Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Resumen

Las células detectar y responden a las señales físicas en su entorno mediante la conversión de estímulos mecánicos en señales detectables bioquímicamente en un proceso llamado mecanotransducción. Un paso crucial en la mecanotransducción es la transmisión de fuerzas entre los entornos internos y externos. Para transmitir las fuerzas, debe existir un vínculo físico sostenido, intacto creado por una serie de interacciones proteína-proteína. Una interacción de proteína-proteína dada, carga mecánica no puede tener ningún efecto en la interacción, conducen a la rápida disociación de la interacción, o incluso estabiliza la interacción. Entender cómo molecular carga dicta volumen de proteína en las células vivas puede proporcionar información valiosa sobre el estado mecánico de una proteína, a su vez dilucidar su papel en la mecanotransducción. Técnicas existentes para medir la dinámica de la proteína sensible a la fuerza o falta de mediciones directas de la carga de proteína o confían en las mediciones realizadas fuera del contexto celular. Aquí, describimos un protocolo para la recuperación de fluorescencia de transferencia de Förster Resonancia energética después de photobleaching (FRAP traste) técnica, que permite la medición de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza dentro de las células vivas. Esta técnica es potencialmente aplicable a cualquier sensor de tensión basado en el traste, facilita el estudio de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza en variedad de estructuras subcelulares y en diferentes tipos celulares.

Introducción

El medio extracelular es una fuente rica de estímulos bioquímicos y físicos que determinan el comportamiento celular. En particular, la naturaleza física del microambiente puede mediar claves funciones celulares, incluyendo el crecimiento celular, migración y diferenciación^1,2,3,4. Dysregulation de la mecánica del microambiente es un componente crítico para muchas enfermedades que aún no tienen tratamientos adecuados, tales como cáncer⁵, ateroesclerosis⁶y fibrosis⁷. Una ....

Protocolo

1. generar muestras para la proyección de imagen

1. Construcción de sensor de tensión estable expresa en tipo celular deseado.
   1. Clon de tensión sensor construcción pRRL vector o otros plásmidos de expresión viral.
      Nota: Varias herramientas de clonación moleculares diferentes están disponibles para lograr este paso incluyendo el uso de enzimas de restricción, extensión e Gibson Asamblea³⁵. El vector pRRL se utiliza en la transducción viral lenti y permite un alto grado de producción de la proteína mediante el uso del promotor de citomegalovirus humano (CMV). Diferentes vectores pueden ser necesaria para un contexto particular. P....

Resultados

TRASTE-FRAP se compone de la combinación de dos técnicas fluorescentes, FRET y FRAP. Como nos hemos centrado en los efectos de la carga de la proteína, se utilizaron sensores de tensión basados en FRET^34,46. Estos sensores se basan a menudo en una tensión detección módulo que consiste en dos proteínas fluorescentes, tales como mTFP1 y VenusA206K, conectados por un enlazador flagelliform (figura 1A). C.......

Discusión

El método FRAP traste permite la medida directa de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza, una propiedad que ha sido difícil de sonda directamente dentro de las células vivas. La sensibilidad de la dinámica de la proteína a carga molecular es fundamental para la función de la proteína como una fuerza transmisor o transductor. Carga se requiere para la transmisión de ambos generados internamente y las fuerzas aplicadas externamente, había llamado mechanotransmission y para la conversión de esas fuerzas en señales.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Tripsina-EDTA	Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehído	Ciencias de la Microscopía Electrónica	30525-89-4
60x Objetivo NA1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
Solución Antibiótica-Antimicótica (100x)	Gibco	15240-062
Etapa Automatizada Previo	H117EIX3		Científico
Espejo dicroico personalizado	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
Filtro de emisión mTFP1 personalizado Chroma	Technology Corp		ET485/20m
Filtro de excitación mTFP1 personalizado	Chroma Technology Corp		ET450/30x
Filtro de excitación Venus personalizado	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp Medio de visualización de células vivas	Zafiro	MC102
Dulbecco's Modificado Águila Mediana	Sigma Aldrich	D5796	con L-glutamina y bicarbonato de sodio
Suero fetal bovino	HyClone	SH30396.03
Fibronectina, Corning humano	47743-654		calibración
FRAPPA	Andor		provisto junto con la unidad FRAPPA
Andor			515 nm
Placas fluorescentes con fondo de vidrio	World Precision Instruments	FD35
HEK293-T Células	ATCC	CRL-3216
Bromuro de hexadimetrina, Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
Alto contenido en glucosa Medio de águila modificado de Dulbecco	Sigma Aldrich	D6429
Microscopio fluorescente invertido	Olympus	IX83
JMP Pro Software	SAS
Lambda 10-3 Ruedas de filtro motorizadas	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS Lámpara de arco con bombilla de xenón sin ozono de 300 W	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB Software	Mathworks
MEM Aminoácidos no esenciales	Thermo Fisher	11140050
MetaMorph para Olympus	Sistema
	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ Clasificador de células	Beckman Coulter	B25982
Medio de calentamiento de objetivos	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	Thermo Fisher	31985070
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G Plásmido de envoltura	Addgene	12259
pRRL Vector			regalo del Dr. Kam Leong (Universidad de Columbia)
psPax2 Empaquetado Plásmido	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Cámara	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Centrífuga Sorvall Legend XT/XF	Thermo Fisher	75004505
Calentador de etapa Z	Bioptechs	403-1926
Venus Filtro de emisión	Semrock	FF01-571/72