Artículo de método

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

DOI:

10.3791/58619

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2 de noviembre de 2018

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células detectar y responden a las señales físicas en su entorno mediante la conversión de estímulos mecánicos en señales detectables bioquímicamente en un proceso llamado mecanotransducción. Un paso crucial en la mecanotransducción es la transmisión de fuerzas entre los entornos internos y externos. Para transmitir las fuerzas, debe existir un vínculo físico sostenido, intacto creado por una serie de interacciones proteína-proteína. Una interacción de proteína-proteína dada, carga mecánica no puede tener ningún efecto en la interacción, conducen a la rápida disociación de la interacción, o incluso estabiliza la interacción. Entender cómo molecular carga dicta volumen de proteína en las células vivas puede proporcionar información valiosa sobre el estado mecánico de una proteína, a su vez dilucidar su papel en la mecanotransducción. Técnicas existentes para medir la dinámica de la proteína sensible a la fuerza o falta de mediciones directas de la carga de proteína o confían en las mediciones realizadas fuera del contexto celular. Aquí, describimos un protocolo para la recuperación de fluorescencia de transferencia de Förster Resonancia energética después de photobleaching (FRAP traste) técnica, que permite la medición de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza dentro de las células vivas. Esta técnica es potencialmente aplicable a cualquier sensor de tensión basado en el traste, facilita el estudio de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza en variedad de estructuras subcelulares y en diferentes tipos celulares.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El medio extracelular es una fuente rica de estímulos bioquímicos y físicos que determinan el comportamiento celular. En particular, la naturaleza física del microambiente puede mediar claves funciones celulares, incluyendo el crecimiento celular, migración y diferenciación1,2,3,4. Dysregulation de la mecánica del microambiente es un componente crítico para muchas enfermedades que aún no tienen tratamientos adecuados, tales como cáncer5, ateroesclerosis6y fibrosis7. Una completa comprensión de cómo las células convierten estímulos físicos en señales detectables bioquímicamente, un proceso llamado mecanotransducción, requiere la aclaración de los mecanismos moleculares que median la transmisión de la fuerza, tanto dentro y fuera de las células y dentro de varias estructuras subcelulares.

Dentro de estructuras subcelulares, las proteínas están cambiando constantemente enlace y desenlace basado en la fuerza de sus interacciones vinculantes socios8. Para que las fuerzas ser transmitido con éxito a través de una distancia física, deben existir una cadena ininterrumpida de interacciones de proteínas, lo que significa que volumen de ventas de la proteína debe ser lo suficientemente lento para mantener y transmitir la fuerza a su pareja de enlace9. Mientras que las interacciones proteína-proteína generalmente consisten de varios no-covalentes entre los dominios de la proteína, la interacción a menudo se conceptualiza como un estado encuadernado que puede la transición a un estado independiente bajo diferentes condiciones10, 11. una interacción proteína-proteína dada, es posible que fuerza puede tener ningún efecto en la duración de la interacción, conocida como un "vínculo ideal", reducir la duración de la interacción, conocida como un "bono de resbalón" o aumentar la duración de la interacción , conocido como un "bono de captura"10. Así, hay una intrincada relación entre la carga de proteínas y la dinámica de la proteína, que denominamos sensible a la fuerza dinámica.

Para entender el efecto de la carga dinámica de bond, un número de experimentos altamente informativos se han realizado en el nivel de una sola molécula. Utilizando proteínas aisladas o fragmentos de proteínas y técnicas de manipulación, como pinzas magnéticas, pinza óptica y microscopía de fuerza atómica, estos estudios han demostrado las interacciones de proteínas sensibles a la fuerza por varios relevantes proteínas11,12. Ambas integrinas13 y caderinas14, que son proteínas transmembranales importantes para la formación de interacciones célula-matriz y célula-célula, respectivamente, han demostrado alteraciones en la dinámica debido a la carga. Dentro de la célula, vinculina es reclutado a ambos talin15 y α-catenina16 en una forma dependiente de la fuerza y puede formar un lazo de captura con actina17, indicando un papel crucial para vinculin en adherencias focales (FAs) y uniones adherentes (AJs ) bajo carga. Estudios de una sola molécula permiten el aislamiento de las interacciones proteína-proteína específica y resultados sin ambigüedades, pero no tienen en cuenta la complejidad del entorno celular.

Señal los experimentos demostraron que varias estructuras subcelulares, como FAs y AJs, mechanosensitive y exhiben mayor Asamblea en respuesta a cargas generadas internamente o externamente aplicado18,19, 20,21,22. Además, varios modelos teóricos han sugerido que mechanosensitive Asamblea podría ser conducido por la proteína sensible a la fuerza dinámica23,24,25. Para examinar estas dinámicas sensibles a la fuerza dentro de las células vivas, se han tomado algunos enfoques indirectos. FRAP y técnicas relacionadas proporcionan una metodología relativamente simple para medir la dinámica de la proteína en células26,27,28,29. Sin embargo, la medición de la carga de proteína ha sido más limitada. Un enfoque típico es comparar la dinámica de proteínas en células con y sin la exposición a un inhibidor de citoesqueleto utilizado para reducir el total de la célula contractilidad8,30,31. Conceptualmente, se trata de una comparación entre una alta carga y el estado de baja carga. Sin embargo, no hay ninguna cuantificación de la carga a través de la proteína en cualquier Estado, y puede haber efectos bioquímicos no intencionales del inhibidor, la pérdida de sitios de Unión clave a lo largo de un filamento de actina F. Otro método, específico para FAs, ha sido medir el esfuerzo total de la fuerza en el substrato por la FA mediante microscopía de fuerzas de tracción aproximada carga molecular y examinar la relación con la dinámica de una sola proteína dentro de la FA32. Mientras que este enfoque permite la cuantificación del total de la fuerza, no proporciona información molecular específica. FAs se componen de más de 200 proteínas diferentes, muchos de los cuales pueden llevar de carga33. Así, la salida total de la fuerza de una FA de medición potencialmente oscurece la posibilidad de múltiples vías de transmisión de fuerza y no fiable proporciona una medida de la carga sobre una proteína específica.

A diferencia de los enfoques anteriores en la mecanobiología, el advenimiento de los sensores de tensión basados en traste permite directo34,35,36células de medición de cargas de proteínas específicas dentro de la vida. Aquí, presentamos un protocolo que combina sensores de tensión basados en traste con FRAP basado en medida de la dinámica de la proteína. Nos referimos a esta técnica como FRAP de traste. Este enfoque permite la medida simultánea de la carga de proteína y la proteína dinámica, permitiendo la evaluación de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza en las células vivas (figura 1). Ya se ha aplicado la técnica de FRAP de traste para el estudio de la dinámica sensible a la fuerza de la mecánica vinculador proteína vinculina37. Sensores de tensión se han desarrollado numerosas proteínas que intervienen en una variedad de estructuras subcelulares. Por ejemplo, se han desarrollado sensores para vinculin34 y talin38,39 en FAs, caderinas y cateninas en AJs40,41,42, nesprin en el LINC nuclear complejo 43y44 de la α-actinina filamin36 en el citoesqueleto y MUC-1 en el glicocálix45, entre otros46. Asimismo, el FRAP es que una técnica comúnmente utilizada ha sido utilizada en proteínas mechanosensitive adherencias focales8,31, las ensambladuras de los adherens47, actina corteza26y núcleo48. Avanza, que la técnica de FRAP traste debe ser ampliamente aplicable a cualquiera de estos sensores existentes o recién desarrollado sensores, lo que permite la medición de la dinámica sensible a la fuerza en una amplia variedad de contextos y estructuras subcelulares. Hacia este fin, proporcionamos un protocolo detallado, generalizado para la aplicación de la técnica de FRAP traste aplicable en estos sistemas. Ojala, esto le permitirá una amplia variedad de experimentos de dilucidar el papel de diversas proteínas mechanosensitive en la regulación de transmisión de la fuerza y en la mediación de comportamiento celular.

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Protocolo

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1. generar muestras para la proyección de imagen

  1. Construcción de sensor de tensión estable expresa en tipo celular deseado.
    1. Clon de tensión sensor construcción pRRL vector o otros plásmidos de expresión viral.
      Nota: Varias herramientas de clonación moleculares diferentes están disponibles para lograr este paso incluyendo el uso de enzimas de restricción, extensión e Gibson Asamblea35. El vector pRRL se utiliza en la transducción viral lenti y permite un alto grado de producción de la proteína mediante el uso del promotor de citomegalovirus humano (CMV). Diferentes vectores pueden ser necesaria para un contexto particular. Por ejemplo, el promotor del CMV es silenciado en algunos tipos celulares del49. Además, sensores basados en el traste que contiene proteína fluorescente falta de homología de secuencia fuerte, como mTFP1 y A206K de Venus, puede utilizarse para crear líneas celulares estables. Sensores que contiene proteína fluorescente ciánica y proteína fluorescente amarilla probablemente estarán sujetas a recombinación homóloga50.
    2. Generar lentivirus en células de riñón embrionario humano (HEK) 293T utilizando plásmidos de empaquetado de pMD2.G uso de métodos de producción de virus estándar51y psPax2.
      PRECAUCIÓN: Lentivirus deben manipularse solamente por personal debidamente capacitado en un ambiente de laboratorio de bioseguridad nivel 2.
      Nota: Esta combinación de células y plásmidos de embalaje es apropiada para uso con pRRL. Otros sistemas pueden requeridos con otros vectores.
    3. Transducir células deseadas con virus mediante transducción estándar protocolos52 y utiliza citometría de flujo para clasificar las células53 selección de una población homogénea expresando cada construcción en niveles endógenos aproximadamente37. Después de la selección de la célula, los experimentos pueden llevarse a cabo inmediatamente o las células se pueden congelar criogénicamente para su uso posterior. No exceda 2 ciclos de congelación y descongelación de una línea celular estable dado.
      Nota: El uso de líneas celulares deficientes en la proteína a ser estudiada (p. ej., MEFs vinculin- / - para el uso con el sensor de tensión del vinculin) aumentará la señal a ruido ratio en experimentos de traste como límite artefactos de expresión. Dichas líneas de fibroblastos embrionarios (MEF) ratón estable pueden ser utilizados para aproximadamente 15 pasos antes de pérdida significativa de la expresión o la degradación de los sensores es evidente. Si no se desean virales basada en métodos, una plétora de reactivos comerciales puede utilizarse según protocolo del fabricante para transfectar transitoriamente una variedad de tipos celulares con sensores de tensión en un plásmido adecuado, como pcDNA3.1. Expresión óptima será de 24-48 h tras la transfección.
  2. Preparación de sustratos para la siembra de células.
    1. Adquirir 4, platos de 35 mm con fondo de cristal.
    2. Trabajar en una campana de cultivo celular, en un tubo de 15 mL canónico, hacen 4 mL de 10 μg/mL fibronectina en solución tampón fosfato salina (PBS) con PBS estéril en la campana de la cultura de célula. Invierta el tubo una vez suavemente para mezclar y deje la solución reposar por 5 min en la campana de la cultura de célula.
      Nota: La concentración o tipo de ECM proteínas puede tener para otros tipos de células. Las condiciones son convenientes para la MEFs.
    3. Pipetear 1 mL de solución de fibronectina en cada plato con fondo de cristal.
    4. Dejar la solución de fibronectina en la vajilla por 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
    5. Aspirar la solución de fibronectina, enjuague una vez con PBS y añadir 1 mL de PBS.
  3. Semilla de las células en sustratos preparados.
    1. Comience con las células de interés en un porcentaje de confluencia apropiado para subcultivation en una placa de cultivo de 6 cm.
      Nota: Diferentes tipos de células requieren de condiciones de cultivo de células diferenciadas y protocolos de subcultivation. Esta sección proporciona pautas adecuadas para la MEFs. Por lo general, se cultivan MEFs a 85% de confluencia antes de subcultivation.
    2. Trabajando dentro de una campana de cultivo celular, enjuague las celdas una vez con 3 mL de PBS. Añadir 1 mL de 0.05% tripsina-EDTA e incubar 5 min a 37 ° C.
    3. Añadir 3 mL de medio completo en el plato de 6 cm, recoger las células y coloque en un tubo cónico de 15 mL.
      Nota: Composición para medios completo dependerá del tipo de célula se utiliza. Para MEFs, media completa se define a menudo como modificado Eagle medio de glucosa alta Dulbecco con suero bovino fetal 10%, 1% antibiótico-antimicótico (conteniendo anfotericina B, penicilina y estreptomicina) y una solución de aminoácidos no esenciales (AANE) 1%.
    4. Girar las células por a 1000 x g durante 5 minutos.
    5. Aspire los medios de comunicación y resuspender el precipitado de células en 1 mL de medio completo.
    6. Quitar PBS de los platos de vidrio recubierto de fibronectina. Contar las células y semilla de 30.000 células en cada plato de vidrio recubierto de fibronectina con los medios mas adecuados para un volumen final de 1.5 mL.
      Nota: La densidad de este celular es apropiada para MEFs y conducirá a una población de células que no están tocando, pero no excesivamente escaso. El número exacto de la célula puede necesitar para otros tipos de células u otra imagen de la cámara.
    7. Permitir a las células a 4 h después de siembra. A las 2 h de separarse, aspirar el medio de crecimiento y enjuague una vez con los medios de comunicación, dejando 1,5 mL de medios de comunicación la proyección de imagen de imagen.
      Nota: Este tiempo que se separa es apropiado para la MEFs pero deba modificarse para otras células. Sin embargo, períodos de incubación de más de 6-8 h dará lugar a la deposición significativa de ECM proteína del suero en los medios de comunicación completa. Los medios de comunicación la proyección de imagen debe contener las mismas adiciones como medios completo pero debe ser ópticamente claro y no contener compuestos que es fluorescente en canales de proyección de imagen, como flavinas o apagar de la fluorescencia, como el rojo de fenol. Un medio de utilidad general es medio DMEM-gfp vivo celular visualización suplementado con solución al 10% FBS y 1% AANE. Si fondo autofluorescencia es inaceptablemente alto, puede reducirse la cantidad de suero. Si no es posible un cambio de los medios de comunicación después de la chapa inicial, pueden ser directamente serán suspendidas las células en imágenes de medios complementados con un inhibidor de la tripsina.

2. configurar microscopio para obtener imágenes

  1. Encienda el microscopio.
    1. Encienda la lámpara de arco primero.
      Nota: Una lámpara de arco se libere un pulso electromagnético, que pueden dañar otros equipos que ya está en.
    2. Encienda el controlador de la rueda de filtro regulador etapa automatizada, interfaz de la computadora de microscopio y cámara.
    3. Encienda el FRAP láser y láser controladores de posición.
      PRECAUCIÓN: Láseres de alta potencia pueden ser perjudicial a los ojos si se ve directamente. Se recomienda configurar el sistema de microscopio para bloquear la excitación láser de dirigida a los pedazos del ojo, que pueden ser logrados mediante el movimiento de un espejo en la trayectoria de viga FRAP durante el blanqueamiento para reflejar el láser hacia la muestra y evitar la transmisión en el ocular.
    4. Encienda la computadora y software de control de microscopio abierto.
    5. Permita 15 minutos para la lámpara de arco y FRAP láser para calentar.
  2. Calibrar el laser FRAP.
    1. Abra la ventana de configuración de láser. Ajuste La iluminación (durante el impulso) a la configuración adecuada de la iluminación del FRAP para la exposición del láser a la muestra. Establecer Ajuste de iluminación (durante la proyección de imagen) para la configuración de la iluminación apropiada para la proyección de imagen sólo el fluoróforo aceptor.
    2. Seleccione el objetivo de calibrar en Ajuste de sistema de coordenadas. Desactive Manualmente, haga clic en los puntos de calibración y compruebe Mostrar las imágenes durante la calibración.
    3. Configurar el tiempo de permanencia a 10.000 μs y el número de pulsos a 100.
    4. Lugar la diapositiva de calibración, de bromuro de etidio sellado entre un portaobjetos de vidrio y un cubreobjetos en el adaptador de la etapa con el cubreobjetos hacia abajo.
      PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno y debe manipularse con guantes. Si la diapositiva está comprometida, disponer de acuerdo con las directrices de la institución.
    5. Utilizar la configuración de iluminación aceptador para centrarse en la superficie de la diapositiva, como el plano focal con la señal más brillante. Pequeños defectos en la capa será visibles para ayudar en el centrado.
    6. Mueva la diapositiva a una zona con fluorescencia uniforme en el plano de proyección de imagen.
    7. Haga clic en crear configuración. El software será inicializar el proceso de calibración, blanqueo y automáticamente detecta la posición del punto blanqueado.
    8. Garantizar la calibración mediante la evaluación de la imagen final, que será una cuadrícula de 3 x 3 de blanqueado que debe ser distribuido uniformemente y en foco. Guarda la imagen de calibración para referencia futura.
    9. Eliminar la diapositiva de calibración y almacenar de manera segura. Calibración debe realizarse antes de iniciar cada experimento pero no es necesario realizar entre muestras.

3. elegir los parámetros para la proyección de imagen de traste

  1. Fijar una de las muestras generadas de las células expresando el sensor de tensión con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos solución de paraformaldehído al debe ser metanol libre, referido a menudo como EM-grado, para evitar la desnaturalización de las proteínas fluorescentes. Coloque en PBS después de la fijación.
    PRECAUCIÓN: Las soluciones paraformaldehido son tóxicos. Este paso debe realizarse en una campana de humos y la solución debe desecharse de acuerdo con las políticas institucionales.
    Nota: Esta optimización no depende de la dinámica de la proteína, y una muestra fija permite tiempo de proyección de imagen máximo sin preocuparse por la salud de la célula.
  2. Enjuague la muestra tres veces con PBS y dejar en PBS.
    Nota: Uso de medios de montaje más disponible en el comercio afectará fluoróforo propiedades, haciendo la muestra inadecuada para FRET imagen54. Idealmente, las células se reflejada inmediatamente, pero se pueden dejar durante la noche a 4 ° C. Tiempos de espera más largos dará lugar a deterioro de la muestra.
  3. Coloque la muestra en el soporte de la etapa de microscopio para la proyección de imagen.
  4. Abra la herramienta multidimensional adquisición (MDA). Establecer una proyección de imagen secuencial de tres canales: excitación único aceptador y emisión (canal de aceptador), excitación de donantes y emisión del aceptador (canal de traste) y excitación sólo de donantes y emisión (canal de donantes).
    Nota: Hay una gran variedad de formas de las muestras FRET imagen. Se recomienda el método tres canales o "cubo de tres" de la proyección de imagen con medio de calibrar el sistema para medir la eficiencia de traste para sensores de tensión basados en traste55,56. Este enfoque es rápido, simple, requiere sólo un estándar fluorescencia microscopio de imagen y permite la comparación de los experimentos en días diferentes y configuraciones de imagen.
  5. Analizar la muestra con un tiempo de exposición de 500 ms y un filtro de densidad neutra (ND) de 10%. Encontrar una célula expresando el sensor de la tensión con la localización clara de una estructura de interés.
  6. Seleccione un tiempo de exposición de 500 ms o la longitud deseada para cada canal de proyección de imagen y un filtro ND de 100% y adquirir una secuencia de imágenes de traste.
  7. Estimar la intensidad media del sensor en las estructuras subcelulares de interés en cada canal de proyección de imagen. Señales bajas pueden conducir a resultados inexactos debido a cálculos de corrección inadecuada, no linealidades en detectores o contribución significativa de las señales de fondo. Una guía aproximada es apuntar para intensidades superiores al 10% de la gama dinámica de la cámara (es decir., para una cámara de 16 bits, intensidad debe estar por encima de 6.000).
    Nota: Los ajustes ópticos idénticos (tiempos de exposición, filtros, objetivos y otras variables tales como aumento de cámara o binning) deben utilizarse para todos los experimentos de traste que se comparará. Cambiar cualquiera de estos ajustes darán lugar a una alteración en la cantidad de trastes que es generado o detectadas en la instalación de microscopía. TRASTE eficiencia medidas son independientes de estos establecimiento, pero no son los factores de calibración para determinar la eficacia de traste. En teoría, varios grupos de factores de calibración podrían utilizarse para generar eficiencias de traste de configuraciones ópticas diferentes, pero no es recomendable. Blanqueo o fototoxicidad puede ser diferente entre las diferentes configuraciones, crear resultados falsos.
  8. Adquirir una segunda secuencia de imágenes de traste del mismo campo de visión. Estimar el fotoblanqueo entre marcos comparando intensidad media del sensor en cada canal de proyección de imagen. Fotoblanqueo debe mantenerse al mínimo, preferiblemente menos que 1-5% de pérdida de señal.
  9. Ajustar los parámetros de proyección de imagen para maximizar la intensidad y reducir al mínimo el fotoblanqueo. Para los ajustes gruesos, cambie el filtro ND se utiliza durante la adquisición. Para ajustes más finos, cambiar el tiempo de exposición en pasos de 250 ms.
  10. Repita los pasos 3.5 – 3.8 hasta señal adecuada puede obtenerse minimizando el fotoblanqueo.
    Nota: Típicamente, ajustes para el sensor de tensión de la vinculina en MEFs vinculin- / - son 1.500 ms, ms de 1.500 y 1.000 ms para los donantes y FRET aceptor canales respectivamente. Los valores óptimos varían con el tipo de sistema de iluminación, objetivos, sistemas de filtro y sensor de nivel de expresión.

4. elegir parámetros para la proyección de imagen de FRAP

  1. Optimizar la configuración del láser para asegurar el blanqueamiento completo de la región de interés (ROI) sin blanquear los alrededores o que causan fotoenvejecimiento.
    1. Fijar una de las muestras generadas de las células expresando el sensor de tensión con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos.
      Nota: Esta optimización no depende de la dinámica de la proteína, y una muestra fija permite tiempo de proyección de imagen máximo sin preocuparse por la salud de la célula. Esto también evitará que la recuperación de blanqueo por proteínas móviles, lo que permite el aislamiento del efecto de blanqueamiento, evitando cualquier efecto de recuperación de fluorescencia rápida, mediada por la difusión que se produce entre la incidencia de blanqueamiento y tomando el primera imagen del post de bleach.
      PRECAUCIÓN: Las soluciones paraformaldehido son tóxicos. Este paso debe realizarse en una campana de humos y la solución debe desecharse de acuerdo con las políticas institucionales.
    2. Enjuague la muestra 3 veces con PBS y dejar en PBS.
      Nota: El uso de medios de montaje más disponible en el comercio afectará fluoróforo propiedades, haciendo la muestra inadecuada para FRAP imagen54. Idealmente, las células se reflejada inmediatamente, pero se pueden dejar durante la noche a 4 ° C. Tiempos de espera más largos dará lugar a deterioro de la muestra.
    3. Coloque la muestra en el soporte de la etapa de microscopio para la proyección de imagen.
    4. Abra la ventana de configuración de láser. Comenzar con establecer un tiempo de permanencia de láser de 1.000 μs y 10 impulsos, lo que significa que cada punto en la exploración en el retorno de la inversión va a recibir 10.000 μs de potencia láser
      Nota: Un 500 mW, 515 nm láser fue utilizado para el blanqueo. Esto fue elegido para selectivamente lejía A206K de Venus, el aceptador de la vinculina sensor de tensión, con la máxima eficacia. Si se utilizan sensores de tensión basados en traste con otras proteínas fluorescentes, puede tener otro tipo de láser a emplear.
    5. Encontrar una célula expresando el sensor de la tensión con la localización clara de una estructura de interés y adquirir una imagen.
    6. Dibujar un ROI rectangular sobre la zona a blanquear y almacenar la ubicación de retorno de la inversión. Pulso del láser. Coloque otra imagen de la muestra.
      Nota: El tamaño de la caja debe ser aproximadamente del tamaño de la FA todo. Debe tenerse cuidado que el tamaño de la caja no varía drásticamente a través de experimentos. Debe controlarse cuidadosamente la zona blanqueada en proteínas cuya dinámica se ven afectado por la difusión. Esta es una preocupación potencial de proteínas transmembranales, como cadherins47, o proteínas que difunden lentamente27,57.
    7. Compruebe la calidad de fotoblanqueo comprobando que el ROI todo se blanquea tales que la intensidad está cerca de niveles de fondo. Además, asegúrese de que no es ninguÌ n blanqueo fuera el retorno de la inversión.
    8. Ajuste el láser según sea necesario para lograr una cantidad importante de blanqueo en el ROI sin inducir blanqueamiento significativo fuera el retorno de la inversión. Para los ajustes gruesos, subir y bajar el tiempo de permanencia en pasos de 100 μs y para ajustes finos, suba y baje el número de pulsos en pasos de 5 pulsos.
    9. Repita los pasos 4.1.5-4.1.8 hasta llegar a la configuración mínima que el ROI es blanqueado totalmente sin objetivo fotoblanqueo.
      Nota: Lograr un sustancial valor blanqueamiento inicial sin inducir fototoxicidad es un aspecto clave del análisis FRAP. Utilizar las opciones de láser que resultan en un blanqueo completo en muestras fijadas. En general, debe utilizarse el mínimo número de fotones para alcanzar el nivel de blanqueo deseado. Además, el protocolo del blanqueo debe mantenerse relativamente constante durante los experimentos, como alteraciones pueden afectar las mediciones de proteína dinámica58.
  2. Optimizar parámetros de Time-lapse para capturar totalmente la dinámica de la proteína de interés minimizando el fotoblanqueo.
    1. Preparar la instalación de microscopía para la proyección de imagen de células vivas, preferiblemente con una platina calefactada y objetivo así como control de CO2 . Permita que se equilibre durante 20 minutos.
      Nota: Para mantener la salud de las células reflejadas, temperatura y el pH deben mantenerse en el vaso de la proyección de imagen. Una variedad de etapas de calefacción y calentadores de objetivo puede mantener fácilmente la temperatura de la célula a 37 ° C. El control de pH para muchos tipos de medios se puede lograr mediante el uso de una bomba peristáltica a paso humidificado 5% CO2 sobre la muestra en 15 mL/min como alternativa, si control de CO2 es de carácter, en medios que contienen HEPES de imagen debe utilizarse para evitar cambios de pH grande.
    2. Lugar una de las muestras generadas de las células expresando el sensor de la tensión en el soporte de la etapa de microscopio para la proyección de imagen. Permiten para equilibrar durante 10 minutos.
    3. Con la herramienta MDA, configurar un time-lapse para adquirir 3-5 imágenes pre-bleach, bleach el retorno de la inversión y seguir tomando imágenes de 10-60.
      Nota: Para la vinculina en FAs, la proyección de imagen cada 5 s por lejía después de 5 minutos es suficiente para observar la dinámica sin introducir excesivo blanqueamiento31. Puntos de partida útiles para tasa de proyección de imagen y duración de muchas otras proteínas pueden encontrarse en la literatura47,48,59,60.
    4. Utilice el aceptador de la proyección de imagen ajustes que reduzcan al mínimo la exposición de la muestra a la luz, manteniendo una relación señal a ruido suficiente, para la estructura de interés de la imagen. Un buen punto de partida es la mitad de la ND filtro y exposición tiempo necesario para la proyección de imagen del aceptador en traste.
    5. Encontrar una célula expresando el sensor de la tensión con la localización clara de una estructura de interés y ajustar una imagen.
    6. Dibujar un ROI rectangular para destacar donde bleach y la ubicación de retorno de la inversión de la tienda. Iniciar el lapso de tiempo.
    7. Examinar el conjunto resultante de imágenes para posibles problemas.
      1. Si hay saltos sustanciales (más del 10% de intensidad inicial) en recuperación de fluorescencia entre marcos, reducir el paso del tiempo entre los fotogramas.
      2. Si hay una pérdida significativa global de fluorescencia con el tiempo (más de 5-10% de la intensidad inicial), reducir el número de imágenes tomadas blanqueador post o cambie los ajustes de imagen para reducir la exposición de la muestra a la luz.
      3. Si la recuperación de fluorescencia no ha tocado techo al finalizar el lapso de tiempo, aumente la longitud total de los time-lapse.
    8. Ajustar en consecuencia los parámetros Time-lapse y repita los pasos 4.2.5 – 4.2.7 hasta la recuperación de la fluorescencia se captura adecuadamente sin foto-daño global a la muestra.

5. adquirir datos de FRAP de traste

  1. Preparar la instalación de microscopía para la proyección de imagen de células vivas, preferiblemente con una platina calefactada y objetivo así como control de CO2 . Permita que se equilibre durante 20 minutos.
    1. Para garantizar la salud de las células imagen, mantener la temperatura a 37 ° C en la cámara de proyección de imagen. Uso una bomba peristáltica para pasar humidificada con 5% CO2 sobre la muestra de 15 mL/min para mantener el pH.
    2. Alternativamente, si control de CO2 no está disponible, utilizar medios de proyección de imagen vivo que contienen HEPES para impedir cambios en el pH grande.
  2. Abra la herramienta MDA y con traste de parámetros, incluyendo los sistemas de filtro diferente.
  3. Guardar este MDA en la carpeta experimental con el nombre de MDA_FRET_Date.
  4. Configurar otro MDA con FRAP parámetros, incluyendo los sistemas de filtro diferente, la configuración de Time-lapse y el diario de la proyección de imagen para el láser de pulso después de la adquisición de la lejía.
  5. Guardar este MDA en la carpeta experimental con el nombre de MDA_FRAP_Date. Cierre la ventana MDA.
  6. En la barra de herramientas en la parte superior de la pantalla, seleccione diario | Iniciar grabación.
  7. Abra la ventana MDA, cargar el estado de MDA_FRET_Date y adquisiciónde prensa. Luego cargar el estado de MDA_FRAP_Date y adquisiciónde prensa.
  8. Al final de la adquisición, en la barra de herramientas en la parte superior de la pantalla, seleccione diario | Detener la grabación.
  9. Guardar esta publicación en la carpeta experimental con el nombre de FRETFRAP_Date y añadir a una barra de herramientas de fácil acceso. Cierre la ventana MDA.
  10. Lugar una de las muestras generadas de las células expresando el sensor de la tensión en el soporte del microscopio para obtener imágenes. Permiten para equilibrar durante 10 minutos.
  11. Navegar por la muestra mediante la adquisición de la imagen en adquirir | Adquirir con exposición mínima de tiempo y filtran para identificar las células de interés.
  12. Sistema autofocus continuo navegando a dispositivos | Enfoque. Manualmente se centran en la muestra hasta alcanzar el plano de proyección de imagen correcto.
  13. Clic Sistema de enfoque continuo, espere a que el sistema de ajuste y Enfoque continuo empezar.
    Nota: Esto no es necesario, pero mejora significativamente la calidad de las curvas de recuperación FRAP porque impide que la muestra fuera de foco a la deriva.
  14. Encontrar una célula expresando el sensor de la tensión con la localización clara de una estructura de interés y ajustar una imagen.
  15. Dibujar un ROI rectangular para destacar donde bleach. Almacenar la ubicación de retorno de la inversión.
  16. Inicializar el diario FRETFRAP_Date , que se iniciará la adquisición de imágenes de traste seguido de la inicialización de la FRAP de Time-lapse.
  17. Repita los pasos 5.14 5.16 hasta se adquieren sistemas de imagen de 10-15.
    Nota: La medición no puede repetirse en la misma célula. Una vez que se produce el fotoblanqueo, datos de traste están poco confiables.

6. analizar los datos del FRAP de traste

  1. Analizar las imágenes de traste usando el software de elección.
    Nota: Hay varias formas de imagen y cuantificar traste61, incluyendo radiométrica traste62 y traste índice34,35. Sin embargo, es altamente recomendable utilizar las estimaciones de traste eficiencia55,63 para la interpretación de los datos de FRAP de traste. Vea la discusión para más exploración de este tema. Para emisión sensibilizado y cálculo de eficiencia de traste, software personalizado está disponible en el laboratorio Hoffman https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Cuantificar los parámetros relevantes de cada estructura subcelular que fue blanqueado. Esto debe incluir traste índice/eficiencia y promedio aceptor inicial intensidad media (proporcional a la concentración) pero también podría incluir parámetros físicos tales como el tamaño ROI.
  3. Analizar las imágenes FRAP usando el software de elección.
    Nota: Hay varias maneras de cuantificar FRAP26,27,28,29. Principales preocupaciones experimentales son contables para el blanqueo en lejía tras la proyección de imagen, cambios en la intensidad de fondo y desplazamiento de estructuras subcelulares altamente dinámicas, tales como adherencias focales. Blanquear las correcciones y variaciones en la iluminación de fondo puede realizarse a través del análisis de las regiones no blanqueada y no fluorescente de las imágenes. Estructuras subcelulares muy dinámicas, particularmente los dinámica excesiva de crecimiento o desmontaje son incompatibles con el estándar análisis FRAP y no deben ser analizados. Además, hay una gran variedad de formas de normalizar los datos. Los lineamientos proporcionados son para el análisis más simple.
  4. Corregir los datos de recuperación para el blanqueo con efectos y luego normalizar para blanquear las intensidades. Cuantificar el tiempo de recuperación y la fracción móvil según la siguiente ecuación28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    donde MF es la fracción móvil, Ro es la recuperación inicial, y k es la tasa de recuperación. El tiempo de la recuperación está determinado por:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Nota: Hay una gran variedad de paquetes de software disponibles al público para completar estos análisis64 , así como una variedad de plugins ImageJ. Software personalizado está disponible en el laboratorio Hoffman https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Puede usarse más análisis para las situaciones donde la difusión afecta a la dinámica de la proteína de interés, a múltiples escalas de tiempo son evidentes en la recuperación, o se utilizan geometrías de blanqueo no estándar.

7. interpretar datos de FRAP de traste

  1. Compilar la información pertinente de cada retorno de la inversión incluyendo: traste índice/eficiencia, intensidad del aceptador, FRAP medio tiempo, fracción móvil FRAP.
    Nota: Índice de traste o la eficiencia se utiliza para determinar la carga media a través de la proteína en el ROI. Intensidad de aceptador mide la concentración local de la proteína. El tiempo medio de recuperación es una medida de la dinámica de la proteína. Un tiempo más pequeño indica la rotación más rápida. Fracción móvil FRAP mide la cantidad de proteína en el retorno de la inversión que se está convirtiendo activamente sobre. Una mayor fracción móvil indica que es entregar un mayor porcentaje de la proteína en el ROI.
  2. Para probar el efecto de la concentración local del índice de rotación de la proteína y la cantidad, parcela FRAP fracción de medio tiempo y móvil contra intensidad de aceptor inicial.
  3. Para probar el efecto de la carga de proteína en el índice de rotación de proteínas y cantidad, parcela FRAP fracción de medio tiempo y móvil contra el traste índice/eficiencia.
    Nota: Dependiendo de la proteína o la estructura, puede también ser interesante examinar efectos de parámetros físicos, como el tamaño de la estructura o excentricidad, sobre carga de proteína o facturación.

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Resultados

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TRASTE-FRAP se compone de la combinación de dos técnicas fluorescentes, FRET y FRAP. Como nos hemos centrado en los efectos de la carga de la proteína, se utilizaron sensores de tensión basados en FRET34,46. Estos sensores se basan a menudo en una tensión detección módulo que consiste en dos proteínas fluorescentes, tales como mTFP1 y VenusA206K, conectados por un enlazador flagelliform (figura 1A). C...

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Discusión

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El método FRAP traste permite la medida directa de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza, una propiedad que ha sido difícil de sonda directamente dentro de las células vivas. La sensibilidad de la dinámica de la proteína a carga molecular es fundamental para la función de la proteína como una fuerza transmisor o transductor. Carga se requiere para la transmisión de ambos generados internamente y las fuerzas aplicadas externamente, había llamado mechanotransmission y para la conversión de esas fuerzas en señales...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por un premio de la carrera de la Fundación Nacional de ciencia (NSF-CMMI-14-54257) así como de becas de la Asociación Americana del corazón (16GRNT30930019) y los institutos nacionales de salud (R01GM121739-01) otorgado al Dr. Brenton Hoffman y nacional Ciencia Fundación graduados beca de investigación otorgada a Katheryn Rothenberg. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NSF o NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.05% Tripsina-EDTAThermo Fisher 25300062
16% ParaformaldehídoCiencias de la Microscopía Electrónica30525-89-4
60x Objetivo NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Solución Antibiótica-Antimicótica (100x)Gibco15240-062
Etapa Automatizada PrevioH117EIX3Científico
Espejo dicroico personalizadoChroma Technology CorpT450/514rpc
Filtro de emisión mTFP1 personalizado ChromaTechnology CorpET485/20m
Filtro de excitación mTFP1 personalizadoChroma Technology CorpET450/30x
Filtro de excitación Venus personalizadoChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Medio de visualización de células vivasZafiroMC102
Dulbecco's Modificado Águila Mediana Sigma AldrichD5796con L-glutamina y bicarbonato de sodio
Suero fetal bovinoHyCloneSH30396.03
Fibronectina, Corning humano47743-654calibración
FRAPPAAndorprovisto junto con la unidad FRAPPA
Andor515 nm
Placas fluorescentes con fondo de vidrioWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CélulasATCCCRL-3216
Bromuro de hexadimetrina, PolybreneSigma AldrichH9268-5G
Alto contenido en glucosa Medio de águila modificado de DulbeccoSigma AldrichD6429
Microscopio fluorescente invertidoOlympusIX83
JMP Pro SoftwareSAS
Lambda 10-3 Ruedas de filtro motorizadasSutter InstrumentsLB10-NW
LambdaLS Lámpara de arco con bombilla de xenón sin ozono de 300 WSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
MATLAB SoftwareMathworks
MEM Aminoácidos no esencialesThermo Fisher11140050
MetaMorph para OlympusSistema
Bioptechs130708
MoFlo Astrios EQ Clasificador de célulasBeckman CoulterB25982
Medio de calentamiento de objetivosBioptechs150819-13
OptiMEMThermo Fisher31985070
Solución salina tamponada con fosfatoSigma AldrichD8537
pMD2.G Plásmido de envolturaAddgene12259
pRRL Vectorregalo del Dr. Kam Leong (Universidad de Columbia)
psPax2 Empaquetado PlásmidoAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 CámaraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Centrífuga Sorvall Legend XT/XFThermo Fisher75004505
Calentador de etapa ZBioptechs403-1926
Venus Filtro de emisiónSemrockFF01-571/72
Diapositiva de Sistema FRAPPA con láser de de microhumidificación Olympus estable

Referencias

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