter Platten entdeckt. Wir führten qRT-PCR Platte läuft auf einer Echtzeit-PCR-System. Zimmermädchen MiRNAs für Normalisierung wurden ausgewählt, mit GeNorm-Software (v. 3.2). Daten wurden analysiert mit Expression Suite Software (V 1.1) und statistische Analysen wurden durchgeführt. Die Methode erwies sich als zuverlässig und technisch robust sein und könnte nützlich sein, Biomarker Ebenen in flüssigen Proben wie Plasma/Serum oder zu bewerten.

Einleitung

CRC ist die dritte Bösartigkeit und die vierte Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit am häufigsten diagnostiziert. Bis heute sind Bevacizumab (B), einem monoklonalen Antikörper gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), und (C) Cetuximab oder Panitumumab (P), monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), zugelassen First-Line-Behandlung in Kombination mit Chemotherapie (CT)-Regimen.

Mutationen im K-RAS und N-RAS -gen sind die einzige klinisch nützlich Biomarker identifizieren Patienten, die am seltensten zugunsten von Anti-EGFR-basierten CT. Obwohl mehrere Studien sind, zur S....

Protokoll

Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem sterilisierten Abzug entsprechend gute Labor Praxis (GLP).

(1) Plasma Datenerhebung und-Speicherung

1. Sammeln Sie 3 mL des peripheren Blutprobe in einem K3E EDTA-Röhrchen.
2. Zentrifugieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur bei 1.880 X g für 15 min.
3. Der Überstand Plasma in Aliquote von 450 µL zu erholen.
4. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung.
   Hinweis: Prozess der peripheren Blut Tube innerhalb von 2 h Sammlung. Wenn Sie das Plasma aus der Tube wiederherstellen, stören Sie die Lymphozyten-Schi....

Ergebnisse

Analysierten wir ein Gremium von Angiogenese-bezogene zirkulierenden MiRNAs in Bezug auf progressionsfreies Überleben (PFS), insgesamt überleben (OS) und objektives Ansprechen (ORR) in einem 52 mCRC behandelt Patienten mit B-basierten CT. Die Bewertung solcher Biomarker in Plasma-Proben ist aus technischen Gründen schwierig. Wir haben bewährte Methoden für MiRNA-Extraktion aus Patienten Plasmaproben, reverse Transkription und Vorverstärkung. Nach den Anweisungen des Herstellers und mit nu.......

Diskussion

MiRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs (18-25 Nukleotide in der Länge) in der Lage, verbindliche 3' UTR und Umgebung ihr Ziel Boten-RNA und Hemmung bzw. es erniedrigend. Sie können somit gen Ausdruck Regulierungsbehörden auf der translationalen Ebene betrachtet werden. In den letzten zehn Jahren haben mehrere MiRNAs mit Krebs Initiierung und Entwicklung, so dass sie nützliche klinische Biomarker für die Diagnose, Prognose und Therapie korreliert. Geschützt durch RNases, sind MiRNAs in eine stabile Form in biologischen .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rnase-free Safe-lock 1,5 mL Röhrchen	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL Röhrchen	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-frei 20 & micro; L Spitzen	Starlab	S1123-1810
Rnase-frei 200 &Mikro; L-Spitzen	Starlab	S1120-8810
Rnase-frei 1.000 &Mikro; L-Tipps	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA und natives Protein-Aufreinigungskit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA-Synthesekit	Thermo Fisher	A28007
100% Ethanol animodus	Carlo Erba Reagenzien	414605
2-Mercapto-Ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Angewandte Biosysteme	4406984
0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1.000 & Mikro; L Laborpipetten
Tisch-Mikrozentrifuge
Vortex
Tisch-Heizblock
Abzug
0,2 mL PCR-Röhrchen