هنا، فإننا نقدم بروتوكول للاستخدام المتزامن لصدى فورستر الطاقة التوتر القائم على نقل أجهزة استشعار لقياس البروتين الأسفار وتحميل الانتعاش بعد فوتوبليتشينج لقياس ديناميات البروتين مما يتيح قياس حساسة للقوة ديناميات البروتين داخل الخلايا الحية.
خلايا الإحساس والاستجابة للرموز المادية في البيئة الخاصة بهم عن طريق تحويل المنبهات الميكانيكية إلى إشارات قابلة للاكتشاف المتحلل في عملية تسمى ميتشانوترانسدوكشن. خطوة حاسمة في ميتشانوترانسدوكشن هو انتقال القوات بين البيئتين الداخلية والخارجية. لنقل القوات، ويجب أن تكون هناك صلة مادية مستمرة ومتواصلة تم إنشاؤها بواسطة سلسلة من تفاعلات البروتين البروتين. تفاعلاً بروتين-بروتين معين، تحميل الميكانيكية يمكن أن يكون أما أي تأثير على التفاعل، وتؤدي إلى عدم اقتران أسرع من التفاعل، أو حتى تستقر التفاعل. فهم كيف الجزيئية تحميل يملي دوران البروتين في الخلايا الحية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الحالة الميكانيكية للبروتين، بدوره في توضيح دورها في ميتشانوترانسدوكتيون. تفتقر إلى قياسات مباشرة لتحميل البروتين التقنيات الموجودة لقياس ديناميات البروتين المراعية للقوة أو الاعتماد على القياسات يؤديها خارج سياق الخلوية. هنا، نحن وصف بروتوكول لاسترداد fluorescence نقل الطاقة الرنين فورستر بعد تقنية فوتوبليتشينج (اربط الحنق)، التي تمكن من قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين داخل الخلايا الحية. هذه التقنية التي يمكن تطبيقها على أي جهاز استشعار التوتر القائم على الحنق، تيسير دراسة ديناميات البروتين المراعية للقوة في مجموعة متنوعة من الهياكل سوبسيلولار وفي أنواع مختلفة من الخلايا.
البيئة خارج الخلية هو مصدرا غنيا للإشارات البيوكيميائية والجسدي على السواء التي تملي سلوك الخلية. على وجه الخصوص، يمكن التوسط الطبيعة الفيزيائية المكروية الوظائف الخلوية الرئيسية، بما في ذلك نمو الخلايا، والهجرة، وتمايز1،2،،من34. التقلبات وميكانيكا المكروية هو عنصر حاسم للعديد من الأمراض التي لم تقم حتى الآن مثل السرطان5،6من تصلب الشرايين وتليف7العلاج الكافي. فهم كامل لكيفية تحويل الخلايا المحفزات المادية إلى إشارات قابلة للاكتشاف المتحلل، عملية تسمى ميتشانوترانسدوكتيون، ويتطلب الكشف عن الآليات الجزيئية بوساطة قوة الإرسال، سواء داخل وخارج الخلايا و داخل هياكل سوبسيلولار متعددة.
داخل هياكل سوبسيلولار والبروتينات يتحولون باستمرار؛ ملزمة وكائنة على أساس قوة تفاعلاتها مع ربط الشركاء8. للقوات بنجاح إرسالها عبر مسافة مادية، يجب أن يكون هناك سلسلة تفاعلات البروتين البروتين، مما يعني أن دوران للبروتين يجب أن تكون بطيئة ما يكفي لإدامة وإرسال قوة إلى شريك ملزم9غير منقطعة. بينما تفاعلات البروتين البروتين عموما تتكون من عدة غير تساهمية سندات بين المجالات البروتين، غالباً ما يتم تصور التفاعل كدولة منضمة يمكن الانتقال إلى حالة غير منضم تحت ظروف مختلفة10، 11-لوجود تفاعل بروتين-بروتين معين، فمن الممكن أن القوة يمكن أن يكون أي تأثير على عمر التفاعل، المعروف في “سندات مثالية”، وتقليل مدة التفاعل، المعروفة باسم “سند زلة”، أو زيادة عمر التفاعل ، المعروف باسم “سند قبض”10. ومن ثم، هناك علاقة معقدة بين ديناميات البروتين، الذي نشير إليه بوصفه ديناميات القوة الحساسة وتحميل البروتين.
نحو فهم تأثير الحمل على ديناميات بوند، تم إجراء عدد من التجارب الزاخرة على مستوى جزيء واحد. استخدام البروتينات المعزولة، أو أجزاء من البروتينات وتقنيات التلاعب مثل ملاقط مغناطيسية وملاقط بصرية ومجهر القوة الذرية، أثبتت هذه الدراسات تفاعلات البروتين البروتين المراعية للقوة لعدة ذات الصلة البروتينات11،12. كلا إينتيجرينس13 وكادهيرينس14، التي بروتينات transmembrane هام لتشكيل خلية خلية والخلية-مصفوفة التفاعلات، على التوالي، قد أثبتت التعديلات في ديناميات الواجب لتحميل. داخل الخلية، يتم تجنيده لكلا تالين15 و α-كاتينين16 بطريقة تعتمد على قوة فينكولين ويمكن تشكيل رابطة صيد مع الأكتين17، مشيراً إلى دور حاسم فينكولين في الالتصاقات المحورية (فاس) وتقاطعات أدهيرينس (عيس ) تحت تحميل. دراسات جزيء واحد تسمح لعزل تفاعلات البروتين البروتين محددة ويسفر عن نتائج لا لبس فيها، ولكن أنها لا تراعي الطابع المعقد للبيئة الخلوية.
التجارب التاريخية أظهرت أن العديد من الهياكل سوبسيلولار، بما في ذلك منظمة تضامن النساء الأفريقيات وعيس، ميتشانوسينسيتيفي، ومعرض الجمعية تعزيز استجابة للأحمال المولدة داخليا أو خارجياً تطبيقها18،19، 20،،من2122. بالإضافة إلى ذلك، اقترح عدة نماذج نظرية أن الجمعية ميتشانوسينسيتيفي يمكن أن يكون مدفوعا بروتين القوة الحساسة ديناميات23،،من2425. لفحص هذه الديناميات المراعية للقوة داخل الخلايا الحية، اتخذت النهج غير المباشرة قليلة. فراب والتقنيات ذات الصلة توفر منهجية بسيطة نسبيا لقياس ديناميات البروتين في خلايا26،27،،من2829. ومع ذلك، قد قياس البروتين تحميل أكثر محدودية. نهج نموذجي مقارنة ديناميات البروتين في الخلايا مع أو بدون التعرض مثبط سيتوسكيليتال المستخدمة للحد عموما خلية contractility،8،،من3031. وهذا من الناحية المفاهيمية، مقارنة بين تحميل عالي والدوله تحميل منخفض. ومع ذلك، هناك لا التحديد الكمي للتحميل عبر البروتين في أي دولة، وقد تكون هناك آثار غير مقصودة البيوكيميائية للمانع، هذه خسارة مواقع الربط الرئيسية على طول خيوط أكتين و. نهج آخر، خاصة بفاس، تم قياس مجموع قوة كشفه على الركيزة باستخدام مجهر القوة الجر التقريبي التحميل الجزيئية ودراسة العلاقة مع القوى المحركة للبروتين وحيد داخل اتحاد كرة القدم32اتحاد كرة القدم. في حين يسمح هذا النهج للتحديد الكمي لمجموع القوة، أنه لا يقدم معلومات محددة جزيئيا. منظمة تضامن النساء الأفريقيات تتكون من البروتينات المختلفة ما يزيد على 200، وكثير منها يمكن أن تحمل حمولة33. وهكذا، قياس ناتج مجموع القوة FA يحتمل أن يحجب إمكانية مسارات انتقال القوة متعددة ولا توفر مقياسا لتحميل موثوق على بروتين معين.
خلافا للنهج السابق في ميتشانوبيولوجي، ظهور أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق يسمح مباشرة قياس الأحمال التي تعانيها بروتينات محددة داخل الحية الخلايا34،،من3536. نقدم هنا، بروتوكول الذي يجمع بين أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق مع التدبير القائم على فراب لديناميات البروتين. ونشير إلى هذا الأسلوب اربط الحنق. ويمكن هذا النهج المتزامن قياس حمولة البروتين وديناميات البروتين، مما يتيح تقييم ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية (الشكل 1). بالفعل، طبق تقنية اربط الحنق على دراسة ديناميات القوة الحساسة فينكولين بروتين رابط الميكانيكية37. وقد وضعت أجهزة استشعار التوتر للعديد من البروتينات ذات الصلة في مجموعة متنوعة من الهياكل سوبسيلولار. على سبيل المثال، وضعت أجهزة الاستشعار فينكولين34 وتالين38،39 في فاس، وكادهيرينس، وكاتينينس في عيس40،،من4142، نيسبرين في اللغوي النووية المعقدة 43و α-أكتينين44 و فيلامين36 في سيتوسكيليتون، و MUC-1 في جليكوكاليكس45، بين أمور أخرى46. وبالمثل، فراب وقد استخدمت تقنية شائعة استخدام في البروتينات ميتشانوسينسيتيفي داخل الالتصاقات التنسيق8،31و تقاطعات أدهيرينس47، أكتين اللحاء26، ونواة48. ووضع أجهزة الاستشعار، والسماح للقياسات لديناميات القوة الحساسة في مجموعة متنوعة من السياقات وهياكل سوبسيلولار المضي قدما، ينبغي أن يكون الأسلوب اربط الحنق نطاق واسع ينطبق على أي من هذه المجسات الموجودة أو حديثا. تحقيقا لهذه الغاية، نحن نقدم بروتوكول مفصلاً، والمعمم لتنفيذ الأسلوب اربط الحنق المطبقة في هذه النظم المختلفة. ونأمل أن هذا سيمكن مجموعة متنوعة واسعة من التجارب توضيح أدوار مختلف البروتينات ميتشانوسينسيتيفي في تنظيم انتقال القوة وفي التوسط في سلوك الخلية.
يسمح أسلوب اربط الحنق للقياس المباشر لديناميات بروتين القوة الحساسة، خاصية التي كان من الصعب لمباشرة التحقيق داخل الخلايا الحية. حساسية البروتين ديناميات لتحميل الجزيئية أمر حاسم لوظيفة البروتين كقوة جهاز الإرسال أو محول الطاقة. تحميل مطلوب لنقل المولدة داخليا على حد سواء وقوات تطبيق خ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيده هذا العمل جائزة “المهنة مؤسسة العلوم الوطنية” (NSF-CMMI-14-54257) فضلا عن المنح المقدمة من جمعية القلب الأمريكية (16GRNT30930019)، والمعاهد الوطنية للصحة (R01GM121739-01) منحت للدكتور عبدالله حسين هوفمان ووطنية العلوم مؤسسة الدراسات العليا البحوث منحة “الزمالة” إلى روثنبرغ كاترين. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لجبهة الخلاص الوطني أو المعاهد الوطنية للصحة.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |