Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.
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Methodenartikel
Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Rezidiv wurde lange von Onkologen untersucht, während die zugrunde liegenden Mechanismen unklar bleiben. Vor kurzem fanden wir und andere, dass ein Phänomen namens Apoptose Umkehr zu erhöhten Tumorigenität in verschiedenen Zellmodellen unter verschiedene Reize führt. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Verfolgung dieser Prozess in vitro und in vivo; ist aber noch die Isolierung der echten umgekehrte Zellen erreicht werden, welche Grenzen unser Verständnis über die Folgen der Apoptose Umkehr. Hier nutzen wir einen Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff Label Zellen mit aktivierte Caspasen nach Induktion der Apoptose. Zellen mit positiven Signalen werden weiter durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) zur Verwertung aussortiert. Morphologische Untersuchung unter konfokalen Mikroskopie hilft den apoptotischen stand vor FACS bestätigen. Eine Zunahme der Tumorigenität kann oft die Höhe des Anteils der Krebsstammzellen (CSC) zugeschrieben werden-wie Zellen. Auch wäre angesichts die Heterogenität der Brustkrebs, Identifizierung des Ursprungs dieser CSC-ähnliche Zellen entscheidend für die Behandlung von Krebs. So bereiten wir nicht Stamm Brustkrebszellen vor Apoptose auslösen, Caspase-aktivierten Zellen zu isolieren und die Apoptose Umkehrung Verfahren durchführen. Flow-Zytometrie-Analyse zeigt, dass die CSC-wie Brustzellen wieder erscheinen im Bereich "umgekehrte" darauf hinweist, dass die CSC-wie Brustzellen von Brustkrebszellen-Stamm während der Apoptose Umkehr gereist sind. Zusammenfassend lässt sich sagen enthält dieses Protokoll die Isolierung von apoptotischen Brustkrebszellen und Erkennung von Veränderungen in CSC Prozentsatz in umgekehrter Zellen durch Durchflusszytometrie.
Einleitung
Krebs ist eine führende Ursache des Todes, verursacht schwere Last zu Ländern weltweit1gewesen. Brustkrebs zählt bei weiblichen Patienten unter allen Arten von Krebs1hoch, sowohl in Bezug auf die Inzidenz und Mortalität. Aufgrund der Heterogenität Krebs ist eine Kombination von Medikamenten in der Regel in der Chemotherapie verwendet, um Krebs Zelle Tod2,3,4zu erreichen. Jedoch da gemeinsame Chemotherapeutika oft DNA-5,6 Ziel, betroffen Synthese7<....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Brust nicht-Stamm Krebszellen
- Kultur MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen in 10 mL Phenol Rotfrei-Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) in einer 100 mm Schale ergänzt. Kultur T47D in 10 mL Phenol Rotfrei RPMI 1640 Medium ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, Hitze-inaktivierten 10 % FBS und 1 % V/V Penicillin-Streptomycin (PS) in einer 100 mm Schale. Zellkulturen bei 37 ° C in einem 5 % CO295 % Luft Zelle Kultur Inkubator.
Hinweis: Phenol-rot wirkt Fluoreszenz-basierte Erkennung jedoch auch einen potenzielle Einfluss auf das Wachstum von Bru....
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Ergebnisse
Um den Übergang von der Brust nicht-Krebszellen zu CSC-wie Brustzellen, eine erste Sortierung der CD44 Stiel zu beobachten–/CD24+ Brustkrebs-Zellen wurden benötigt. Seit die MCF-7-Zell-Linie, die etwa 0,15 % Zellen mit CSC-Marker in der ursprünglichen Bevölkerung (Abbildung 1), dieser Schritt unterstützt CSC Bereicherung während der Apoptose Umkehr auszuschließen. Im Gegenteil, gäbe es keine Zellen mit CSC-Marker in der ursprünglichen Be.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt eine direkte und klare Weise zur Erkennung von den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen in Brust CSC-ähnliche Zellen infolge Apoptose Umkehr. Bestätigung der CSC Eigenschaften dieser umgekehrte Zellen könnte gefördert werden, mit der ichn Vitro Mammosphere Bildung Assay und in Vivo Xenograft-Transplantation in immungeschwächte Mäuse18,24,26 ,27
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Innovative Technologie der Innovation Technologie Kassenkommission: Finanzierung Unterstützung durch den Staat Schlüssel Labor der Agrobiotechnologie (CUHK), Lo Qixi-Seong Biomedical Research Fund und Lee Hysan Foundation. Y.X. wurde von der postgradualen Zugehörigkeit aus der CUHK unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagenz0,05 | |||
| % Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0,25 % Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 Annexin V Konjugat | Invitrogen | A35109 | |
| Rinderserumalbumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 & middot; 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent Caspase-3/7 grüner Fluoreszenzfarbstoff | Invitrogen | C10423 | |
| Dimethylsulfoxid | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc-Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fötales Rinderserum | Invitrogen | 16000044 | hitzeinaktiviertes |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoklonale Antikörper gegen humanes CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Klon:ML5 Los:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoklonale Antikörper gegen humanes CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Klon:G44-26 Los:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Maus IgG2a, κ Isotypkontrolle | BD Biosciences | 554648 | Klon: G155-178 (RUO) RRID: AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5, Maus IgG2b, & kappa; Isotypkontrolle | BD Biosciences | 558304 | Klon: 27-35 RRID: AB_647257 |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| Propidiumiodid | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium | Invitrogen | 11835055 | phenolrotfreies |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Staurosporin | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm Kulturschale | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-Well-Gewebekulturplatten | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40 μ m Nylonnetz | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 konfokales Mikroskop | Olympus | IX81 | 60X Objektiv |
| FV10-ASW Viewer-Software Ver.4.2b | Olympus-Polystyrol | ||
| mit rundem Boden 12 &mal; 75 mm Röhrchen | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e Sortierer | Bio-Rad | 1451006 |
Referenzen
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
