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Methodenartikel

Verhaltens Bewertungen der spontanen Fortbewegung in einem murinen MPTP-induzierten Parkinson-Erkrankung-Modell

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DOI:

10.3791/58653

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7. Januar 2019

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1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, College of Life Science, Nankai University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Einrichtung von einem Mausmodell für Parkinson-Erkrankung mit MPTP und Verhaltensstörungen Bewertungen mit Zylinder und Freiland-Tests zur Messung der motorischen Funktion beschrieben. Wir verwenden dann l-Dopa als ein Beispiel zeigen, wie man dieses Modell in der Studie von PD Arzneimittel anwenden.

Zusammenfassung

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige Neurodegenerative Erkrankung Erkrankung, verursacht das Phänomen von Zittern, Steifheit, Langsamkeit der Bewegung und Demenz. 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) kann zu einige Parkinson-ähnlichen Symptomen führen, durch die Zerstörung von dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra des Gehirns. So wurde es zur PD-Modelle in verschiedenen tierexperimentellen Studien zu etablieren. Hier werden Mäuse MPTP Injektionen (20 mg/kg/Tag) für sieben Tage und die verhaltensbezogene Tests werden am achten Tag durchgeführt. Dieses Modell wird in der Studie von PD effizient angepasst. Die Verhaltensstörungen Tests hier gehören die Zylinder-Test und der Freiland-Test. Das Zylinder-Experiment wird verwendet, um die Tiere Fähigkeit, heben Sie ihre Vorderpfoten, wenn Sie in einer anderen Umgebung setzen zu erkennen. Als der PD-Mäusen zeigen wölbte — die Maus wölbt den Rücken – die Anzahl der Pfote Liftings Abnahme. Dieser Test ist einfach auszuführen. Die Freiland-Test wird verwendet, um den Betrag der Zeit verbringen die Mäuse über das laufen, gehen und bleiben unbeweglich zu erkennen. Wir analysieren Bewegungen der Tiere im Freiland mit Software und Daten erhalten. Schließlich verwenden wir l-Dopa, einer der am meisten gebräuchlich PD Drogen, als ein Beispiel zeigen, wie man dieses Modell für die Untersuchung von PD Medikamente anwenden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MPTP Neurotoxizität motorischen Defizit induziert, die durch l-Dopa abgemildert werden können.

Einleitung

Parkinson-Krankheit (PD), eine der häufigsten Erkrankungen bei älteren Menschen, ist eine langfristige Neurodegenerative Erkrankung1. Patienten zeigen immer das Phänomen der Zittern, Steifheit, Langsamkeit der Bewegung und Demenz, die im Laufe der Zeit2verschlechtern. Andere Symptome, einschließlich der sensorischen, sind Schlaf und emotionale Probleme auch allgemein2beobachtet. Die Ursache von Morbus Parkinson ist noch unklar, aber es wird allgemein angenommen, genetische und umweltbedingten Faktoren einzubeziehen, Verlust der dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra3und Entwicklung von Lewy-Körper und Lewy Neuriten in verschiedenen Regionen veranlassen die Gehirn4.

Unter den Studien der PD ist 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 weit in einige PD Symptome in experimentellen Modellen neu angepasst. Im Jahr 1984 Langston Et Al. zuerst gefunden, dass Injektionen von MPTP in Totenkopfäffchen Parkinsonismus6geführt. Obwohl das MPTP Nagetiere Modell nicht das Vorhandensein von Lewy-Körper, das Biomarker des PD ist zeigt, verursacht MPTP Parkinson-ähnliche Symptome durch die Zerstörung von dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra des Gehirns7. Im Vergleich zu anderen Drogen-Modell für PD wie induziert durch 6-Hydroxydopamine (6-OHDA)8 und 1-Methyl-4-Phenylpyridinium (MPP +)9, Injektion von MPTP ist einfach auszuführen und das MPTP-Modell nimmt weniger Zeit. Mäuse erhalten MPTP Injektionen (20-30 mg/kg/Tag) für sieben Tage und die verhaltensbezogene Tests auf dem achten Tag10durchgeführt werden.

Die Freiland-Test11 wurde zuerst von Calvin S. Hall, einer amerikanischen12entwickelt. In verschiedenen Studien untersuchen wir verschiedene Arten von Verhaltensweisen. In der Forschung die auf Parkinson Erkrankungen konzentriert, Verhaltensweisen wie Fortbewegung Aktivitäten und die Geschwindigkeit der Fortbewegung werden getestet, um festzustellen, ob das Tier bewegen beeinträchtigt ist. Im Vergleich mit anderen Methoden verwendet, um die Einrichtung von PD Tieren testen, Freiland Test ist einfach durchzuführen, weil die benötigte Ausrüstung einfach ist, und Prototyping und Daten-Analyse-Software (z.B. MATLAB, Excel) lässt sich leicht sammeln und grafische Darstellung der Daten. Der Variationskoeffizient ist auch relativ kleine13, was bedeutet, dass das Ergebnis der Freiland-Test zuverlässig ist. Ein weiterer Vorteil gegenüber anderen Methoden ist, dass die Verhaltensweisen, die in diesem Experiment enthalten leicht zu unterscheiden sind; die Mäuse kann entweder laufen, Walken oder still zu stehen. In der Regel kann der Freiland-Test auf Nagetiere verwendet werden, wenn der Forscher braucht, um das Thema Mobilität zu bewerten.

Die Zylinder-Test nennt man auch den Test der asymmetrischen Nutzung der Vorderbeine. Wenn dieser Test zuerst entwickelt wurde, diente es den asymmetrischen Einsatz der Ratte Vorderbeine14zu testen. Hier verwenden wir diesen Test zur Analyse des Tieres Fähigkeit zum ausstrecken und benutze beide seine Vorderbeine um neue Umgebung zu erkunden. Wenn der Substantia Nigra und Corpus Striatum von MPTP im Gehirn beschädigt sind, wird das Tier neigt dazu, den Rücken zu wölben und wird seltener ausstrecken und die unbekannte Umgebung zu erkunden. Dieser Test ist einfach durchzuführen und ein vorläufiges Ergebnis geben kann. Dieser Test hat jedoch hohe interne Variabilität, so ist es in der Regel mit zusammen mit anderen Verhalten Experimente verwendet.

Einnahme von l-Dopa, die auch bekannt als Levodopa oder L-3,4-Dihydroxyphenylalanine ist, ist eine gängige Methode, Parkinson-Erkrankung zu behandeln, da eine Ursache von Morbus Parkinson der Rückgang von Dopamin in ist der. L-Dopa ist die Vorstufe zum Dopamin. Aber im Gegensatz zu Dopamin, kann es die Blut - Hirn-Schranke, was bedeutet, dass es bei Erhöhung der Konzentration von Dopamin im Gehirnbereich effizienter zu überqueren. Nachdem es die Blut - Hirn-Schranke kreuzt, wird durch L-amino Acid Decarboxylase15l-Dopa in Dopamin umgewandelt.

Hier beschreiben wir die Messung und Analyse der motorischen Funktion im MPTP-induzierte-PD-Mäusen mit einem Zylinder Test14 und eine modifizierte Freiland-Test. Wir verwalten l-Dopa als ein Beispiel zeigen, wie man dieses Modell in der Studie von PD Arzneimittel anwenden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MPTP motorischen Defizit induziert, die durch l-Dopa entschärft werden können.

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Protokoll

Diese Studie wurde nach den internationalen, nationalen und institutionellen Regeln unter Berücksichtigung Tierversuche durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde von den tierischen Ethik-Kommission der Nankai-Universität zugelassen.

1. MPTP und l-Dopa-Verwaltung

Hinweis: Die zehn Wochen alten weibliche BALB/c Mäusen wurden durch das Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt. Mäuse waren untergebracht sechs pro Käfig unter einem 12 h hell/dunkel-Zyklus (Leuchten bei 08:00-20:00), eine konstante Temperatur von 21-22 ° C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 5 %. Alle Tiere erhielten autoklaviert standard Mäuse Chow von der gleichen Formulierung und Wasser Ad Libitum .

  1. Teilen Sie nach einer Woche der Akklimatisation sich die Tiere in drei Gruppen von sechs Mäusen.
  2. Zur Gruppe 1 verwalten intraperitoneale Injektionen (siehe Punkt 1.5) von 250 µL/Maus/Tag der Saline von Tag 1 bis Tag 7 und führen Sie dann eines-Verwaltung (siehe Schritt 1.6) 250 µL/Maus von Kochsalzlösung am 8. Tag.
  3. Gruppe 2, verwalten intraperitoneale Injektion von 20 mg/kg/Tag von MPTP jeden Tag von Tag 1 bis Tag 7 und führen Sie dann eines-Verwaltung von 250 µL/Maus von Kochsalzlösung am 8. Tag.
  4. Gruppe 3, verwalten intraperitoneale Injektion von 20 mg/kg/Tag von MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und führen Sie dann eines-Applikation von 5 mg/kg von l-Dopa am 8. Tag.
  5. Führen Sie folgendermaßen die intraperitoneale Injektion.
    1. Laden Sie das Medikament in eine sterile 1 mL Spritze mit einer Nadel 26 G. Entfernen Sie Luft aus der Spritze.
    2. SCRUFF die Maus mit dem Bauch nach oben. Halten Sie den Kopf, Hals und Körper der Maus in einer geraden Linie sowie mit dem Kopf fixiert.
    3. Winkel der Nadel, das Peritoneum zu durchdringen. Schieben Sie die Nadel für eine ordnungsgemäße Entfernung bis gibt es wenig Widerstand, und dann injizieren Sie das Medikament. Ziehen Sie die Nadel reibungslos.
  6. Führen Sie die eines-Verwaltung wie folgt.
    1. Bereiten Sie das Medikament in einer sterilen 1 mL Spritze mit einer Oral-Magensonde-Nadel. Entfernen Sie Luft aus der Spritze.
    2. Halten Sie die Maus mit dem Bauch nach oben. Halten Sie den Kopf, Hals und Körper der Maus in einer geraden Linie mit dem Kopf fixiert.
    3. Halten Sie die Nadel parallel zum Körper der Maus, und aus die Maus Mundwinkel, die Zunge drücken und schieben nach innen gegen den Oberkiefer einfügen.
    4. Mit wenig Widerstand, was zeigt, dass die Nadel ist die Eingabe der Speiseröhre reibungslos, drücken Sie vorsichtig die Nadel in der entsprechenden Entfernung. Bevor die Spitze der Nadel den Unterteil der Brust erreicht, die Medikamente zu injizieren.
    5. Ziehen Sie die Nadel reibungslos.

2. Zylinder-test

Hinweis: Die verhaltensbasierte Tests wurden am 8. Tag durchgeführt. L-Dopa injiziert wurde, die dritte Gruppe von Mäusen 40 min vor den Verhaltensstörungen Tests. Geschieht die Verhaltensstörungen Prüfung nicht im selben Raum wo die Tiere untergebracht sind, müssen Tiere in den neuen Raum für 30-60 Minuten vor dem Test eingewöhnt werden.

  1. Führen Sie den Test 24 h nach der letzten Dosis von MPTP.
  2. Legen Sie einen transparente Glaszylinder (Höhe = 19,5 cm, Durchmesser = 15 cm, Gewicht ≥1 kg) in der Mitte des Tisches. Umgeben Sie den Zylinder auf drei Seiten mit schwarzem Karton, die Wirkung der Umgebungslicht zu reduzieren. Lassen Sie eine Seite des Zylinders vor der Kamera für video-Aufnahme.
    Hinweis: Der Abstand zwischen der Pappe und der Zylinder sollte etwa 4 bis 8 cm.
  3. Befestigen Sie eine Kamera (> 1 Million Pixel Auflösung) bei ~ 40-60 cm Abstand des Zylinders um sicherzustellen, dass der volle Zylinder sichtbar ist.
    Hinweis: Dies ist weder zu weit noch zu nah um die Maus nicht zu stören, während der Videoaufnahme ihrer Bewegung.
  4. Eine Maus in den Zylinder zu einem Zeitpunkt und beginnen Sie auf einmal Dreharbeiten. Nach 3 min Dreharbeiten zu stoppen.
    Hinweis: Während dieses Vorgangs versuchen, um Lärm zu vermeiden oder leichte Änderungen in der Reihenfolge vermeiden, die Maus Verhalten zu beeinflussen.
  5. Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in der Heimat Käfig nach der Prüfung.
  6. Reinigen Sie den Zylinder mit Wasser und dann sprühen Sie 70 % V/V Ethanol über die innere Mauer, um es zu desinfizieren und Maus Düfte zu entfernen. Wischen Sie den Zylinder trocken, bevor eine andere Maus in gelegt wird.
  7. Spielen Sie das Video mit einer Rate von 0,5 x die normale Geschwindigkeit und die Anzahl der Pfote Aufzüge gegen die Wand des jede Maus.
    Hinweis: Pfote Aufzüge auftreten, wenn die Maus sich auf seine Hinterbeine erhebt hebt beide Arme über Schulterhöhe und Ländereien. Ein Vorderbein Aufzug wird nicht gezählt. In der Regel wirft eine Maus seine Vorderbeine der Zylinderwand zu berühren. Wenn die Maus seine Vorderbeine über Schulterhöhe mehrmals kontinuierlich ohne Landung erhöht, sollte es nur als einmal gezählt werden.

3. offene Feldtest

  1. Durchführen Sie die Freiland-Test 24 h nach der Verabreichung von MPTP.
    Hinweis: Es kann gleichzeitig die Zylinder-Test durchgeführt werden.
  2. Bereiten Sie eine transparente offene Feld Reaktion (45 cm L x 45 cm W x 25 cm H) mit einer Holzplatte Abdeckung an der Unterseite mit einem schwarzen Tuch. Eine Kamera zu beheben (> 1 Million Pixel Auflösung) über das Feld in einer Höhe von 1 m.
    Hinweis: Die Farbe der Freiland-Box unten sollte sich von den getesteten Maus darauf Farbkontrast im Video.
  3. Stellen Sie die Kamera um sicherzustellen, dass die Freiland-Reaktion-Box direkt in der Mitte des Videos ist.
  4. Eine Test-Maus in das Feld ein, und lassen Sie die Maus selbst vertraut machen, die Umwelt für ca. 1 min.
  5. Rekord eine 5 min. Video mit der Kamera an den Computer angeschlossen.
  6. Analysieren Sie das Video mit Software-Tools (z. B. MATLAB), um die Bewegung Spur Figur, die Verteilung von statischen zu bekommen (Geschwindigkeit < 1 cm/s), walking (Geschwindigkeit 1-20 cm/s) und laufen (Geschwindigkeit > 20 cm/s) Zeit, die Total reiste Abstand und Durchschnitt Geschwindigkeit der einzelnen getesteten Maus.
    Hinweis: Wenn Sie das Video analysieren, verfolgen wir den ganzen Körper der Maus. Die durchschnittliche Geschwindigkeit eines Körpers bedeutet die Gesamtlänge des Pfads bedeckt, geteilt durch die verstrichene Zeit. Daher, wenn eine Maus nicht bewegt wird, würde seine momentane Geschwindigkeit als Null betrachtet werden.
  7. Bereinigen Sie jedem Kot im offenen Feld Reaktion. Sprühen Sie 70 % igem Ethanol auf Feld und wischen Sie es.

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Ergebnisse

In die Zylinder-Test wurde die Abnahme der Hinterreifen gegen die Wand beobachtet bei Mäusen (Gruppe 2) mit MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und am 8. Tag verglichen mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen (Gruppe 1), Kochsalzlösung behandelt, während eine Erhöhung der Hinterreifen in den Mäusen (Gruppe 3) behandelt mit MP beobachtet wurde TP von Tag 1 bis Tag 7 und l-Dopa am 8. Tag im Vergleich zu den Mäusen (Gruppe 2) mit MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und saline am Tag 8 (Abbildun...

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Diskussion

Aufgrund der Zerstörung von dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra des Gehirns verursacht MPTP Parkinson-ähnliche Symptome in Mäusen7. L-Dopa ist das am meisten bevorzugte Medikament für PD seit seiner klinischen Verwendung, weil es hilft bei der Aufrechterhaltung der normaler täglicher Aktivitäten bei Patienten mit Parkinson, mit wirksamen Unterdrückung der motorischen Auffälligkeiten einschließlich Bewegungsarmut und Steifheit15. Die Mäuse behandelt mit MPTP zeigte...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Unsere Arbeit wird von Tianjin Undergraduate Trainingsprogramme für Innovation und Entrepreneurship (Grant Nr. 63183004) finanziert. Dieses Projekt wurde in der State Key Labor Arzneimittel chemische Biologie an der Nankai Universität initiiert. Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
70% EthanolRuiboxing CompanyRBX-64175
KameraBASLERacA645-100gm
ZylindertestHergestellt im eigenen Haus an der Nankai UniversityN/A
ExcelMicrosoftN/A
LevodopaSigma-Aldrich72816
Matalb 2017aMathworksN/A
Mäuse Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der WissenschaftenBalb/cErwachsene weibliche Mäuse (10 Wochen)
MPTPYuanye Biological Technology Company Ltd., ShanghaiS31504-500mg
FreilandtestHergestellt im eigenen Haus an der Nankai UniversitätN/A
SpritzeSolelybioS-xsgwz-w
SpülspritzeJiangxi Fenglin Medical Anwendung Co.hc3824Intraperitoneale Injektion
KG

Referenzen

  1. Dehay, B., Bourdenx, M., Gorry, P., Przedborski, S., Vila, M., Hunot, S., Singleton, A., Olanow, C. W., Merchant, K. M., Bezard, E. Targeting -synuclein for treatment of Parkinson's disease: mechanistic and therapeutic considerations. Lancet Neurology. 14, 855-866 (2015).
  2. Weintraub, D., Comella, C., Horn, L., S, Parkinson's disease - Part 1: Pathophysiology, symptoms, burden, diagnosis, and assessment. American Journal of Managed Care. 14, 40-48 (2008).
  3. Ismaiel, A. A., et al. Metformin, besides exhibiting strong in vivo anti-inflammatory properties, increases mptp-induced damage to the nigrostriatal dopaminergic system. Toxicology and Applied Pharmacology. , 19-30 (2016).
  4. Bayliss, J. A., et al. Ghrelin-AMPK signaling mediates the neuroprotective effects of calorie restriction in Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 36, 3049-3063 (2016).
  5. Olanow, C. W., Stern, M. B., Sethi, K. The scientific and clinical basis for the treatment of Parkinson disease. Neurology. 72 (21 Supplement 4), (2009).
  6. Chiba, K., Trevor, A., Castagnoli, N. Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain monoamine oxidase. Biochemical & Biophysical Research Communications. 120 (2), 574-578 (1984).
  7. Bakay, R. A., et al. Biochemical and behavioral correction of MPTP parkinson-like syndrome by fetal cell transplantation. Annals of the New York Academy of Sciences. 495 (1), 623-638 (2010).
  8. Kelly, P. H., Seviour, P. W., Iversen, S. D. Amphetamine and apomorphine responses in the rat following 6-OHDA lesions of the nucleus accumbenssepti and corpus striatum. Brain Research. 94 (3), 507-522 (1975).
  9. Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
  10. Katila, N., et al. Metformin lowers α-synuclein phosphorylation and upregulates neurotrophic factor in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 125, (2017).
  11. Goldberg, N. R. S., Haack, A. K., Lim, N. S., Janson, O. K., Meshul, C. K. Dopaminergic and behavioral correlates of progressive lesioning of the nigrostriatal pathway with MPTP. Neuroscience. 180, 256-271 (2011).
  12. Schwarting, R. K., Sedelis, M., Hofele, K., Auburger, G. W., Huston, J. P. Strain-dependent recovery of open-field behavior and striatal dopamine deficiency in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Neurotoxicity Research. 1 (1), 41(1999).
  13. Shiguang, S., et al. The open field test as a method for ethology in Kunming mice: test-retest reliability. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science. 19 (12), 1093-1095 (2010).
  14. Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-Dragging: a Novel, Sensitive Analysis of the Mouse Cylinder Test. Journal of Visualized Experiments. (98), e52701(2015).
  15. Cotzias, G. C., Van Woert, M. H., Schiffer, L. M. Aromatic amino acids and modification of Parkinsonism. New England Journal of Medicine. 282, 31-33 (1967).
  16. Cassady, J. C., Johnson, R. E. Cognitive test anxiety and academic performance. Contemporary Educational Psychology. 27 (2), 270-295 (2002).
  17. Rogalewski, A., et al. Semaphorin 6A improves functional recovery in conjunction with motor training after cerebral ischemia. Plos One. 5 (5), 0010737(2010).
  18. Chen, W., Qiao, D., Liu, X., Shi, K. Treadmill exercise improves motor dysfunction and hyperactivity of the corticostriatal glutamatergic pathway in rats with 6-ohda-induced parkinson's disease. Neural Plasticity. 2017, 2583910(2018).
  19. Colas-Zelin, D., et al. The imposition of, but not the propensity for, social subordination impairs exploratory behaviors and general cognitive abilities. Behavioural Brain Research. 232 (1), 294-305 (2012).
  20. Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
  21. Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. American Journal of Psychology. 83, 103-111 (1970).
  22. Tatem, K. S., et al. Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51785(2014).

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