Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.
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Methodenartikel
Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Erfolgreich den Krebs-Immuntherapie hat das Potenzial, langfristige Tumorkontrolle zu erreichen. Trotz der jüngsten klinischen Erfolge bleibt ein dringender Bedarf an sicheren und wirksamen Therapien auf individuellen Tumor immun Profile zugeschnitten. Onkolytische Viren ermöglichen die Induktion von Anti-Tumor-Immunantwort sowie Tumor beschränkt Genexpression. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Ex Vivo-Analyse der immunmodulatorische onkolytische Vektoren. Fokussierung auf Masern-Impfstoff Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel, kann die allgemeine Methodik zu anderen Virus-Arten und transgene angepasst werden. Die dargestellte Workflow umfasst Design, Klonen, Rettung und Verbreitung von rekombinanten Viren. Assays zur Replikation Kinetik und lytische Aktivität des Vektors sowie Funktionalität des isolierten Immunmodulator ex Vivo Analyse enthalten sind, und erleichtert so die Generation der neuen Agenten für die weitere Entwicklung in präklinischen Modellen und letztlich klinische Übersetzung.
Einleitung
Onkolytische Viren (OVs) entstehen als Anti-Krebs-Therapeutika, die speziell in replizieren und Tumorzellen zu töten, wobei gesundes Gewebe intakt bleibt. Es ist mittlerweile gemeinsamen Verständnis, dass onkolytische Virotherapie (OVT), in den meisten Fällen, verlässt sich nicht allein auf komplette Tumor-lyse durch effiziente Replikation und die Verbreitung des Virus, aber erfordert zusätzlichen Wirkmechanismen Behandlungserfolg, einschließlich vaskuläre und Stromazellen targeting und allem Immunstimulation1,2,3,4. Während viele OV Frühstu....
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Protokoll
Hinweis: [O], [P] und [M] Unterabschnitte für anzugeben: OVs im Allgemeinen, (die meisten) Paramyxoviruses oder MV nur, beziehungsweise. [B] zeigt Abschnitte speziell für BTE transgene.
1 Klonen von transgenen Immunmodulator Codierung in Masern-Virus-Vektoren
-
[O] Design einfügen Sequenz.
- [O] entscheiden Sie sich für ein Immunmodulator Interesse basierend auf Literaturrecherchen oder explorative Daten wie genetische Bildschirme41 und ableiten die relevanten cDNA-Sequenz aus entsprechenden Datenbanken wie GenBank, die europäischen Nukleotid-Archiv oder die internat....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt den Wirkmechanismus von onkolytische Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers. Ein Flussdiagramm Darstellung des Workflows dieses Protokolls wird in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines modifizierten onkolytische Masern-Virus Genoms. Dies bietet eine visuelle Darstellung der spezifischen Änderungen auf die Masern Virus Anti-Geno.......
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Diskussion
Onkolytische Immuntherapie (dh., OVT in Kombination mit Immunmodulation) hält große Verheißung für die Krebsbehandlung, anspruchsvolle weitere Entwicklung und Optimierung von onkolytische Viren immunmodulatorische Proteine codieren. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum generieren und validieren diese Vektoren für die spätere Prüfung in relevanten präklinischen Modellen und potenzielle zukünftige klinische Übersetzung in neuer Anti-Krebs-Therapeutika.
Zahlreiche verschiedene onkoly.......
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Offenlegungen
C.e. Engeland wird als Miterfinder der ein patent über RNA-Viren für Krebs Immunovirotherapy im Besitz von Universität Heidelberg aufgeführt. J.P.W. Heidbuechel hat nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Methoden wurden in der Virotherapie Gruppe unter der Leitung von Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts im nationalen Zentrum für Tumorerkrankungen in Heidelberg gegründet. Wir sind verpflichtet, ihm und allen Mitgliedern des Labor-Teams, vor allem Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler und Jessica Albert. Diese Arbeit wurde von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung unterstützt (Grant 2015_A78, C.E. Engeland) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, C.E. Engeland EN 1119/2-1 gewähren). J.P.W. Heidbuechel erhält ein Stipendium in Höhe von Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Deutschland | 4898117001 | |
| CloneJET PCR Klonierungskit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland | A9539-500G | |
| QIAquick Gel Extraktionskit | QIAGEN, Hilden, Deutschland | 28704 | |
| NEB 10-beta Kompetent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Deutschland | C3019I | |
| LB Medium nach Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland | X964.1 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland | HP62.1 | |
| QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Deutschland | 27104 | |
| Restriktionsenzym HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Deutschland | R3104S | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Deutschland | 31966-021 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Biosera, Boussens, Frankreich | FB-1280/500 | |
| FugeneHD | Promega, Mannheim, Deutschland | E2311 | kann durch das Transfektionsreagenz der Wahl |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland | ersetzt werdenK0129 | |
| Vero Zellen | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
| B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | auf Anfrage | |
| erhältlich Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Deutschland | ACC 342 | |
| Opti-MEM (serumfreies Medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Deutschland | 31985070 | |
| Kolorimetrische Zelle Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Deutschland | PK-CA20-300-1000 | enthält XTT-Reagenz |
| Dulbecco's Phosphat-Buffered Kochsalzlösung (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Deutschland | 14190-094 | |
| QIAquick Ni-NTA Spin Säulen | QIAGEN, Hilden, Deutschland | 31014 | |
| Natriumchlorid | Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland | 3957.3 | |
| Imidazol | Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Deutschland | UFC901024 | |
| BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
| IgG aus humanem Serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland | I4506 | |
| Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
| Maus IgG1, Kappa Isotyp Kontrolle, Phycoerythrin konjugiert, Klon MOPC-21 Antikörper | BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland | 555749 | RRID: AB_396091 |
| Anti-HA-Biotin Antikörper, Klon 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland | 130-090-485 | |
| MS Säulen | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland | 130-042-201 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland | 130-042-303 | |
| RIPA Puffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
| CytoTox 96 Nicht-radioaktiver Zytotoxizitäts-Assay | Promega, Mannheim, Deutschland | G1780 | beinhaltet 10x Lyselösung, Substratlösung (Substratmischung und Assay-Puffer) und Stopplösung |
| Zellheber | Corning, Reynosa, Mexiko | 3008 | |
| 10-cm-Schalen | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
| 15-cm-Schalen | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland | 639160 | |
| 96-Well-Platten, U-Boden | TPP, Trasadingen, Schweiz | 92097 | |
| 96-Well-Platten mit flachem | Boden Neolab, Heidelberg, Deutschland | 353072 | |
| 6-Well-Platten | Neolab, Heidelberg, Deutschland | 353046 | |
| 12-Well-Platten | Neolab, Heidelberg, Deutschland | 353043 | |
| 50-ml-Röhrchen | nerbe plus, Winsen/Luhe, Deutschland | 02-572-3001 | |
| T175 Zellkulturflaschen | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
| 0,22 &Mikro; m filters | Merck, Darmstadt, Deutschland | SLGPM33RS |
Referenzen
- Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
- Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of....
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Nachdrucke und Genehmigungen
